KR102251114B1

KR102251114B1 - 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 주름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102251114B1
Application number: KR1020200140106A
Authority: KR
Inventors: 허수진; 강나래; 김은아; 김준성; 이승홍
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-05-11

Abstract

본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 소라 내장 가수분해물은 항산화능과 더불어 주름 관련 효소의 저해, 히알루론산 합성 촉진 효과를 보이며 세포 독성도 없는 천연물로, 이를 피부 보습 또는 피부 주름 개선을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 주름 개선용 조성물{Cosmetic composition for skin moisturizing or anti-wrinkle comprising hydrolyzed extract of Turbo cornutus viscera as effective component}

본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 주름 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부에서부터 순서대로 표피, 진피 및 피하지방 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 외부 환경에 의한 물리적, 화학적인 자극으로부터 인체를 보호해 주는 기능을 한다. 특히 피부는 인체가 갖고 있는 약 65∼70%의 수분, 즉 인체에 필요한 각종 생리 활성 물질을 운반하며, 피부가 부드럽고 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 도와주는 이러한 수분이 체외로 증발되는 것을 조절해 주는 중요한 역할을 한다. 또한, 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층 및 기저층의 순서로 구분되는데 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고, 각질세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다. 표피의 각질층은 약 10∼20%의 수분을 함유하며 인체의 최외각에 존재함으로써 체외로의 수분 증발을 억제하는 한편, 외부로부터의 물질 과잉 침투를 차단한다. 이들 각질층 표면은 피지선에서 나온 피지와 땀샘에서 나온 땀으로 만들어진 얇은 천연 보호막으로 감싸져 있어서 수분의 증발을 예방할 수 있다.

그러나, 환경의 변화 혹은 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회 생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되는 현상이 발생하고 있다.

피부 노화 현상의 원인은 크게 두 가지로 세포의 유전자 변이, 조직 변화 등 내적 요인과 자외선, 습도 등 외적요인으로 분류될 수 있다. 특히 자외선에 의한 노화 현상을 광노화라고 한다. 자외선에 의해 세포 내부에 활성산소 라디칼이 생성되고, 활성 산소는 염증성 반응을 일으키는 신호전달 체계를 통하여 진피층의 탄력 섬유인 콜라겐, 엘라스틴 등을 분해하는 단백질 분해 효소(MMP-1, MMP-3, MMP-9, etc.)의 합성을 촉진하며, 진피층의 탄력을 감소시킴으로써 피부 주름을 유발한다.

특히, 인체의 중성구 과립구 내에 존재하는 엘라스타아제(Elastase)는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하며, 콜라겐 분해활성도 가지는 효소이다. 엘라스타아제가 적절하게 발현되고 활성화되면 상처회복 등에 관여하지만, 과다하게 발현되거나 활성화된 경우 피부 내의 엘라스틴을 분해하여 피부의 탄력을 잃게 된다.

더불어 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM)의 주요 구성성분으로 수분 보유, 세포간 간격 유지, 세포 성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여할 뿐만 아니라, 세포의 분열과 분화, 이동 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 피부의 HA는 주로 표피 각질 형성세포와 진피 섬유아세포의 세포막 안쪽 표면에서 HA 합성효소(Hyaluronic acid synthase, HAS)에 의해 합성되어 ECM에 축적되는 것으로 알려져 있다. 따라서 HAS의 발현저하로 인한 HA의 감소 및 보습장벽의 결함은 표피의 위축, 주름형성, 피부 수분량 감소, 탄력성 저하 등 피부 노화를 일으킨다고 할 수 있다.

현재 피부 노화 예방 및 치료제로 사용되고 있는 레티노인산은 지용성의 물성으로 인하여 피부 흡수력이 미약하여 콜라겐 합성의 증진기능 및 엘라스틴 분해 방지효과를 크게 기대하기 어렵고 자극성이 있으며, 또한 생체 내에서의 빠른 효소분해로 인해 안정성 문제가 대두되고 있다.

따라서 유의미한 효과를 가졌다고 인정받은 피부 보습제 또는 피부 주름 개선제는 아직 없는 바, 피부 보습 유지 및 강화 효과와 피부주름 개선 효능이 있으면서도 피부에 대하여 독성을 나타내지 않는 천연물 유래의 생리활성물질에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다.

하지만 본 발명과 같이 소라 내장 가수분해물의 피부 보습 또는 피부 주름 개선 효과에 대하여 공지된 바 없다.

