KR102254208B1 - 효소촉매 리파제로 제조된 제주 천연오일 유래의 유사세라마이드 복합체 및 이를 포함하는 기능성 화장품 원료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모를 이용하여 재조합 고분비 생산된 고활성 리파제(CalB1422-L278L)를 이용하여 저온추출 제주 천연오일 3종(우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일)으로부터 유사세라마이드 복합체를 인체 친화적 효소방법으로 제조하는 방법과 이를 통해 제조된 유사세라마이드 복합체의 화장품 원료로서의 기능에 관한 것이다.

Description

효소촉매 리파제로 제조된 제주 천연오일 유래의 유사세라마이드 복합체 및 이를 포함하는 기능성 화장품 원료{Synthetic pseudo-ceramide complex derived from Jeju natural oil prepared by enzyme catalyst lipase and functional cosmetic raw material including the same}

본 발명은 효모를 이용하여 재조합 고분비 생산된 고활성 리파제(CalB1422-L278L)를 이용하여 저온추출 제주 천연오일 3종(우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일)으로부터 유사세라마이드 복합체를 인체 친화적 효소방법으로 제조하는 방법과 이를 통해 제조된 유사세라마이드 복합체의 화장품 원료로서의 기능에 관한 것이다.

피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3개의 층으로 구성되어 있는데, 이중 표피는 가장 외부에 존재하여 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 피부미용 면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있다. 표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질이다. 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하며 유해물질로부터 피부를 보호, 체내 물질의 유출 방지 및 피부 수분 증발 방지하는 중요한 기능을 한다.

피부지질은 각질세포(corneocytes)간의 공간을 채우고 있으며 주로 세라마이드(40~65%), 콜레스테롤(10%) 및 유리지방산(25%)으로 구성되어 있으며 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재한다(Human Skin-identical Ceramides 2000; 한국미용학회지, 2002). 이러한 지질들은 각질세포 사이에 존재하여 수분의 증발을 방지하고, 외부 자극이나 오염으로부터 피부를 보호하는 피부장벽의 기능을 수행한다. 이중 세라마이드는 피부지질의 주성분으로서 함량이 감소하게 되면, 수분증발이 증가하고 아토피 등 다양한 피부질환이 악화되며 피부의 노화가 진행되지만 외부로부터 세라마이드를 보충하면 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Imokawa 등, J. Invest. Dermatol. 1991; Melinik 등, Arch. Dermatol. Res. 1990).

화장품 산업에서 필요한 천연 세라마이드는 주로 동물의 신경조직(뇌, 척수 등)에서 추출하여 사용되었으나, 현재는 광우병등의 안전성에 대한 우려로 인하여 화장품 원료로서는 사용이 불가능하다. 상업화된 합성 세라마이드는 효모 파이토스핑고신을 발효를 통해 생산하고 추가적인 화학 합성을 통해 세라마이드 3(ceramide III)와 세라마이드 4(ceramide IV)가 에보닉사와 두산에서 제조, 시판되고 있으나 합성세라마이드는 생산단가가 매우 높고 실제 피부에 존재하는 다양한 세라마이드를 완벽하게 대체하기 힘든 문제가 있다. 따라서 생산단가가 저렴하고 다양한 형태의 유사세라마이드(pseudo-ceramide)들이 화학합성법으로 제조되어 시판되고 있으며 기능적으로도 기존 세라마이드와 유사한 특성을 보이는 것으로 보고되었다(대한민국 특허 10-1051812; 10-1338237; 10-1545527; 10-1641702).

현재 세라마이드 및 유사세라마이드의 제조방법은 대부분 화학촉매 방법으로 반응온도가 고온이며 유해한 유기용매의 사용 등 인체 및 환경친화적이지 못한 문제가 있다. 이러한 문제를 극복하기 위한 방안으로 효소 리파제를 사용한 상온에서의 유사세라마이드의 제조법이 알려져 있다(Bakke 등, J. Org. Chem. 1998; Couturier 등, J. Mol. Caltal. B. 2009; US Patent 5610040A, 1997; Joubioux 등, J. Mol. Cat. 2014; Yvergnaux F, OCL. 2017). 효소를 이용하는 방법은 주로 상온에서 진행되고 유독한 유기용매를 사용하지 않고 제조가능한 장점이 있지만 고가의 상용효소(Novozym435)의 사용으로 인해 생산단가가 매우 높고 경제성이 결여된 문제가 있다(Kim, 한국피부장벽학회지 2018).

