KR102082613B1 - 제주산 3종 식물 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

제주산 3종 식물 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 기능성 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제주산 식물 3종(동백, 땅콩 및 비자) 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 동백오일, 땅콩오일 및 비자오일 복합물 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함함에 따라, MMP-1 생성 및 경피수분손실을 억제하고, 피부 수분량을 증가시키는 보습 효과가 있으므로, 피부장벽 강화 또는 보호용 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하다.

Description

제주산 3종 식물 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 기능성 화장료 조성물{Functional cosmetic composition comprising pseudoceramide complex derived from Jeju plant and Turbo peptide}
제주산 3종 식물(동백, 땅콩, 비자) 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동백씨앗, 우도땅콩 및 비자씨앗 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 피부장벽 강화 또는 보호용 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피 (dermis), 피하지방 (subcutis)의 3개의 층으로 구성되어 있는데, 이중 표피는 가장 외부에 존재함으로서 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 피부미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있다. 표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질이다. 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하며 유해물질로부터 피부를 보호, 체내 물질의 유출 방지 및 피부 수분 증발을 방지하는 중요한 기능을 한다.
피부지질은 각질세포(corneocytes)간의 공간을 채우고 있으며 주로 세라마이드(40~65%), 콜레스테롤(10%) 및 유리지방산(25%)으로 구성되어 있으며 소량의 파이토스핑고신 (phytosphingosine), 스핑고신 (sphingosine)이 함께 존재한다(Human Skin-identical Ceramides 2000; 한국미용학회지, 2002). 이러한 지질들은 각질세포 사이에 존재하여 수분의 증발을 방지하고, 외부 자극이나 오염으로부터 피부를 보호하는 피부장벽의 기능을 수행한다. 이중 세라마이드는 피부지질의 주성분으로서 함량이 감소하게 되면, 수분증발이 증가하고 아토피 등 다양한 피부질환이 악화되며 피부의 노화가 진행되지만 외부로부터 세라마이드를 보충하면 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 피부세포의 결합 조직을 구성하는 성분 중 collagen은 피부건조중량의 70 ~ 80 % 정도를 차지하는 주요 구성 단백질이다.　따라서 collagen의 분해는 결합조직의 탄력저하와 주름생성 등에 직접적인 영향을 미친다. 채내에서 생성되는 수종의 matrix metalloprotease (MMP)들 가운데 MMP-1은 collagen에 특이적으로 작용하는 protease로서 MMP-1 활성을 억제하면 collagen의 분해를 감소시키며 피부조직의 탄력을 유지하고 주름생성을 예방할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은, 땅콩오일 및 비자오일 복합물 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 개발하였으며, 상기 유사 세라마이드 및 소라 펩타이드 배합에 따른 MMP-1 생성 및 경피수분손실을 억제하고, 피부 수분량을 증가시키는 효과에 대한 상승효과가 있음을 확인하여, 상기 화장료 조성물을 피부장벽 강화 또는 보호 및 주름개선 용도로 사용할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1934976호
본 발명의 목적은 동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라펩타이드를 포함하는 피부장벽 강화 또는 보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라펩타이드를 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 총 화장료 조성물 100 부피부 기준,
동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 0.05-2.0 중량부; 및
소라 펩타이드 0.001-0.02 중량부;를 포함하는 피부장벽 강화 또는 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 총 화장료 조성물 100 부피부 기준,
동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 0.05-2.0 중량부; 및
소라 펩타이드 0.001-0.02 중량부;를 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 동백오일, 땅콩오일 및 비자오일 복합물 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함함에 따라, MMP-1 생성 및 경피수분손실을 억제하고, 피부 수분량을 증가시키는 보습 효과가 있으므로, 피부장벽 강화 또는 보호용 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하다.
도 1은 동백씨앗, 우도땅콩, 비자씨앗 착유 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 천연오일(중성지방)로부터 유사세라마이드를 제조하는 2단계 효소 반응 과정을 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 천연오일로부터 2단계 효소 반응을 통한 유사세라마이드 제조 공정도이다.
도 4는 제주산 3종 복합오일(땅콩오일, 동백오일, 비자오일)로부터 유사세라마이드 복합체를 제조한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 4의 화장료(Test) 및 대조화장료(Control)에 대하여 사용성에 관한 비교 감각 프로파일(Comparative sensorial profile)이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물
본 발명은 총 화장료 조성물 100 부피부 기준,
동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 0.05-2.0 중량부; 및
소라 펩타이드 0.001-0.02 중량부;를 포함하는 피부장벽 강화 또는 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 총 화장료 조성물 100 부피부 기준,
동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 0.05-2.0 중량부; 및
소라 펩타이드 0.001-0.02 중량부;를 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "우도땅콩"은 한국 우도에서 재배된 땅콩을 의미한다. 땅콩(Arachis hypogaea L., Peanut)은 콩과 땅콩속(Arachis)의 1년생 초본성이다. 열대원산의 고온성 여름작물로서, 한국, 인도, 중국, 미국, 아프리카, 인도네시아, 미얀마, 태국 등지에 분포하고 있다. 가지가 곧게 서는 직립형, 지면 가까이 옆으로 퍼지는 포복형 그리고 반직립형으로 분류된다. 종실의 기름함량은 일반적으로 생육온도가 높을수록 증가하는 경향이 있다.
본 발명에서 "동백(Camellia japonica L., Camellia oil)"은 바닷가에 자라는 상록활엽 소교목이다. 한국, 중국, 일본 등지에 분포하고 있다. 동백은 꽃이 질 때 송이 째 떨어지는 특징을 지니며 꽃은 차로 이용한다. 과거에는 열매에서 기름을 짜서 동백기름이라 하여 머리를 치장하는데 귀한 재료로 쓰였다.