본 발명자들은 피부 보습 또는 피부 주름 개선 효과를 가진 천연물에 대해 탐색하던 중, 소라 내장 가수분해물이 상기와 같은 효과를 갖는다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 화장료 조성물을 포함하는 팩을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 화장료 조성물을 포함하는 팩을 제공한다.

또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 소라 내장 가수분해물은 주름 관련 효소의 활성 저해, 히알루론산 합성 촉진 및 항산화능을 가지고 있는 바, 피부 보습 유지 및 강화, 피부 탄력 유지, 피부 주름 개선 등을 위한 화장료 조성물, 팩 또는 식품 조성물 등으로 다양하게 활용할 수 있다.

도 1은 소라 암수별 육과 내장의 가수분해 수율을 확인한 도이다.
도 2는 소라 암수별 육과 내장 가수분해물의 항산화능을 확인한 도이다.
도 3은 암소라 내장 가수분해물의 항산화능을 확인한 도이다.
도 4는 소라 암수별 육과 내장 가수분해물의 히알루로니다아제(Hyaluronidase)에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 5는 암소라 내장 가수분해물의 히알루로니다아제에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 6은 소라 암수별 육과 내장 가수분해물의 엘라스타아제(Elastase)에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 7은 암소라 내장 가수분해물의 엘라스타아제에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 8은 암소라 내장 가수분해물의 콜라게나아제(Collagenase)에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 9는 암소라 내장 가수분해물의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 10은 암소라 내장 가수분해물의 산화적 스트레스를 유발시킨 세포의 생존률에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 11은 암소라 내장 가수분해물의 산화적 스트레스를 유발시킨 세포의 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 생성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 12는 암소라 내장 가수분해물의 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 합성에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 13은 암소라 내장 가수분해물의 HA 합성효소(Hyaluronic acid synthase, HAS) 및 히알루로니다아제에 미치는 영향을 확인한 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "소라(Turbo cornutus)"는 연체동물 소라과에 속하는 종으로, 일본, 중국, 우리나라등에 주로 분포를 하며, 조간대 암반지역에 서식하다가 성장을 하면서 수심 20m 내외의 암초지역에 분포 한다. 소라는 파도 등 해류의 영향에 따라 무뿔소라와 뿔소라 형태로 나타나며, 남해안과 울릉도까지 분포를 하지만 대부분 제주도 주변에 분포를 한다. 소라는 깊은곳에서 각고 12cm 이상 개체도 발견되지만 대체적으로 6-10cm급에서 주요 산란급으로 이루어지며 피채는 간조시 노출되는 조간대에서 서식하며 점차 성장하면서 깊은 곳으로 이동한다. 소라는 칼슘, 철분, 인 등의 미네랄과 비타민 A를 함유하고 있는 고단백 식품으로서 잘 알려져 있어 현재 소라를 이용한 많은 연구가 수행되고 있다. 하지만 본 발명과 같이 소라 내장의 효능을 확인한 연구는 매우 적으며, 특히 피부에 있어서의 효능을 확인한 연구는 전무하다.

본 발명에 있어, 상기 소라 내장은 가수분해 효율을 증대시키기 위하여 전처리 과정을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소라 내장을 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

본 발명 조성물에 있어서 소라 내장 가수분해물은 소라 내장을 공지된 단백질 분해효소로 가수분해하여 수득한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해하여 수득한 것일 수 있다.

상기 알칼라아제(Alcalase)는 박테리아나 진균에서 생성되는 단백질 가수분해 효소로, pH 6 내지 10 부근의 조건에서 강한 단백질 분해능을 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 가수분해 또한 pH 6 내지 10 및 30 내지 70℃의 조건에서 12시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 소라 내장 가수분해물의 제조시 처리, 보관 등의 용이함을 위하여 여과 과정, 농축 및 정제과정, 건조과정, 동결과정, 분말화 가정 등이 임의로 추가될 수 있다.

더불어 가수분해 반응 후 효소 불활성화를 위하여 90 내지 100℃로 가열하여 사용할 수 있다. 또한 이를 원심분리 및 감압여과를 수행하여 상층액을 분리한 후 사용할 수 있다.

