KR102016909B1 - 소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소라(특히 제주산 소라) 유래의 펩타이드 분말을 포함하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 소라 유래 펩타이드 분말은 피부 미백 및 주름개선 효과가 현저히 향상되는 효과가 있다.

Description

소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for whitening and anti-wrinkle containing Batillus cornutus derived peptide powder}

본 발명은 소라(특히 제주산 소라) 유래의 펩타이드 분말을 포함하는 미백 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

생체에서 표면적이 가장 큰 기관인 피부 내에 존재하는 멜라닌은 피부의 색상을 변화시키는 주요한 생물학적 색소로서 작용한다. 피부 기저층에는 존재하는 멜라노사이트에서 멜라노좀과 멜라닌이 생성되는데 멜라닌은 멜라노좀이라는 새포에 의해 만들어진다. 피부의 멜라닌 생합성에는 다양한 기전들이 연관되어 있는데 그 중에서도 자외선에 의한 자극으로 p53유전자가 만들어 내는 알파-멜라노사이트-조절호르몬에 의한 조절과, 이 호르몬에 의해 증가된 마이크로프탈미아 연합 전이 요소(MITF)가 멜라노좀 안에 존재하는 타이로시네이즈의 활성화를 촉진하고, 활성화된 타이로시네이즈에 의해 DOPA의 하이드록실레이션 과정이 개시되며, 타이로시네이즈 하위 단백질들인 TRP1과 TRP2에 의해 멜라닌 생합성을 촉진 및 조절하게 된다. 최종 산물인 멜라닌은 표피 세포 안으로 들어가 자외선과 같은 피부 자극 물질로부터 피부세포를 보호하는 역할을 수행하게 된다. 그러나 멜라닌 합성의 과다 촉진은 피부에 과색소 침착과 염증성 침착과 같은 기전을 일으키게 된다.

현재 피부 미백에 대해 알부틴(Arbutin)과 누룩산(Kojic acid)이 효과적으로 알려져 있는 대표적인 물질이다. 그러나 알부틴은 하이드로퀴논(Hydroquinone)기로 인해 멜라노사이트에 대한 독성이 있는 것으로 알려져 있고 누룩산(Kojic acid)의 경우 2.5%의 농도에서 피부염을 유발시키는 것으로 밝혀졌으며(Nakagawa Met, 1995), 1%의 농도에서도 색소접촉 피부염을 발생시킨다는 논문이 발표되었다(Juan Garcia-Gavin et, 2010). 이러한 피부독성과 부작용으로 인해 미백효과를 기대하는 물질들은 사용이 어려운 경우가 많다. 따라서, 최근에는 피부에 자극을 최소화하면서 우수한 미백효과를 기대할 수 있는 연구가 천연물에서 유래한 추출물 또는 정제된 미백물질을 중심으로 이루어지고 있다.

피부는 외부 환경으로부터 몸을 보호하여 체내 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 끊임없는 외부의 여러 자극과 자체 대사과정 등에서 생기는 불필요한 대사산물(metabolite)에 의해 피부 기능은 저하되고 노화 현상이 촉진된다. 주름생성에 대한 원인으로 여러 가지가 보고되고 있는데, 우선 피부가 과다한 자외선에 노출되면 피부 구성성분인 콜라겐(collahen)분해가 촉진되어 피부가 탄력을 읽고 주름이 생성될 수 있다. 피부 내 콜라겐은 피부 섬유아세포에서 생성되는 구조 단백질로 노화에 의한 생성 감소 및 해당 구조의 변화는 피부의 주름 형성과 관련이 있다고 알려져 있다.그러므로 피부 내 콜라겐 생성, 멜라닌 색소 억제, 각질 줄기세포 생장에 관련된 체내 항상성은 피부의 건강 및 미용에 영향을 주는 밀접한 인자로써 이에 대한 기능과 유효 소재 발굴을 위한 연구는 여전히 활발히 진행되고 있으나, 표면에 도포하는 외용적 처치 소재의 유효성은 표피 및 진피를 통과해야 하는 기술적 어려움으로 인해 많은 노력이 요구된다.