본 발명에서 "비자"는 겉씨식물 구과목 주목과의 상록교목인 비자나무(Torreya nucifera, Torreya)의 열매로, 가을에 익은 열매를 따서 껍질을 벗겨 버리고 햇볕에 말려 사용한다. 비자는 맛은 달고 성질은 평하며, 기생충을 구제하고 대변이 잘 나오게 하며 기침을 멎게 하는 것으로 알려져 있다. 비자나무의 목재는 질이 좋기 때문에 각종 기구재, 특히 바둑판으로서 귀중한 재목이다. 기름을 짜서 식용하며, 공해에 강하므로 가로수로 적합하다. 한국(내장산), 일본 등지에 분포한다.
본 발명에서 "소라(Batillus cornutus)"는 연체동물 소라과에 속하는 종으로, 일본, 중국, 우리나라등에 주로 분포를 하며, 조간대 암반지역에 서식하다가 성장을 하면서 수심 20m 내외의 암초지역에 분포 한다. 소라는 파도 등 해류의 영향에 따라 무뿔소라와 뿔소라 형태로 나타나며, 남해안과 울릉도까지 분포를 하지만 대부분 제주도 주변에 분포를 한다. 소라는 깊은곳에서 각고 12cm 이상 개체도 발견되지만 대체적으로 6-10cm급에서 주요 산란급으로 이루어지며 피채는 간조시 노출되는 조간대에서 서식하며 점차 성장하면서 깊은곳으로 이동한다. 제주도산 소라(Turbo cornutus Solander)는 식용으로 가치가 높으며 1970년대 이후 주요 수출품목으로 자리 메김 함으로써 해녀에 있어서는 최고의 소득품종으로 알려져 있다. 칼슘, 철분, 인 등의 미네랄과 비타민 A를 함유하고 있는 고단백 식품으로서 알려진 소라를 이미용 원료로 사용하기 위하여 연구를 진행하였다. 건조된 소라(원물)에 배양된 균을 직접 접종하는 방법을 사용하였을 때 발효에 사용되는 미생물은 최종 화장료 조성물에서 배양되어 악영향을 끼칠 수 있으며, 잔류된 배양액 성분이 혼합되어, 의도치 않은 영향을 미칠 수 있다는 단점을 가지고 있다.
바람직하게, 상기 동백, 땅콩 및 비자는 제주산인 것을 사용할 수 있다.
이때, 상기 동백 및 비자는 각각 씨앗을 사용하는 것일 수 있다.
바람직하게, 상기 소라는 제주산인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 바람직하게, 상기 유사 세라마이드 복합체 0.25-2.0 중량부; 및 상기 소라 펩타이드 0.001-0.1 중량부; 포함하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 유사 세라마이드 복합체 0.5-1.5 중량부; 및 소라 펩타이드 0.002-0.008 중량부; 포함하는 것일 수 있고, 상기 범위로 포함할 경우, 상기 유사 세라마이드 또는 상기 소라 펩타이드를 단독으로 포함하는 경우보다 피부장벽 강화 또는 보호 효과 및 피부 주름 개선 효과가 향상되는 효과가 있다. 보다 더 바람직하게는 유사 세라마이드 복합체 0.8-1.2 중량부; 및 소라 펩타이드 0.004-0.006 중량부; 포함하는 것일 수 있고, 상기 범위로 포함할 경우, 상기 유사 세라마이드 또는 상기 소라 펩타이드를 단독으로 포함하는 경우보다 피부장벽 강화 또는 보호 효과 및 피부 주름 개선 효과가 현저히 향상되는 상승효과가 나타날 수 있다(실험예 ). 상기 유사 세라마이드 복합체 0.9-1.1 중량부; 및 소라 펩타이드 0.0045-0.0055 중량부; 포함하는 것이 가장 바람직한 것일 수 있고, 상기 범위로 포함할 경우, 상기의 효과가 가장 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 유사 세라마이드 복합체는 상기 동백, 땅콩 및 비자 유래 오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합한 복합오일로부터 제조되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 유사 세라마이드 복합체는 하기의 단계 1 내지 단계 3을 포함하여 제조되는 것일 수 있다:
동백, 땅콩 및 비자로부터 오일을 추출하는 단계(단계 1);
상기 단계 1에서 추출된 동백오일, 땅콩오일 및 비자오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합하는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 혼합된 복합오일을 기질로 하여, 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체와 효소반응시키는 단계(단계 3).
본 발명에 있어서, 땅콩오일, 동백오일 및 비자오일은 우도땅콩, 동백씨앗 및 비자씨앗으로부터 각각 추출된 기름을 의미한다. 상기 기름을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 착유법이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 땅콩오일, 동백오일 및 비자오일은 일반적인 착유기를 이용한 착유법으로 추출할 수 있고, 구체적으로는 저온착유기를 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "유사 세라마이드"란, 천연 세라마이드의 단점을 보완하고 상용화가 가능한 천연 유래의 세라마이드를 모방한, 개선된 물성과 성질을 갖는 세라마이드를 의미한다. 세라마이드는 피부 각질층을 구성하는 각질세포 간 지질의 많은 부분을 차지하는 구성성분으로서 수분증발을 억제하고 각질층의 구조을 유지하는 기능을 한다. 각질층에서 세라마이드의 함량이 감소하게 되면, 수분증발이 증가하고 다양한 피부질환이 악화되는 것으로 알려져 있으며 또한 피부의 노화가 진행되거나 외적인 자극에 의해 각질층 내의 세라마이드 함량이 감소하면 외부에서 세라마이드를 보충하여 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 천연으로부터 세라마이드를 함유하는 다양한 동식물에 대한 연구가 진행되었으나 천연 세라마이드는 추출의 어려움 등으로 대량 생산이 어렵고 원료가 고가인 점이 상용화하기에는 부적합하다. 이뿐만 아니라 천연 세라마이드는 화장품에 사용되는 여러 가지의 용매에 대한 용해도가 낮아서 제품을 만들 때 사용할 수 있는 양이 제한되어 있어서 효능을 나타내는데 한계가 있다. 이에, 유사 세라마이드는 천연세라마이드의 단점을 보완하여 제조된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유사 세라마이드 복합체는 땅콩오일, 동백오일 및 비자오일 3종을 모두 포함하는 혼합물을 기질로 하고 CalB1422-278L 변이체(한국특허출원 제10-2019-0110299호)로 효소반응시킴으로써 생산되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효소반응은 아민알콜을 첨가하여 1차 효소 반응을 실시한 다음, 잔류하고 있는 지방산 아미드를 유사 세라마이드로 추가 전환하기 위하여 잔류 지방산 아미드와 동일한 몰수의 올레인산을 첨가하여 2차 효소 반응을 추가로 실시하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "CalB"는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제(lipase)를 의미한다. 리파제는 지방(triacylglyceride)을 지방산(fatty acid)과 글리세롤(glycerol)로 분해하는 효소로, 자연계에 존재하는 기질의 다양성으로 인해 리파제는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖도록 진화하였고 지방 분해(hydrolysis) 뿐만 아니라 에스터화 반응(esterification), 산분해(acidolysis), 에스터 교환(interesterification, transesterification), 아미노분해(aminolysis), 과가수분해(perhydrolysis) 등의 기능을 보유한 것으로 알려져 있다. 리파제 중에서도 칸디다 안타티카 유래의 CalB는 의약품 및 정밀 화학제품의 합성에 가장 많이 사용되는 효소이다.