상기와 같이 가수분해 과정을 통해 얻은 본 발명의 소라 내장 가수분해물은 히알루로니다아제(Hyaluronidase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다. 상기 히알루로니다아제는 피부 보습에 있어서 중요한 인자인 히알루론산(HA)의 글리코시드 결합을 가수분해하여 HA를 분해한다. 따라서 본 발명의 소라 내장 가수분해물은 히알루로니다아제 활성을 억제하여 피부의 보습을 유지 또는 강화하는 효능을 가진다.

또한 본 발명의 소라 내장 가수분해물은 피부에서 주름을 유발하는 효소인 엘라스타아제(Elastase)와 콜라게나아제(Collagenase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다. 피부에 있어서, 엘라스틴(elastin)은 진피층에 존재하여 다른 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 단백질들과 가교결합을 형성하고 있기 때문에 엘라스틴의 분해는 주름의 생성과 아주 밀접한 관계가 있다. 상기 엘라스타아제는 엘라스틴을 분해하는 효소들 중 하나로, 엘라스틴을 포함하여 콜라겐(collagen)과 다른 ECM 단백질을 비특이적으로 분해하는 효소이며, 주름을 생성하는 직접적인 원인 중 하나로 지목되고 있다. 더불어 콜라겐은 ECM 전체의 90%를 차지하여 피부의 강도와 형태를 유지하는 역할을 담당한다. 특히 콜라겐은 엘라스틴을 포함한 다양한 ECM 단백질과 가교결합을 형성하고 있기 때문에 콜라겐이 분해되면 상호 간의 가교결합이 끊어지고 진피층의 부피가 줄어들어 그 부분에 주름이 발생한다. 뿐만 아니라 이를 통해 엘라스틴도 제 기능을 잃어 피부의 탄력성이 감소하게 된다. 따라서 본 발명의 소라 내장 가수분해물은 엘라스타아제와 콜라게나아제의 활성을 모두 억제할 수 있어, 피부의 탄력 감소 방지, 피부 주름 개선, 주름 발생 방지에 있어 탁월한 효능을 가진다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 소라 내장 가수분해물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 보습 유지, 강화 또는 주름 개선용 성분을 비롯하여 피부 상태 개선에 도움을 주는 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 성분은 히알루론산, 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol), 글리세린(Glycerin), 아미노산(amino acid), 트레할로스(trehalose), 코지산(kojic acid) 및 이의 유도체, 알부틴(arbutin), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 이의 유도체, 하이드로퀴논(hydroquinone) 및 이의 유도체, 레조르시놀(resorcinol), 2,7-디니트로인다졸(2,7-dinitroindazole), 아데노신(adenosine), 레티놀(retinol), 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate), 폴리에톡실레이티드레틴아마이드(polyethoxylated retinamide), 효모, 다이펩타이드(dipeptide), 팔미토일 올리고펩타이드(Palmitoyl oligopeptide) & 팔미토일 테트라펩타이드-7(Palmitoyl Tripeptide-7), 아세틸 헥사펩타이드(acetyl hexapeptide), EGF(epidermal growth factor) 또는 덩굴귤, 쌀, 감초, 시어버터, 알로에 베라, 코코넛, 올리브, 아보카도와 같은 식물 추출물 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 포함하는 팩을 제공한다.

상기 팩은 마스크(mask)팩, 수면팩, 클렌징(cleansing)팩, 워시 오프 팩(wash off) 및 필 오프(peel off) 팩 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조된 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다.

또한, 본 발명은 소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 소라 내장 가수분해물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 소라 내장 가수분해물을 알레르기 개선 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면,스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 소라 내장 가수분해물을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 소라 내장 가수분해물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들어 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 80 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명의 소라 내장 가수분해물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 소라 가수분해물 제조

소라(Turbo cornutus)는 제주 서귀포시 태흥리 어촌계에서 구입하였으며, 암수별 육과 내장을 분리하여 동결건조한 후 곱게 갈아 사용하였다.

동결건조하여 곱게 분말화한 소라 암수별 내장과 육을 각각 10g씩 취한 뒤, 500mL 증류수에 섞고, 알칼라아제(Alcalase, 2.4 L FG, 2.4 U/g, Novozyme Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)의 최적 활성 조건(pH 8, 50℃)에서 1%(w/w)의 기질 대 효소비로 24시간 동안 효소 가수분해를 수행하였다. 가수분해 반응 후 효소 불활성화를 위해 95~100℃에서 10분간 끓이고, 원심분리(3,200 rpm, 30분) 및 감압여과를 수행하여 상층액을 분리한 후 이를 동결건조하여 실험에 사용하였다. 암수별 소라 내장 알칼라아제 가수분해물은 TVAH(T. cornutus viscera alcalase hydrolysate)-Female과 TVAH-Male, 암수별 소라 육 알칼라아제 가수분해물은 TMAH(T. cornutus muscle alcalase hydrolysate)-Female과 TMAH-Male로 각각 명명하였으며, 각 가수분해물의 수율은 아래의 식에 따라 계산하여 도 1에 나타내었다.