소라(Batillus cornutus)는 연체동물 소라과에 속하는 종으로, 일본, 중국, 우리나라등에 주로 분포를 하며, 조간대 암반지역에 서식하다가 성장을 하면서 수심 20m 내외의 암초지역에 분포 한다. 소라는 파도 등 해류의 영향에 따라 무뿔소라와 뿔소라 형태로 나타나며, 남해안과 울릉도까지 분포를 하지만 대부분 제주도 주변에 분포를 한다. 소라는 깊은곳에서 각고 12cm 이상 개체도 발견되지만 대체적으로 6-10cm급에서 주요 산란급으로 이루어지며 피채는 간조시 노출되는 조간대에서 서식하며 점차 성장하면서 깊은곳으로 이동한다. 제주도산 소라(Turbo cornutus Solander)는 식용으로 가치가 높으며 1970년대 이후 주요 수출품목으로 자리 메김 함으로써 해녀에 있어서는 최고의 소득품종으로 알려져 있다. 칼슘, 철분, 인 등의 미네랄과 비타민 A를 함유하고 있는 고단백 식품으로서 알려진 소라를 이미용 원료로 사용하기 위하여 연구를 진행하였다. 건조된 소라(원물)에 배양된 균을 직접 접종하는 방법을 사용하였을 때 발효에 사용되는 미생물은 최종 화장료 조성물에서 배양되어 악영향을 끼칠 수 있으며, 잔류된 배양액 성분이 혼합되어, 의도치 않은 영향을 미칠 수 있다는 단점을 가지고 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 미생물에서 추출된 효소를 이용하여 고분자의 펩타이드를 저분자화 시키는 가수분해를 하기 위한 방법을 발굴하여 미백 및 주름개선에 효과적인 다기능성 펩타이드 소재를 발굴 하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 10-2017-0016408 한국공개특허 10-2017-0061800

본 발명의 목적은 소라(Batillus cornutus) 유래 펩타이드를 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 소라 유래 펩타이드 분말의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 소라(Batillus cornutus) 유래 펩타이드를 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 소라육을 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 건조된 소라육을 20-100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);

상기 단계 2의 소라육 100 중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후, 1.4-1.6 atm, 100-120℃ 에서 30-40분간 자숙하는 단계(단계 3);

상기 단계 3의 소라육 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-50℃에서 발효 후, 80-90℃에서 10-20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및

상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5);

를 포함하는 소라 유래 펩타이드 분말의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 소라 유래 펩타이드 분말은 피부 미백 및 주름개선 효과가 현저히 향상되는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 제주산 소라 유래 펩타이드의 아미노산 서열을 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

소라 유래 펩타이드를 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물

본 발명은 소라(Batillus cornutus) 유래 펩타이드를 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 소라는 제주산 소라(Turbo cornutus Solander)를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물의 유효성분은 바람직하게 소라 유래 펩타이드를 사용할 수 있으나, 이외에도 소라 추출물 역시 사용할 수 있다.

소라 유래 펩타이드 분말 제조방법

본 발명은 소라육을 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 건조된 소라육을 20-100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);

상기 단계 2의 소라육 100 중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후, 1.4-1.6 atm, 100-120℃ 에서 30-40분간 자숙하는 단계(단계 3);

상기 단계 3의 소라육 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-50℃에서 발효 후, 80-90℃에서 10-20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및

상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5);

를 포함하는 소라 유래 펩타이드 분말의 제조방법을 제공한다.

바람직하게, 상기 소라는 제주산 소라(Turbo cornutus Solander)를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 소라를 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계이다. 바람직하게는 60℃에서 24시간 건조할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 건조된 소라를 20-100 mesh로 분쇄하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2의 소라 100중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후 100-120℃ 에서 30-40분간 자숙하는 단계이다. 바람직하게 자숙온도는 104-116℃에서 자숙시간은 31-39분간 자숙할 수 있고, 더욱 바람직하게는 105-115℃에서 32-38분간 자숙할 수 있다. 자숙온도가 100℃ 미만이거나 120℃를 초과할 경우 정제수에 용해되는 단백질의 함량이 낮아지고, 또한 자숙시간이 30분 미만이거나 40분을 초과할 경우 정제수에 용해되는 단백질의 함량이 낮아지는 문제가 있을 수 있다.