본 발명에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 즉, 야생형 CalB의 아미노산 서열의 80번째 아미노산인 트레오닌 및 219번째 아미노산인 루이신 중 어느 하나 이상이 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
상기 변이체는 야생형 CalB의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산인 트레오닌 및 219번째 아미노산인 루이신 중 어느 하나 이상이 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 또는 상기 변이체는 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는, 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된, 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 변이체는 야생형 CalB의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환 및 219번째 아미노산인 루이신이 글루타민으로 치환 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 CalB의 변이체는, 상기에서 설명한 CalB 활성을 갖는 단백질 중 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, CalB 활성이 변이 전 단백질 대비 증가된 변이체를 의미할 수 있다.
상기 야생형 CalB의 아미노산 서열에서 80번째 및/또는 219번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 및/또는 219번째 아미노산 중 선택된 하나 이상의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 80번째 및/또는 219번째 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화(Southern hybridization) 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 "CalB의 변이체"는 CalB의 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, CalB 변이형 폴리펩티드, CalB 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드, CalB 활성 변이체, CalB 변이체, 변이형 CalB 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 또한 상기 단백질은 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CalB의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 및/또는 219번째 위치에서 변이를 포함할 수 있으며, 서열번호 1에 아미노산이 부가, 결실된 아미노산 서열이라고 해도 서열번호 1의 N-말단으로부터 80번째 및/또는 219번째 아미노산에 상응하는 위치의 아미노산이 치환된 변이체면 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 단백질의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 및/또는 219번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 야생형 미생물 유래 변이 전 CalB에 비하여 강화된 활성을 갖는 CalB일 수 있다. 이와 같은 CalB의 변이체는 상기에서 설명한 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산에서 서열번호 1의 80번째 및/또는 219번째에 상응하는 위치의 아미노산이 변이된 것을 의미한다.
상기 80번째 아미노산 변이는 80번째 아미노산이 알라닌으로 치환되는 것일 수 있고, 상기 219번째 아미노산 변이는 219번째 아미노산이 글루타민으로 치환되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 야생형 미생물 유래 변이 전 CalB에 비하여 강화된 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 CalB의 변이체를 포함하는 미생물의 경우, CalB의 가수분해(hydrolysis), 에스터 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 미생물이 상기 CalB 활성을 나타내지 못하거나, CalB 활성을 나타내더라도 미미한 활성을 나타내는 것에 반해, 본 발명의 CalB의 변이체를 통해 CalB 활성을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 소라 펩타이드는 하기의 단계 1 내지 단계 5를 포함하여 제조되는 것일 수 있다:
소라육을 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 건조된 소라육을 20-100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 소라육 100 중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후, 1.4-1.6 atm, 105-115℃에서 32-38분간 자숙하는 단계(단계 3);
상기 단계 3의 소라육 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-50℃에서 발효 후, 80-90℃에서 10-20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및
상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5).
본 발명에 있어서, 상기 단계 4의 가수분해원은 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물 또는 단백질 가수분해 효소일 수 있다. 상기 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물은 바실러스 서브틸러스(bacillus subtilis)인 것일 수 있고, 상기 단백질 가수분해 효소는 메탈로펩티다아제 및 메탈로프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 상기 단백질 가수분해 효소는 썰모라이신(Thermolysin: EC 3.4.24.27. Bacillus thermoproteolyticus가 생산하는 미생물유래 단백질 분해효소)인 것일 수 있다. 또한, 상기 비활성화 하는 단계는 바람직하게 80℃에서 15분간 효소를 비활성화 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 5는 상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계이다. 바람직하게는 상기 단계 4의 발효 후 3,000rpm으로 원심분리할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크 로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 피부 외용제의 제형인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제 제형의 하나의 바람직한 형태는 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 파운데이션, 선스크린, 비누, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 에센스, 클렌저, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 바람직하게는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 바이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있으며, 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
본 발명의 조성물은 액제, 에어로졸제, 멸균 주사용액 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 제주산 식물 3종 유래 유사 세라마이드 복합체의 제조
1-1. 제주오일 추출
사용된 제주산 식물은 동백씨앗, 우도땅콩, 비자씨앗이다.
일반적인 기계적인 오일 착유법은 고온에서 볶은 후 유압식 착유방법을 이용하여 착유한다. 이는 오메가3와 같은 유효성분의 파괴시키는 단점이 있다.