[수학식]

추출 수율(%) = (추출 후 시료 무게/최초 시료 무게) ×100

도 1에 나타낸 바와 같이, 소라 내장 가수분해물의 경우, TVAH-Female과 TVAH-Male의 수율은 약 65%로 나타났고, 소라 육 가수분해물의 경우, TMAH-Female과 TMAH-Male의 수율은 약 80 ~ 90%인 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 암수별 추출 수율의 차이는 크지 않지만, 부위별 추출 수율에는 10 ~ 20% 정도의 차이가 있음을 확인하였다.

실시예 2. 항산화능 확인

상기에서 제조한 가수분해물의 항산화능을 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하여 도 2에 나타내었다. 특히 TVAH-Female의 라디칼 소거 활성을 별개로 도 3에 나타내었다. 각 시료 20 μl와 0.15 mM DPPH 용액 180 μl를 첨가하여 혼합하고 실온에서 30분간 반응 시킨 후, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군(Positive control)으로서 아스코르브산(Ascorbic acid)를 사용하였다.

1 mg/ml의 농도에서 TVAH와 TMAH의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 도 2와 같이, TVAH-Female과 TVAH-Male은 각각 90.95±1.21%, 89.25±1.55%로 나타났고, TMAH-Female과 TMAH-Male은 각각 33.11±4.80%, 28.33±1.85%로 나타났다. 이 결과를 통해 암수간의 차이는 크지 않지만, TMAH보다 TVAH가 2배 이상의 우수한 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 도 3에 나타낸 바와 같이, TVAH-Female는 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/ml의 농도에서 유의적으로 증가하는 효능을 나타났으며, 0.557±0.043mg/ml의 IC50 값을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 3. 히알루로니다아제(Hyaluronidase)에 미치는 영향 확인

HA은 인체의 ECM을 구성하는 대표적인 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 중 하나이다. 대부분의 경우 많은 양의 물과 결합한 겔 상태로 고분자 형태를 하고 있다. 피부에 다량 존재하여 피부의 유연성 또는 보습뿐만 아니라 세균 등의 피부 침투를 막는 데에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이에 따라 히알루로니다아제 저해제는 HA의 고분자 형태를 유지할 수 있으므로 이에 따른 피부보습 효과를 기대할 수 있다.

히알루로니다아제 저해 활성을 확인하기 위하여 먼저 상기 10 μl의 완충액(0.1 M 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 3.6))과 시료에 각각 10 μl의 히알루로니다아제(8 mg/ml)를 혼합하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이어, 20 μl의 12.5 mM CaCl₂를 처리하여 37℃에서 20분간 다시 반응시켰다. 이후, 50 μl의 2.4 μg/ml HA를 처리하여 37℃에서 40분간 반응시켰다. 다음으로, 2 μl의 0.4 N NaOH와 20 μl의 0.4 N 사붕산칼륨(potassium tetraborate)을 순서대로 처리하여 100℃에서 3분간 배양하여 반응을 종료시켰다. 최종적으로 600 μl의 디메틸아민붕소(DIMETHYLAMINE-BORANE, DMAB) 용액(0.4 g의 DMAB를 35ml의 100% 아세트산, 5 ml의 10 N HCl에 녹인 용액)을 처리하여 37℃에서 20분간 발색시킨 후, 585 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로서 히알루론산 분해효소로 알려진 크로모크릭산2나트륨(Disodium cromoglycate, DSCG)을 사용하였다.