본 발명에 따른 자숙 조건에서 소라 유래 단백질이 정제수에 높은 비율로 용해될 수 있으며, 단백질이 용해될수록 이후 발효(가수분해)단계에서 전체 단백질 함량 대비하여 생성되는 펩타이드의 함량이 높아지는 효과가 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 4는 소라 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-45℃에서 발효 후 50-80℃에서 10-20분간 효소를 비활성화하는 단계이다.

상기 가수분해원은 바람직하게 소라 자숙물 1000 중량부에 가수분해원 5 중량부로 혼합할 수 있으며, 가수분해원은 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물 또는 단백질 가수분해 효소인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물은 바실러스 서브틸러스(bacillus subtilis) 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 단백질 가수분해 효소는 메탈로펩티다아제, 메탈로프로테아제 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 썰모라이신(Thermolysin: EC 3.4.24.27. Bacillus thermoproteolyticus가 생산하는 미생물유래 단백질 분해효소)을 사용할 수 있다.

또한, 상기 비활성화 하는 단계는 바람직하게 80℃에서 15분간 효소를 비활성화 할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 5는 상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계이다. 바람직하게는 상기 단계 4의 발효 후 3,000rpm으로 원심분리할 수 있다.

소라 유래 펩타이드 분말

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 제공한다.

본 발명에 따른 소라 유래 펩타이드 분말은 피부 미백 및 주름개선 효능이 현저히 우수한 효과가 있다.

본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물

본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "미백"이란 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시키는 것을 말한다. 피부의 과다 색소 침착은 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색 반점 또는 검버섯 등을 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물은 상기 소라 자숙분말 총 중량에 대하여 0.0001~90 중량부의 양으로 함유할 수 있으나, 바람직한 미백 및 주름개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "유효량"이란 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시킬 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기 화합물의 유효량은 피부 미백용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 피부 미백용 조성물이 피부의 과다 색소 침착에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 상기 소라 자숙분말을 포함할 수 있을 것이다. 화장품으로 제품화되는 경우에 있어서도 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 화합물을 포함할 수 있을 것이다. 반면 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 소라 자숙분말을 포함해도 무방할 것이다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 피부 외용제의 제형인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제 제형의 하나의 바람직한 형태는 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 파운데이션, 선스크린, 비누, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 에센스, 클렌저, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 바람직하게는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 바이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있으며, 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

본 발명의 조성물은 액제, 에어로졸제, 멸균 주사용액 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 제주산 소라(Turbo cornutus Solander ) 유래 펩타이드의 제조

단계 1: 제주산 소라의 패각 및 내장을 제거한 후 정제수로 1회 수세한 후 60℃에서 제주산 소라육을 24시간 건조 시킨다.

단계 2: 단계 1 후에 그라인더를 이용해 20~100mesh로 분쇄한다.

단계 3: 분쇄된 제주산 소라 분말 100g과 정제수 900ml을 혼합하여 110℃에서 35분간 밀폐된 고압(1.5atm) 고온의 용기내에서 가온하여 자숙한다.

단계 4: 자숙된 제주산 소라육(제주산 소라육 100g + 정제수 900ml)을 35℃까지 냉각한 후 온도를 유지하며, 서몰리신(Thermolysin) 5g을 첨가한 후 4시간 동안 150rpm으로 교반하여 제주산 소라육의 단백질들을 가수분해하여 펩타이드화 한다.

단계 5: 효소에 의해 가수분해(발효)가 완료된 가수분해물은 3,000rpm으로 원심분리하여 정제수에 용해되지 않는 제주산 소라육 및 이물질들을 제거한다. 회수된 상등액은 감압농축 및 동결건조를 통해 분말화 하여 제주산 소라육 자숙분말을 제조하였다.

< 비교예 1> 자숙과정 제외

상기 실시예 1의 단계 3의 자숙과정을 제외한 나머지는 동일하게 하여 비교예 1을 제조하였다.

< 실험예 1> 자숙온도 및 자숙시간에 따른 단백질 함량 비교

자숙 공정은 정제수와 제주산 소라 분말이 혼합되어 있는 용액 내 단백질 함량을 높여 이후의 발효 공정의 효율을 높이고자 실시하는 공정이다. 이러한 자숙공정의 조건을 위해 온도별, 시간별 자숙조건에 따른 용액내 단백질 함량을 비교하였다.