저온착유법은 압착지점에만 열을 전달하는 방식인 엑스펠러 추출방법과 동일하게 추출하되, 추출 시 발생되는 열은 원물과 오일이 서로 분리되는 최소한의 온도인 50℃로 조절하여 착유한다.
동백씨앗, 우동땅콩, 비자씨앗의 껍질을 제거하고 씻은 후 건조시켜 사용하였으며, 저온착유기(내쇼날이엔지 社)를 이용하여 착유한 오일은 원심분리기를 이용하여 8000rpm, 4℃에서 1시간동안 불순물을 침전시킨 후 상층인 오일만 사용하였다(도 1).
상기 저온착유기로 수득한 천연오일 3종(땅콩오일, 동백오일 및 비자오일)을 동량으로 혼합하여 복합오일(mixing oil)로 사용하였다.
1-2. 제주오일의 분석
제주 특화 천연오일 3종 및 이들 혼합물에 대하여 자동주입기를 장착한 가스 크로마토그래피 시스템과 불꽃 이온화 검출기(Flame ionization detector, FID)를 사용하여 지방산 조성을 분석하였다(표 1). 그 결과 동백오일에서 불포화 지방산인 oleic acid가 79.9%로 과반이상을 차지하고 있음을 알 수 있었다. 땅콩오일에는 불포화지방산인 linoleic acid, oleic acid가 43.2 %, 40 %로 각각 포함되어 있으며, 비자오일에서도 46.1 %, 34.2 %의 순서로 포함되어 있었다. Oleic acid는 상처치료, 면역 및 염증 질환에 효과가 있으며 최근 항암효과를 입증받으며 관심이 많아지는 성분이다. Linoleic acid는 항염작용과 함께 insulin 저항성을 막아주는 기능을 한다고 보고되고 있다. 이 결과를 통하여 각각의 천연오일에서 불포화 지방산이 과반이상을 차지하고 있어 기능성 원료로 개발 가능성이 높음을 알 수 있다.
Sample Palmitic acid (C16:0) Steric acid (C18:0) Oleic acid (C18:1) Linoleic acid (C18:2) Others
동백오일
(Camellia oil)		 7.8 3.0 79.9 8.7 0.6
땅콩오일 (Udo-Peanut oil) 11.2 3.6 40.0 43.2 2.0
비자오일
(Torreya oil)		 6.1 1.6 34.2 46.1 12.0
3종 복합오일 (Mixing oil) 10.4 4.5 47.2 33.4 4.5
1-3. 유사 세라마이드 생산용 효소의 대량생산 및 고정화
선행연구를 통해, 유사 세라마이드 생산용 최적 효소를 선별하였으며, 유사 세라마이드 생산용 효소로 CalB1422-278L 변이체(서열번호 1, 한국특허출원 제10-2019-0110299호)를 사용하였다. 상기 CalB1422-278L 변이체의 서열은 하기 표 2와 같다.
명칭 서열
CalB1422-278L LPSGSDPAFSQPKSVLDAGL20
TCQGASPSSVSKPILLVPGT40
GTTGPQSFDSNWIPLSAQLG60
YTPCWISPPPFMLNDTQVNA80
EYMVNAITTLYAGSGNNKLP100
VLTWSQGGLVAQWGLTFFPS120
IRSKVDRLMAFAPDYKGTVL140
AGPLDALAVSAPSVWQQTTG160
SALTTALRNAGGLTQIVPTT180
NLYSATDEIVQPQVSNSPLD200
SSYLFNGKNVQAQAVCGPQF220
VIDHAGSLTSQFSYVVGRSA240
LRSTTGQARSADYGITDCNP260
LPANDLTPEQKVAAAALLAP280
AAAAIVAGPKQNCEPDLMPY300
ARPFAVGKRTCSGIVTP317
CalB1422-278L의 대량생산을 위해서 효모 Y2805(YGa-ST3-CalB1422-278L) 균주를 5L 발효조를 이용하여 유가식 발효 배양하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ YNB(0.67 % 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5 % 카사미노에시드, 2 % 글루코스) 배지에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지(2 % 포도당, 3 % 효모추출물, 1.5 % 펩톤)에서 배양하여 활성화하고 1.8 L의 본 배양액(2 % 포도당, 3 % 효모추출물, 1.5 % 펩톤)에 접종하여 30 ℃에서 발효하였다. 배양 중 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30 % 포도당, 15 % 효모 추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 45 시간 동안 발효하였다. 배양 중 세포의 성장 정도는 시간 별로 시료를 취하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고 배지에 분비 생산된 리파제의 양과 활성을 SDS-PAGE와 pNPP법으로 분석하였다.
그 결과, 분비 생산된 단백질의 양은 630 mg/L 였으며 배양상등액의 리파제 활성은 78,300 U/L의 값을 나타내었다. 발효 생산된 리파제를 회수하고 레진에 고정화하기 위하여 6000 rpm으로 20 분간 원심분리한 후 0.1 ㎛ 크기의 여과막을 통과시켜 균체를 완전히 제거하였다. 회수한 배양상등액은 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)를 반복적으로 첨가하여 한외여과(분자량 30kDa 컷-오프) 막을 통과시키는 방법으로 배양액을 농축하였다. 단백질의 고정화는 아크릴레진(Lewatit VP OC 1600, Lanxess)에 흡착하는 방법을 이용하였다. 고정화는 레진 중량 1 g당 25 mg의 단백질을 사용하였으며, 18℃에서 24시간 동안 흡착시켰다. 24시간 후 반응상등액의 SDS-PAGE와 정량분석을 통해 배양상등액의 리파제가 70% 이상 흡착고정화 되었음을 확인하였다.
1-4. 땅콩오일을 이용한 유사 세라마이드 생산공정 최적화
선행연구를 통해, 유사 세라마이드 생산을 위한 아민알콜(1-amino-2-propanol), 용매(TAA(ter-amyl alcohol) 및 헥산 혼합 용매) 및 공정을 최적화하였다.