1 mg/ml의 농도에서 TVAH와 TMAH의 히알루로니다아제 저해 활성을 측정한 결과 도 4와 같이, TVAH-Female과 TVAH-Male은 약 29~35%, TMAH-Female과 TMAH-Male은 약 15%로 나타났다. 이로부터 TVAH-Female은 TMAH-Male보다 약 20% 증가한 효능을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한 도 5와 같이, TVAH-Female는 0.5, 1, 2, 4 mg/ml의 농도에서 유의적으로 증가하는 효능을 나타내었으며, 2.87±0.05 mg/ml의 IC50 값을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4. 엘라스타아제(Elastase)에 미치는 영향 확인

피부의 엘라스틴(elastin)은 진피층에 존재하여 다른 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 단백질들과 가교결합을 형성하고 있기 때문에 엘라스틴의 분해는 주름의 생성과 아주 밀접한 관계가 있다. 엘라스틴을 분해하는 효소들 중 하나인 엘라스타아제는 엘라스틴을 포함하여 콜라겐(collagen)과 다른 ECM 단백질을 비특이적으로 분해하는 효소이며, 주름을 생성하는 직접적인 원인 중 하나로 지목되고 있다. 상기 엘라스타아제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다. 1.015 mM N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-나이트로아닐린( N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide(0.12M Tris-HCl buffer(pH 8)))을 엘라스타아제의 기질로서 활용하였다. 먼저, 10 μl의 시료를 130 μl의 기질과 혼합하여 25℃에서 10분간 반응시키고, 10 μl의 0.0375 unit/ml 엘라스타아제를 추가하여 다시 25℃에서 10분간 반응시켰다. 이 후, 반응 생성된 p-나이트로아닐린의 양을 410 nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 계산하였다. 이때 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 양성대조군으로 사용하였다. 2 mg/ml의 농도에서 TVAH와 TMAH의 히알루로니다아제 저해 활성을 측정한 결과 도 6과 같이, TVAH-Female과 TVAH-Male은 각각 74.16±0.08%, 72.24±4.88%로 나타났고, TMAH-Female과 TMAH-Male은 각각 30.86±4.57%, 35.48±5.81%로 나타났다. 이 역시 암수간의 차이는 크지 않지만, TMAH보다 TVAH가 우수한 효능을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한 도 7에 나타낸 바와 같이, TVAH-Female는 0.5, 1, 2, 4 mg/ml의 농도에서 유의적인 저해 효능을 나타내었으며, 1.96±0.01 mg/ml의 IC50 값을 나타내었다. 내장의 경우, 대부분 잘 사용되지 않는 소재이기 때문에 육보다 추출 수율이 다소 낮으나 효능이 우수한 점에 따라 활용도가 더 높다고 할 수 있다. 따라서 이후의 실험은 TVAH-Female을 유효추출물로 선정하여 진행하였다.

실시예 5. 콜라게나아제(Collagenase)에 미치는 영향 확인

피부의 진피층에는 콜라겐(collagen), 엘라스틴, HA, 피브로넥틴(fibronectin) 등 다양한 ECM 단백질이 존재한다. 그 중에서도 콜라겐은 ECM 전체의 90%를 차지하여 피부의 강도와 형태를 유지하는 역할을 담당한다. 특히 콜라겐은 엘라스틴을 포함한 다양한 ECM 단백질과 가교결합을 형성하고 있기 때문에 콜라겐이 분해되면 상호 간의 가교결합이 끊어지고 진피층의 부피가 줄어들어 그 부분에 주름이 발생한다. 또한 엘라스틴도 제 기능을 잃어 피부의 탄력성이 감소한다. 따라서 본 발명의 가수분해물이 콜라게나아제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 아조 다이-침지형 콜라겐(Azo dye-imprengnated collagen)을 기질로서 활용하였다. 먼저, 1 mg의 기질을 800 μl의 완충액(0.1 M Tris-HCl 버퍼(pH 7.0))에 녹이고, 100 μl의 시료와 100 μl의 200 unit/ml 콜라게나아제 타입 I(collagenase type I)을 혼합하여 43℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어, 반응물을 3000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤, 상층액을 취하여 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며 이때, 양성 대조군으로서 EGCG를 사용하였다. TVAH-Female의 콜라게나아제 저해 활성을 측정한 결과 도 8과 같이, 2, 4 및 10 mg/ml의 농도에서 유의적인 저해 효능을 나타내었으며, 9.13±0.00 mg/ml의 IC50 값을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 6. 세포 독성 확인