단백질 함량은 Lowry assay를 이용하여 분석하였으며, Lowry assay는 구리이온이 단백질 또는 펩타이드의 Peptide bond에 결합하는 원리를 이용하였다. 각 시료들은 온도 및 시간별로 자숙공정을 거친 뒤 3,000rpm에서 20분간 원심분리를 실시하였으며, 상등액을 취하여 시험에 이용하였다. Lowry 시약과 30초간 혼합한 후 실온에서 10분간 반응을 유도하였다. 이후 Folin-Ciocalteu 용액을 첨가하여 30초간 교반한 후 30분간 실온에서 발색을 유도한후 750nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정결과는 자숙공정을 수행하지 않은 제주산 소라 분말과 정제수 혼합액을 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 회수한 상등액에 함유되어 있는 단백질 함량을 대조군(Control)로 하였다.

온도에 따른 자숙조건 비교는 100℃ 에서 145℃까지 5℃의 온도 차이를 두고 10분간 자숙을 실시하였다.

자숙온도	단백질 함량(%)
Control (비교예 1)	100
100℃	102.3
105℃	125.4
110℃	129.5
115℃	124.9
120℃	109.4
125℃	107.4
130℃	105.3
135℃	102.7
140℃	101.6
145℃	100.5

그 결과 상기 표 1에서와 같이 110℃에서 가장 높은 단백질 함량이 측정되었으며, 이에 따라 하기에서는 110℃에서 자숙시간에 따른 단백질 함량을 비교 하였다.

자숙시간	단백질 함량 (%)
Control (비교예 1)	100
5 min	103.4
8 min	105.6
12 min	106.3
15 min	106.7
20 min	106.5
25 min	107.8
30 min	109.1
32 min	127.9
35 min	128.4
38 min	126.1
40 min	108.6

자숙시간에 따른 단백질 함량의 경우 35분에서 가장 높은 단백질 함유량을 나타내었으며, 이에 따라 자숙조건을 110℃, 35분으로 결정하였다.

< 실험예 2> 자숙유무 및 자숙온도에 따른 최종 산물 비교

앞서 자숙공정 조건 설정이 최종 가수분해에 영향을 미치는지 확인하기 위해 실시예 1에 따른 공정을 실시하였으며, 상기 실험예 1에서 진행한 결과와의 유의성을 확인하기 위한 목적으로 진행되었다. 펩타이드 전환율 비교는 최종 공정 이후 분말화된 시료내 펩타이드함량/단백질 함량으로 계산하였다. 이중 단백질 함량은 시료 1mg을 1ml의 용액에 용해시켜 측정하였으며, 펩타이드 함량은 시료 1mg을 1ml의 10%의 TCA(Trichloracetic acid)용액을 이용하여 용해된 펩타이드 함량을 측정하였다. 측정방법은 Lowry assay를 이용하여 측정하였다. 이 결과를 바탕으로 최종시료 내의 펩타이드 함유량을 확인 하였다.

수득율은 최초 사용된 홍해삼 분말을 기준으로 하여 홍해삼 자숙 분말재의 무게비로 비교하였다.

시료	Control (비교예 1)	100℃	110℃	120℃
펩타이드전환율	54%	84%	97%	78%
최종 시료내 총 펩타이드 함량	32%	35%	40%	27%
수득율	36.85%	37.54%	41.2%	38.14%

상기 표 3에서와 같이, 자숙 조건을 110℃로 할 경우 펩타이드 전환율, 최종 시료 내 펩타이드 함량 및 수득율이 가장 높은 것을 알수 있다.

< 실험예 3> 자숙유무에 따른 미백활성 비교

상기 실험예 1을 통한 자숙조건의 최적화 이후 자숙의 유무에 따른 미백활성을 검토하고자 본 실험을 실시하였다. 멜라닌은 피부내 멜라닌형성세포에서 자외선 및 다양한 자극에 의해 생성되며, 피부를 검게하는 원인이 된다. 미백활성을 확인하기 위해 상기 실시예 1에 따라 만들어진 제주산 소라 자숙 분말의 멜라닌 형성세포(B16F10)에 처리하여 멜라닌 형성세포내,외의 멜라닌 생성양을 측정하는 방법을 이용하였다.