리파제는 유사 세라마이드를 제조하는데 필요한 아미노화(amidation) 반응과 에스터화(esterification) 반응을 동시에 수행하는 효소이다. 땅콩오일로부터 유사 세라마이드를 생산하는 과정은 1차 지방산의 아미노화 반응(amidation)이 선행되어야 하며 이를 통해 생성된 지방산 아미드에 다시 2차 지방산이 에스터화 반응(esterification)이 되어 최종 유사 세라마이드가 형성된다.
먼저 1단계 반응으로 유사 세라마이드의 제조 가능성 여부를 확인하였다. 땅콩오일과 아민알콜의 몰수를 달리하여 1단계 반응으로 유사 세라마이드의 생성을 확인한 결과 아민알콜의 몰수가 높을수록 유사 세라마이드의 전환율이 낮아짐을 확인하였고 동일한 몰수를 공급한 경우에도 미반응 디글리세리드(DG)와 모노글리세리드(MG)가 잔량으로 남는 문제가 있었다. 땅콩오일의 몰수를 아민알콜보다 1.5배 높게 공급한 경우에도 1단계 반응에서 65시간 반응 이후에도 반응이 종료되지 않고 미반응 지방산아미드가 60% 이상 잔류하고 있음을 확인하였다.
1단계 전환반응에서 미반응 지방산 아미드가 잔류하는 문제를 해결하고 유사 세라마이드 전환수율을 높이기 위하여 2단계 반응을 시도하였다(도 2). 1차 반응에서 생성된 수분, 그리고 미반응 아미노 알콜 등을 증류를 통해 제거한 후 최종산물을 회수하였다. 2단계 반응에서는 1차 반응에서 미반응 상태로 잔류하고 있는 지방산 아미드를 유사 세라마이드로 추가 전환하기 위해서 잔류 지방산 아미드 양을 정량하고 이와 동일한 몰수의 oleic acid를 첨가하였다. 2차 반응 기질은 헥산에 용해하고 10%의 고정화효소를 첨가한 다음 50℃에서 추가 반응을 진행하였다. 그 결과, 2차 반응에서는 지방산 아미드가 대폭 줄고 유사 세라마이드의 생성량이 증가하여 최종 80% 이상의 유사 세라마이드가 제조되었다.
본 결과를 토대로 천연오일로부터 유사 세라마이드를 제조하는 최적공정은 도 3에 표시한 바와 같다.
1-5. 3종 복합오일을 이용한 유사 세라마이드 복합체 제조
제주 천연오일 3종(땅콩오일, 동백오일 및 비자오일)을 혼합한 복합오일을 사용하여 상기 1-4의 최적공정과 동일한 방법으로 유사 세라마이드 복합체를 제조하였다. 반응조건은 도 3에 표시한 바와 같으며 아민알콜은 3-amino-1-propanol을 사용하였다. 1차 반응을 40시간동안 전환하고 반응물로부터 효소를 제거 후 증류하여 수분 및 잔여 아민알콜을 제거한 다음 2차 반응을 진행하였다. 2차 반응 기질로는 oleic acid를 잔여 지방산 아미드의 몰수만큼 첨가하였고, 2차 솔벤트는 hexane을 이용하였다. 그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 약 81%의 3종 복합오일 유래의 유사 세라마이드 복합체(제조예 1) 생성이 확인되었다.
<제조예 2> 소라 펩타이드의 제조
단계 1: 제주산 소라(Turbo cornutus Solander)의 패각 및 내장을 제거한 후 정제수로 1회 수세한 후 60℃에서 제주산 소라육을 24시간 건조 시킨다.
단계 2: 단계 1 후에 그라인더를 이용해 20~100mesh로 분쇄한다.
단계 3: 분쇄된 제주산 소라 분말 100g과 정제수 900ml을 혼합하여 110℃에서 35분간 밀폐된 고압(1.5atm) 고온(110℃)의 용기내에서 가온하여 자숙한다.
단계 4: 자숙된 제주산 소라육(제주산 소라육 100g + 정제수 900ml)을 35℃까지 냉각한 후 온도를 유지하며, 썰모라이신(Thermolysin: EC 3.4.24.27. Bacillus thermoproteolyticus가 생산하는 미생물유래 단백질 분해효소) 5g을 첨가한 후 4시간 동안 150rpm으로 교반하여 제주산 소라육의 단백질들을 가수분해(발효)하여 펩타이드화 한다. 가수분해(발효) 완료 후 80℃에서 15분간 효소를 비활성화 할 수 있다.
단계 5: 효소에 의해 가수분해(발효)가 완료된 가수분해물은 3,000rpm으로 원심분리하여 정제수에 용해되지 않는 제주산 소라육 및 이물질들을 제거한다. 회수된 상등액은 감압농축 및 동결건조를 통해 분말화 하여 제조예 2의 제주산 소라육 자숙분말(=소라 펩타이드, Turbo peptide)을 제조하였다.