더불어 본 발명의 가수분해물의 세포 독성을 확인하였다. 이를 위해 피부각질세포(epithelial keratinocyte cell)인 HaCaT을 미국 ATCC로부터 분양받아 사용하였으며, HaCaT 세포는 DMEM 배지(Dulbecco’Modified Eagle Medium)에 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)과 1% 항생제(antibiotics)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. HaCaT에서의 TVAH-Female의 세포독성은 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide) 분석을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에 HaCaT을 1×10⁵ cells/ml로 분주한 뒤 16시간 동안 배양한 후, TVAH-Female을 50, 100, 200, 400 또는 800 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이 후 MTT 용액(50 μl, 2 mg/mL)을 가하고 37℃에서 4시간 더 배양하였다. 이 후, 상층액을 제거한 뒤 포마잔 결정(formazan crystal)을 DMSO에 녹인 후 540 nm에서 마이크로플레이트 리더기로 흡광도를 측정하였다. TVAH-Female의 세포독성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 그 결과 도 9와 같이, 50, 100, 200 및 400 μg/ml의 농도 범위에서 유의적인 독성이 나타나지 않았다. 따라서 상기 농도 범위에서 생물학적으로 안전한 물질이라고 판단하였다.

실시예 7. 세포 생존률에 미치는 영향 확인

더불어 산화적 스트레스를 유발시킨 세포의 생존률과 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 생성에 있어서, 본 발명에 따른 가수분해물의 효과를 확인하였다.

2,2'-아조비스(2-아미디노프로페인) 다이하이드로클로라이드( 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, AAPH)를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 HaCaT에 TVAH-Female의 세포 보호효과를 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에 HaCaT을 1×10⁵ cells/ml로 분주한 뒤 16시간 동안 배양한 후, TVAH-Female을 농도별로 처리하였다. 1시간 뒤 10 mM AAPH를 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 이 후 MTT 용액(50 μl, 2 mg/mL)을 가하고 37℃에서 4시간 더 배양하였다. 이 후, 상층액을 제거한 뒤 포마잔 결정을 DMSO에 녹인 후 540 nm에서 마이크로플레이트 리더기로 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 백분율로서 산화적 스트레스에 대한 TVAH-Female의 효능을 도 10에 나타내었다.

또한 AAPH를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시킨 HaCaT에서의 ROS 생성에 대한 TVAH-Female의 효능을 측정하기 위하여 DCF-DA(2‘’diacetate) 분석을 수행하였다. 96-웰 플레이트에 HaCaT을 1×10⁵ cells/ml로 분주한 뒤 16시간 동안 배양한 후, TVAH-Female를 농도별로 처리하였다. 30분간 배양한 뒤, 10 mM AAPH를 처리하고 다시 30분 간 배양하였다. 이 후 500 μ의 DCF-DA 용액을 첨가하여 10분동안 추가 배양하였다. 이 후 형광분광광도계를 이용하여 485 nm와 528 nm에서 형광분광도를 측정하였다. 대조군에 대한 백분율로서 TVAH-Female의 ROS 생성 억제 활성을 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, HaCaT에 AAPH를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 정상 대조군과 비교하여 생존율이 약 40%로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 100, 200 또는 400 μg/ml의 TVAH-Female를 처리할 경우, AAPH에 의해 감소한 생존율이 유의적으로 증가된 것을 확인하였다. 또한 도 11과 같이, HaCaT에 AAPH를 처리한 경우 정상 대조군과 비교하여 ROS 생성이 8배 가량 증가하였으나 TVAH-Female를 처리함에 따라 ROS 생성량이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 8. HA 합성 촉진 효과 확인

다음으로 HaCaT에서 TVAH-Female의 HA 합성 촉진 효과를 평가하였다. 6-well plates에 HaCaT을 1×10⁶ cells/well로 분주하여 배양하였다. 고밀도 형태로 증식한 세포에 FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체한 후 TVAH-Female를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 회수한 후, 제조사의 매뉴얼에 따라 ELISA(R&D System, Inc. MN, USA) assay를 수행하여 hyaluronic acid의 생성량을 측정하여 도 12에 나타내었다. 그 결과, TVAH-Female은 50, 100, 200, 400 μg/ml의 농도로 처리한 군에서 대조군에 비해 HA의 생성량이 증가한 것으로 나타났으며, 특히 100, 200 및 400 μg/ml의 농도에서 유의적인 증가 효과를 나타내었다.