비교 방법은 B16F10 세포를 96 well plate에 적정량의 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 200nM α-MSH를 72시간 처리하여 멜라닌 형성을 유도한 후 배지에 녹인 시료와 배양 후 세포 외 멜라닌을 측정하기 위해 배지를 새로운 96 well plate로 옮긴 후 490nm에서 흡광도를 확인하였다. 그리고 배양액이 제거된 세포에 1N NaOH를 150ul를 첨가해 세포를 용해시킨 뒤 원심분리 후 1N NaOH에 용해된 멜라닌의 함량을 490nm에서 흡광도를 통해 확인하였다. 활성은 아래의 공식을 이용하여 계산하였다.

멜라닌 활성(%)=(시료를 첨가한 것의 흡광도 / 시료를 첨가하지 않은 것의 흡광도) x 100

MSH만을 처리한 대조군(Control)의 생성량을 100%로 하여 비교하였다.

	실시예 1	Control	50ppm	100ppm	200ppm	400ppm
실시예 1	세포외	100%	67.4	59.9	56.4	51.0
	세포내	100%	87.9	86.5	85.4	82.5
비교예 1	세포외	100%	74.5	67.4	66.9	58.2
	세포내	100%	91.9	91.5	91.2	90.1

< 실험예 4> 자숙유무에 따른 주름개선 활성비교

콜라겐은 세포 내에서 프로콜라겐으로 합성된 후, 세포 외로 분비되어 콜라겐 섬유로 중합된다. 이러한 콜라겐은 피부를 구성하는 구조단백질로서 콜라겐의 피부내 함유량이 높을 경우, 콜라겐 분해효소의 활성이 낮을 경우 피부의 주름이 개선된다. 이러한 콜라겐의 측정방법은 인간 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)를 이용하여 세포외로 분비되는 인간 프로콜라겐 타입 I C-말단 펩타이드(PIP)를 Procollagen Type I C-Peptide(PIP) EIA kit 방법으로 정량하여 콜라겐 생성량을 확인하였다.

대조군으로 본 발명의 실시예 1에 따른 제조방법 중 자숙을 제외한 시료(비교예 1)를 비교하였다.

	25ppm	50ppm	100ppm	200ppm	400ppm
실시예 1	117.9	128.2	132.3	127.2	115.6
비교예 1	96.8	95.8	97.8	93.7	86.0

상기 표 5에서와 같이, 비교예 1보다 본 발명에 따른 실시예 1에서 보다 높은 주름개선활성을 나타나는 것을 확인할 수 있다. 또한, 100 ppm 농도로 시료를 처리할 경우 주름개선 활성 효과가 가장 우수한 것을 알 수 있었다.

< 실험예 5> 자숙유무에 따른 세포독성 비교

활성을 가지는 농도에서 독성의 유무를 확인하기 위해 살아있는 세포내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 Formazan을 형성하는 MTT(3-(4,5-dimethyl-thoazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 처리하여 세포 생존율을 비교하였다. 본 발명의 제주산 소라 자숙 분말의 자숙 조건에 따른 세포생존율을 비교하였다. 자숙공정을 제외한 나머지과정은 동일하게 제조한 제주산 소라 유래 펩타이드 분말(비교예 1)을 대조군으로 사용하였다.

실험방법은 B16F10 세포를 96 well plate에 적정량의 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 배지로 녹인 시료를 24시간 처리하였다. 배양 후 5mg/mL MTT용액을 100ul 처리한 후 배양조건에서 2시간 반응하였다. 2시간 후 배양액를 제거하고 세포 내 활성 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 형성된 formazan을 DMSO로 녹여 570nm에서 흡광도 값을 바탕으로 세포생존율을 확인하였다. 세포 생존율은 아래의 공식에 따라 계산하였다.

세포생존율(%)=(시료를 첨가한 것의 흡광도 / 시료를 첨가하지 않은 것의 흡광도) x 100.

그 결과, 하기 표 5에서와 같이 자숙 유무에 따라 세포생존율이 90%이상으로 독성이 없는 것으로 판단되는 농도가 자숙하지 않은 군에서는 200ppm 이나, 자숙공정이 포함되었을 경우 800ppm이 된다. 이는 동일농도 800ppm에서 세포생존율이 약 15%증가되는 것으로 확인된다.