<실시예 및 비교예> 제주산 식물 3종 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물의 제조
상기 제조예 1 및 제조예 2의 방법으로 제조된 제주산 식물 3종 유래 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드를 일반적인 화장료 조성물에 하기 표 3과 같이 배합하여 크림 형태의 화장료를 제조하였다. 이때, 하기 표 3은 화장료 조성물 전체 부피를 기준으로 첨가된 유사 세라마이드 및 소라 펩타이드의 함량(w/v%)을 계산하여 나타내었다.
w/v% 유사 세라마이드 복합체
(제조예 1)		 소라 펩타이드
(제조예 2)
실시예 1 0.25 0.005
실시예 2 0.50 0.005
실시예 3 0.80 0.005
실시예 4 1.00 0.005
실시예 5 1.20 0.005
실시예 6 1.50 0.005
실시예 7 2.00 0.005
실시예 8 1.00 0.001
실시예 9 1.00 0.002
실시예 10 1.00 0.004
실시예 11 1.00 0.005
실시예 12 1.00 0.006
실시예 13 1.00 0.008
실시예 14 1.00 0.010
비교예 1 1.00 -
비교예 2 - 0.005
<실험예 1> 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드의 MMP-1 생성 억제능 분석
상기 실시예 1 내지 14 및 비교예 1 및 2의 방법으로 제조된 유사 세라마이드 복합체 및/또는 소라 펩타이드를 포함하는 화장료에 대한 MMP-1 발현을 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)방법을 이용하여 측정하였고, 이는 Human matrix metalloproteinase 1, MMP-1 ELISA kit (Cusabio, USA)를 사용하여 측정하였다.
본 실험에 사용된 HDF cell(Normal Human Primary Dermal fibroblasts-Adult(HDFa); ATCC® PCS-201-012™)은 ㈜더마프로에서 제공받았다. 세포배양은 Dulbecco’s modifided Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)와 F12 media (Gibco, USA)를 3:1로 섞은 후, 10 % (v/v) fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)와 1% Anti-Anti (Gibco, USA)를 첨가한 후 37 ℃, 5 % CO2의 배양기에서 배양하였고, 2 ~ 3일 간격으로 계대배양 하여 유지하였다.
HDF cell을 96well plate에 1 X 105/well로 분주하였고, 24hr 동안 잘 부착하도록 배양하였다. FBS가 포함되지 않은 배지에 유사 세라마이드 복합체 및/또는 소라 펩타이드를 농도별로 혼합한 상기 실시예 1 내지 14 및 비교예 1 및 2의 방법으로 제조된 화장료 시료(sample)을 200 ㎕씩 분주 한 뒤 24hr 동안 배양하였다. MMP-1의 발현은 세포 밖으로 방출되는 것을 적정하는 방법이므로 배양액을 이용하여 측정하였다.
각 well에 배양액과 standard를 100 ㎕씩 분주하고 37℃ 인큐베이터에 2hr 배양한다. 이 후 배양액을 제거하고 100 ㎕의 Biotin-antibody (1X)를 각각 넣은 후 37℃ 인큐베이터에 1시간 배양한다. Kit에 있는 washing buffer로 두 번 washing 한 뒤, HRP-avidin (1X)을 100 ㎕씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에 1hr 배양한다.
Wasing buffer로 washing 5회를 실시한 후 90 ㎕의 TMB substrate를 각각 넣은 후 15 ~ 30 min 간 37℃ 인큐베이터에서 암반응한다.
이 후 50 ㎕의 stop solution을 이용하여 반응을 정지하고 450nm에서 흡광도로 값을 측정하여 하기 표 4에 발현량을 나타내었다.
유사 세라마이드 복합체
(w/v%)		 소라 펩타이드
(w/v%)		 MMP-1 발현량
(Relative of fold change, %)		 MMP-1 생성 억제율
(%)
대조군(control) - - 100.0 -
실시예 1 0.25 0.005 77.1 22.9
실시예 2 0.50 0.005 68.4 31.6
실시예 3 0.80 0.005 62.4 37.6
실시예 4 1.00 0.005 56.3 43.7
실시예 5 1.20 0.005 60.7 39.3
실시예 6 1.50 0.005 67.9 32.1
실시예 7 2.00 0.005 76.4 23.6
실시예 8 1.00 0.001 78.6 21.4
실시예 9 1.00 0.002 69.0 31.0
실시예 10 1.00 0.004 63.8 36.2
실시예 11 1.00 0.005 56.3 43.7
실시예 12 1.00 0.006 59.7 40.3
실시예 13 1.00 0.008 67.1 32.9
실시예 14 1.00 0.010 75.7 24.3
비교예 1 1.00 - 93.9 6.1
비교예 2 - 0.005 68.8 31.2
그 결과 유사 세라마이드 및 소라 펩타이드의 단독 또는 복합물 처리군 모두 대조구 보다 MMP-1 발현량이 감소하였고, 유사 세라마이드 및 소라 펩타이드를 혼합한 실시예 1 내지 실시예 14에서 더욱 유의하게 감소하였다. 특히, 유사 세라마이드 0.5 내지 1.5%(w/v) 및 소라 펩타이드 0.002 내지 0.008%(w/v)를 혼합한 경우, 비교예 1 및 2의 단독 처리군보다 MMP-1 발현량이 더 감소하였으며, 유사 세라마이드 0.8 내지 1.2%(w/v) 및 소라 펩타이드 0.004 내지 0.006%(w/v)를 혼합한 경우, 단독물 대비 상승효과가 나타나 더 우수한 MMP-1 생성 억제 효과를 나타내었다.
이러한 결과로부터 유사 세라마이드 및 소라 펩타이드는 콜라겐생합성 촉진효과와 함께 피부의 탄력 및 주름개선 효능에 기여할 수 있음을 확인하였다.
<실험예 2> 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드의 피부장벽 강화 효과 분석
상기 유사 세라마이드 복합체 및 소라 펩타이드 각각의 단독물 또는 복합물을 포함하는 화장료 조성물(실시예 1 내지 14 및 비교예 1 및 2)에 대한 피부장벽 강화 효과를 평가하였다. 피부장벽 강화 효과를 확인하기 위해, 상기 각 화장료의 사용 전후의 경피수분손실량 및 피부 순분량을 분석하였다.
구체적으로, 20~60세의 전박의 경피수분손실량이 10 g/h ㎡ 이상인 남녀를 대상으로 피험자의 선정기준에 부합하고 제외기준에 부합하지 않는 피험자를 선정하였다. 선정된 피험자를 대상으로 2주 동안 1일 2회(아침, 저녁), 시험부위(전박)를 물로만 세정한 후 시험부위 전체에 적용될 적당량의 시험화장료와 대조화장료(유사 세라마이드 복합체 또는 소라 펩타이드를 포함하지 않은 것을 제외하고는 동일한 성분으로 이루어진 화장료)를 지정된 부위에 바른 뒤 흡수시키도록 하였다.