실시예 9. HA 합성효소(Hyaluronic acid synthase, HAS) 및 히알루로니다아제에 미치는 효과 확인

한편 HAS는 세포막에 존재하여 글루쿠론산(glucuronic acid)과 N-아세틸-글루코사민(N-acetyl-glucosamine) 구성단위들을 교대로 배열하여 β-1,3 결합을 할 수 있도록 매개하여 HA를 합성한다. HAS는 HAS1, HAS2 및 HAS3으로 구분할 수 있는데 HAS1과 HAS2는 2 내지 4×10⁶ Da 크기의 HA를 생성하고 HAS3은 0.4~2.5×10⁵ Da 크기의 HA를 형성한다고 알려져 있다. 또한 히알루로니다아제는 HA의 글리코시드 결합을 가수분해하는 역할을 하여 HA를 분해한다. 따라서 이를 기반으로 TVAH-Female의 HAS2 및 히알루로니다아제(Hyaluronidase-2, HYAL2) 발현에 미치는 영향을 평가하였다.

HaCaT에서 히알루로난(hyaluronan) 생성과 관련된 단배질의 발현을 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인하였다. 즉, TVAH-Female을 처리하여 배양한 HaCaT을 회수한 후, 얼음으로 차갑게 유지한 용해 버퍼(lysis buffer(20 mM Tris, 5 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 1% NP-40, 10 mg/ml aprotinin, 10 mg/ml leupeptin, 1 mM PMSF))를 넣고 볼텍싱(vortexing)을 반복하여 용해물(lysate)을 제조한 후, 이를 12,000×4℃에서 20분 간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 그런후 BCA(Bicinchoninic acid) 키트를 이용하여 상기 상층액으로부터 단백질을 정량하였다. 40μg의 단백질을 취하여 황산도데실나트륨-폴리아크릴아마이드 겔(sodiumdodecylsulfate(SDS)-polyacrylamide gel)에 전기영동한 후, 나이트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 단백질을 전이하였다. 비특이적인 단백질 결합 부분은 5% 무지방 분유(non fat dry milk)가 함유된 TBST(25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2.65 mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4)에 2시간 동안 반응시켜 블록킹(blocking)하였다. 이후, 멤브레인에 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 약 12시간동안 반응시킨 후, TBST로 10분간 3번 세척하였다. 그런 다음 2차 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 다시 TBST로 10분간 3번 세척하였다. 최종적으로 ECL(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블롯 검출 키트(western blot detection kit)을 사용하여 효소 반응에 의한 발광을 통해 표적 단백질의 발현을 측정하였다.

그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이, TVAH-Female을 50, 100, 200 및 400 μg/ml의 농도로 처리한 실험군의 경우 대조군에 비해 HAS2의 발현양이 증가한 것으로 나타난 반면, 동일한 농도에서 대조군에 비해 HYAL2의 발현은 감소시킨 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 소라 내장 가수분해물은 히알루론산 합성을 촉진하는 한편, 히알루론산저해효소인 히알루로니다아제의 발현과 활성을 저해하는 것을 알 수 있었다.

종합적으로 본 발명은 소라 내장 가수분해물의 피부 보습 유지 및 강화, 피부 주름 개선 효과를 확인한 것으로, 상기 소라 내장 가수분해물은 항산화능과 더불어 히알루로니다아제, 엘라스타아제 및 콜라게나아제 저해 활성을 보유하고 있으며, 세포 독성이 없고 산화적 스트레스를 유발한 피부각질세포에 처리할 시 세포의 생존율을 증가시키고, ROS 생성량을 감소시키며 히알루론산 합성 촉진 효과를 보였으므로, 이를 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Claims

소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 소라 내장 가수분해물은 소라 내장을 알칼라아제(Alcalase)로 가수분해하여 수득한 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 가수분해는 pH 6 내지 10 및 30 내지 70℃의 조건에서 12시간 내지 48시간 동안 수행된 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 소라 내장 가수분해물은 히알루로니다아제(Hyaluronidase)의 활성을 억제하여 피부 보습을 유지 또는 강화하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 소라 내장 가수분해물은 엘라스타아제(Elastase), 콜라게나아제(Collagenase) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 활성을 억제하여 피부 주름을 개선하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1항에 따른 화장료 조성물을 포함하는 팩.
제 6항에 있어서,
상기 팩은 마스크(mask)팩, 수면팩, 클렌징(cleansing)팩, 워시 오프 팩(wash off) 및 필 오프(peel off) 팩 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조된 것을 특징으로 하는 팩.
소라 내장 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물.