	25ppm	50ppm	100ppm	200ppm	400ppm
실시예 1	107.3	105.9	100.7	99.2	96.6
비교예 1	102.4	101.1	98.6	96.6	95.5

< 실험예 6> 펩타이드 서열 확인

상기 실시예 1에 따른 분말형태의 제주산 소라 유래 펩타이드를 정제수에 용해시킨 다음 5배의 Acetonitrile을 첨가하여 냉온에서 반응한 후 12,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 회수한다. 회수된 상등액을 진공건조를 통해 분말화 한 뒤 정제수에 녹인 뒤 액체크로마토그래피 분석법을 이용하여 분석한다. 분석은 MS/MS를 이용하여 각 펩타이드 Fragment의 분자량을 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다.

그 결과 Leu-Gly으로 시작되는 펩타이드가 주성으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다(도 1참조).

화장료의 제조예

본 발명에 따른 상기 제주산 소라 유래 펩타이드는 목적에 따라 여러 형태의 화장료로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 제주산 소라 유래 펩타이드를 활성성분으로 함유시킨 몇몇 화장료의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<화장료 제조예 1> 유연 화장수의 제조

소라 유래 펩타이드 10.0 중량부

1,3-부틸렌글리콜 1.00 중량부

디소듐이디티에이 0.05 중량부

알란토인 0.10 중량부

디포타슘글리시리제이트 0.05 중량부

시트르산 0.01 중량부

소듐시트레이트 0.02 중량부

글리세레스-26 1.00 중량부

알부틴 2.00 중량부

하이드로제네이티드캐스터오일 1.00 중량부

에탄올 30.0 중량부

보존제 미량

착색제 미량

착향제 미량

정제수 잔량

<화장료 제조예 2> 영양 크림의 제조

소라 유래 펩타이드 10.0 중량부

1,3-부틸렌글리콜 7.00 중량부

글리세린 1.00 중량부

D-판테놀 0.10 중량부

식물 추출물 3.20 중량부

마그네슘알루미늄실리케이트 0.30 중량부

PEG-40 스테아레이트 1.20 중량부

스테아르산 2.00 중량부

폴리소르베이트 60 1.50 중량부

친유형글리세릴스테아레이트 2.00 중량부

소르비탄세스퀴올리에이트 1.50 중량부

세테아릴알코올 3.00 중량부

미네랄오일 4.00 중량부

스쿠알란 3.80 중량부

카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.80 중량부

식물성오일 1.80 중량부

디메치콘 0.40 중량부

디포슘글리시리제이트 미량

알란토인 미량

소듐 히아루로네이트 미량

토코페릴아세테이트 적량

트리에탄올아민 적량

보존제 적량

착향제 적량

정제수 잔량

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 소라육을 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계(단계 1);
   상기 단계 1의 건조된 소라육을 20-100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);
   상기 단계 2의 소라육 100 중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후, 1.4-1.6 atm, 105-115℃ 에서 32-38분간 자숙하는 단계(단계 3);
   상기 단계 3의 소라육 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-50℃에서 발효 후, 80-90℃에서 10-20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및
   상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5);
   를 포함하는 소라 유래 펩타이드 분말의 제조방법.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 3항에 있어서,
   상기 단계 4의 가수분해원은 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물 또는 단백질 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물은 바실러스 서브틸러스(bacillus subtilis)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
8. 제 6항에 있어서,
   상기 단백질 가수분해 효소는 메탈로펩티다아제 및 메탈로프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 단백질 가수분해 효소는 썰모라이신(Thermolysin: EC 3.4.24.27. Bacillus thermoproteolyticus가 생산하는 미생물유래 단백질 분해효소)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
10. 제 3항에 있어서,
    상기 소라는 제주산 소라인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    
11. 제 3항 및 제6-10항 중 어느 한 항에 따라 제조된 소라 유래 펩타이드 분말.
    
12. 제 11항에 있어서,
    상기 소라 유래 펩타이드 분말은 피부 미백 및 주름개선 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 소라 유래 펩타이드 분말.
    
13. 제11항의 소라 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
    
14. 제 13항에 있어서,
    상기 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크 로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조된 것을 특징으로 하는 조성물.

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