평가는 각 시점(제품 사용 전, 제품 사용 1 주 및 2 주 후)에서 경피수분손실량 측정, 피부수분량 측정, 사진촬영 및 안전성평가를 실시하였다. 또한 방문시점마다 시험제품 사용량 및 사용확인서를 통해 제품 사용 순응도를 확인하였다.
하기 모든 데이터는 SPSS Package Program (IBM, USA)을 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다. 사전 동질성은 RM-ANOVA 를 통해 검증하였으며, 정규성은 shapro-wilk 및 첨도(kurtosis)와 왜도(skewness)를 통해 검증하였다. 동일 피험자에게서 반복 측정한 데이터에 존재하는 상호의존성(교호작용), 시점별 비교는 모수일 경우 RM-ANOVA를, 비모수일 경우 Wilcoxon Signed Ranks Test를 이용하였으며, 군간 비교는 RM-ANOVA와 RM-ANCOVA를 이용하여 검증하였다. 통계학적 유의수준은 p값이 0.05 미만으로 설정하였다.
2-1. 경피수분손실량 분석
실시예 1 내지 14 및 비교예 1 및 2의 화장료 조성물에 대한 경피수분손실량(TEWL)은 개방 chamber인 Tewameter®TM300 (Courage &Khazaka, Germany)를 이용하여 전박 부위의 경피수분손실량을 10~60초 사이에 안정화되는 구간의 평균값을 분석하였다. Tewameter®TM300은 open chamber 내의 diffusion 원리에 기초하고 있으며, probe의 온도와 습도 sensor가 측정 부위의 단위면적당 시간경과에 따른 수분증발량(g/h㎡)을 각 시점(제품 사용 전, 제품 사용 1 주 및 2 주 후)에서 측정하였다. 측정된 수분증발량으로부터 경피수분손실량 감소율(%)을 하기 식에 따라 계산하여 표 5에 나타내었다.
경피수분손실량 감소율(%)={(화장료 사용전 수분증발량-화장료 사용후 수분증발량)/화장료 사용전 수분증발량}×100
유사 세라마이드 복합체
(w/v%)		 소라 펩타이드
(w/v%)		 경피수분손실량 감소율
(Change from baseline, %)
1주후 2주후
대조군(control) - - 4.56 8.01
실시예 1 0.25 0.005 8.29 18.47
실시예 2 0.50 0.005 11.02 24.02
실시예 3 0.80 0.005 16.75 31.28
실시예 4 1.00 0.005 18.89 42.96
실시예 5 1.20 0.005 16.82 34.79
실시예 6 1.50 0.005 10.95 24.19
실시예 7 2.00 0.005 8.65 19.61
실시예 8 1.00 0.001 8.98 18.25
실시예 9 1.00 0.002 10.16 23.68
실시예 10 1.00 0.004 16.72 32.49
실시예 11 1.00 0.005 18.89 42.96
실시예 12 1.00 0.006 17.02 36.21
실시예 13 1.00 0.008 11.63 24.27
실시예 14 1.00 0.010 9.15 19.48
비교예 1 1.00 - 8.14 10.92
비교예 2 - 0.005 9.29 17.24
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 14 또는 비교예 1 및 2 화장료 처리군과 대조화장료 처리군 모두 화장료 사용 1주 및 2주 후 시점에서 경피수분손실량이 유의하게 감소하였고, 유사 세라마이드 0.5 내지 1.5%(w/v) 및 소라 펩타이드 0.002 내지 0.008%(w/v)를 혼합한 경우, 비교예 1 및 2의 단독 처리군보다 경피수분손실을 유의하게 억제하였으며, 유사 세라마이드 0.8 내지 1.2%(w/v) 및 소라 펩타이드 0.004 내지 0.006%(w/v)를 혼합한 경우, 단독처리군 대비 경피수분손실 억제에 대한 상승효과가 나타나 더 우수한 피부장벽 강화 및 보호 효과를 나타내었다.
2-2. 피부 수분량 분석
실시예 1 내지 14 및 비교예 1 및 2의 화장료 조성물에 대한 피부 수분량은 Corneometer®CM 825(Courage &Khazaka, Germany)를 이용하여 측정하였다. 이 기기는 각질층 내 수분함량을 측정하는 장비로써, 각질층은 전기에 대한 높은 저항을 갖고있는데, 수분 함유시 교류파 전류를 가했을 때 저항이 감소되는 원리를 이용하여 저항의 역수인 conductance를 측정하여 수분함량을 나타내게 된다. 각 시점(제품 사용 전, 제품 사용 1 주 및 2 주 후)에서 시험부위의 피부 수분량을 측정 후 평균값을 분석하였다. 측정된 피부 수분량 평균값으로부터 피부 수분량 증가율(%)을 하기 식에 따라 계산하여 표 6에 나타내었다.
피부 수분량 증가율(%)={(화장료 사용후 수분증발량-화장료 사용전 수분증발량)/화장료 사용전 수분증발량}×100
유사 세라마이드 복합체
(w/v%)		 소라 펩타이드
(w/v%)		 피부수분량 증가율
(Change from baseline, %)
1주후 2주후
대조군(control) - - 24.85 11.49
실시예 1 0.25 0.005 26.93 32.65
실시예 2 0.50 0.005 36.01 39.16
실시예 3 0.80 0.005 47.28 50.34
실시예 4 1.00 0.005 52.54 54.43
실시예 5 1.20 0.005 48.62 50.91
실시예 6 1.50 0.005 35.92 43.18
실시예 7 2.00 0.005 27.35 32.26
실시예 8 1.00 0.001 26.25 32.19
실시예 9 1.00 0.002 34.26 39.35
실시예 10 1.00 0.004 46.95 50.16
실시예 11 1.00 0.005 52.54 54.43
실시예 12 1.00 0.006 49.28 51.02
실시예 13 1.00 0.008 36.28 39.89
실시예 14 1.00 0.010 27.55 33.22
비교예 1 1.00 - 25.49 27.16
비교예 2 - 0.005 27.84 31.27
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 14 또는 비교예 1 및 2 화장료 처리군과 대조화장료 처리군 모두 화장료 사용 1주 및 2주 후 시점에서 피부 수분량이 유의하게 증가하였고, 유사 세라마이드 0.5 내지 1.5%(w/v) 및 소라 펩타이드 0.002 내지 0.008%(w/v)를 혼합한 경우, 비교예 1 및 2의 단독 처리군보다 피부 수분량이 유의하게 증가하였으며, 유사 세라마이드 0.8 내지 1.2%(w/v) 및 소라 펩타이드 0.004 내지 0.006%(w/v)를 혼합한 경우, 단독처리군 대비 피부 수분 증가에 대한 상승효과가 나타나 더 우수한 피부 장벽 보호 및 강화 효과를 나타내었다.
2-3. 안전성 평가
상기 경피수분손실량 분석 및 피부 수분량 분석의 각 평가 시점에서 문진과 시험자의 관찰에 의해 피부 자극감과 객관적 피부 자극을 확인하여 기록하였다.
그 결과, 시험기간 동안 모든 피험자에게서 피부 이상반응은 관찰되지 않았다.
2-4. 설문 평가 분석
효능에 관한 설문평가는 상기 실험예에서 가장 우수한 경피수분손실량 억제 및 피부 수분량 증가 효과를 나타낸 실시예 4(=실시예 11, Test)의 화장료 조성물 및 대조화장료(Base cream, Control)을 대상으로 실시하였다. 상기 화장료 사용 1주 및 2주 후 시점에서, 사용성(usability)에 관한 설문평가는 제품 사용 2주 후 시점에서 색, 향, 발림성, 흡수력 및 만족도 항목에 대하여 1~5점 척도(1, 매우그렇지않다; 2, 그렇지않다; 3, 변화없음; 4, 그렇다; 5, 매우그렇다/1, 매우좋지않다; 2, 좋지않은편이다; 3, 보통이다; 4, 좋은편이다; 5, 매우좋다)로 실시하였다. 설문 평가 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5는 본 발명에 따른 실시예 4의 화장료(Test) 및 대조화장료(Control)에 대하여 사용성에 관한 비교 감각 프로파일(Comparative sensorial profile)이다.
사용성에 관한 설문 평가 결과, 실시예 4의 경우 피험자의 약 59%~86%가 모든 항목에 대해 긍정적으로 응답하였으며, 대조화장료보다 색, 향, 발림성, 흡수력 및 만족도에 대하여 모두 높게 평가하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Korea Beauty Industry Development Institute Co., Ltd. <120> Functional cosmetic composition comprising pseudoceramide complex derived from Jeju plant and Turbo peptide <130> PN1909-451 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CalB1422-278L <400> 1 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315

Claims (11)

  1. 총 화장료 조성물 100 부피부 기준,
    동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 0.8-1.2 중량부; 및
    소라 펩타이드 0.004-0.006 중량부;를 포함하고,
    상기 유사 세라마이드 복합체는 동백, 땅콩 및 비자로부터 오일을 추출하는 단계(단계 1), 상기 단계 1에서 추출된 동백오일, 땅콩오일 및 비자오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합하는 단계(단계 2), 및 상기 단계 2에서 혼합된 복합오일을 기질로 하여, 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체와 효소반응시키는 단계(단계 3)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하고,
    상기 소라 펩타이드는 소라육을 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계(단계 1), 상기 단계 1의 건조된 소라육을 20-100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2), 상기 단계 2의 소라육 100 중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후, 1.4-1.6 atm, 105-115℃ 에서 32-38분간 자숙하는 단계(단계 3), 상기 단계 3의 소라육 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-50℃에서 발효 후, 80-90℃에서 10-20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4), 및 상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는,
    피부장벽 강화 또는 보호용 화장료 조성물.
  2. 총 화장료 조성물 100 부피부 기준,
    동백, 땅콩 및 비자 유래 유사 세라마이드 복합체 0.8-1.2 중량부; 및
    소라 펩타이드 0.004-0.006 중량부;를 포함하고,
    상기 유사 세라마이드 복합체는 동백, 땅콩 및 비자로부터 오일을 추출하는 단계(단계 1), 상기 단계 1에서 추출된 동백오일, 땅콩오일 및 비자오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합하는 단계(단계 2), 및 상기 단계 2에서 혼합된 복합오일을 기질로 하여, 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체와 효소반응시키는 단계(단계 3)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하고,
    상기 소라 펩타이드는 소라육을 40-80℃에서 12-72시간 건조하는 단계(단계 1), 상기 단계 1의 건조된 소라육을 20-100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2), 상기 단계 2의 소라육 100 중량부에 정제수를 800-1000 중량부로 혼합 후, 1.4-1.6 atm, 105-115℃ 에서 32-38분간 자숙하는 단계(단계 3), 상기 단계 3의 소라육 자숙물 1000 중량부에 가수분해원을 1-10 중량부로 혼합하여 3-24시간 동안, 25-50℃에서 발효 후, 80-90℃에서 10-20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4), 및 상기 단계 4의 발효 후 2,000-6,000rpm으로 원심분리한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는,
    피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 동백, 땅콩 및 비자는 제주산인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 소라는 제주산인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 유사 세라마이드 복합체는 상기 동백, 땅콩 및 비자 유래 오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합한 복합오일로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크 로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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