따라서 본 발명에서는 효모를 이용하여 재조합 고분비생산된 고활성 변이리파제(CalB1422-L278L)를 이용하여 저온추출된 제주 천연오일 3종으로부터 유사세라마이드를 인체 친화적인 방법인 효소방법으로 저가 생산하였으며 제조된 유사세라마이드 복합체의 기능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 a) 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기질, 아미노알코올(amino alcohol) 및 유기용매의 혼합물과 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체를 첨가하여 1차 효소 반응시키는 단계; 및 b) 상기 반응물, 불포화 지방산 및 유기용매의 혼합물과 상기 CalB의 변이체를 첨가하여 2차 효소 반응시키는 단계;를 포함하는, 유사세라마이드 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 유사세라마이드를 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 a) 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기질, 아미노알코올(amino alcohol) 및 유기용매의 혼합물과 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체를 첨가하여 1차 효소 반응시키는 단계; 및 b) 상기 반응물, 불포화 지방산 및 유기용매의 혼합물과 상기 CalB의 변이체를 첨가하여 2차 효소 반응시키는 단계;를 포함하는, 유사세라마이드 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, "유사세라마이드(pseudo-ceramide)"란, 천연 세라마이드의 단점을 보완하고 상용화가 가능한 천연 유래의 세라마이드를 모방한, 개선된 물성과 성질을 갖는 세라마이드를 의미한다. 세라마이드는 피부 각질층을 구성하는 각질세포 간 지질의 많은 부분을 차지하는 구성성분으로서 수분증발을 억제하고 각질층의 구조을 유지하는 기능을 한다. 각질층에서 세라마이드의 함량이 감소하게 되면, 수분증발이 증가하고 다양한 피부질환이 악화되는 것으로 알려져 있으며 또한 피부의 노화가 진행되거나 외적인 자극에 의해 각질층 내의 세라마이드 함량이 감소하면 외부에서 세라마이드를 보충하여 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 천연으로부터 세라마이드를 함유하는 다양한 동식물에 대한 연구가 진행되었으나 천연 세라마이드는 추출의 어려움 등으로 대량 생산이 어렵고 원료가 고가인 점이 상용화하기에는 부적합하다. 이뿐만 아니라 천연 세라마이드는 화장품에 사용되는 여러 가지의 용매에 대한 용해도가 낮아서 제품을 만들 때 사용할 수 있는 양이 제한되어 있어서 효능을 나타내는데 한계가 있다. 이에, 유사세라마이드는 천연세라마이드의 단점을 보완하여 제조된 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유사세라마이드는 유사세라마이드 단독 또는 복합체의 형태일 수 있으며, 상기 유사세라마이드 복합체는 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일 3종을 모두 포함하는 혼합물을 기질로 하고 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체로 효소 반응시킴으로써 생산되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "CalB"는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제를 의미한다. 리파제는 지방(triacylglyceride)을 지방산(fatty acid)과 글리세롤(glycerol)로 분해하는 효소로, 자연계에 존재하는 기질의 다양성으로 인해 리파제는 매우 광범위한 기질 특이성을 갖도록 진화하였고 지방 분해(hydrolysis) 뿐만 아니라 에스터화 반응(esterification), 산분해(acidolysis), 에스터 교환(interesterification, transesterification), 아미노분해(aminolysis), 과가수분해(perhydrolysis) 등의 기능을 보유한 것으로 알려져 있다. 리파제 중에서도 칸디다 안타티카 유래의 CalB는 의약품 및 정밀 화학제품의 합성에 가장 많이 사용되는 효소이다.

본 발명에 있어서, 상기 CalB는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열(the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.

예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.

또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.

상기 '다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 즉, 야생형 CalB의 아미노산 서열의 80번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌 및 219번째 위치에 상응하는 아미노산인 류신 중 어느 하나 이상이 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이라면 제한되지 않으며, 구체적으로 80번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알지닌(Arg, R), 리신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 글루탐산(Glu, E), 아르파르트산(Asp, D), 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 시스테인(Cys, C), 티로신(Tyr, Y), 아스파라긴(Asn, N) 또는 글루타민(Gln, Q) 중 어느 하나로 치환된 것일 수 있고, 219번째 위치에 상응하는 아미노산인 류신이 알지닌(Arg, R), 리신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 글루탐산(Glu, E), 아르파르트산(Asp, D), 글리신(Gly, G), 알라닌(Ala, A), 발린(Val, V), 이소류신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 시스테인(Cys, C), 티로신(Tyr, Y), 아스파라긴(Asn, N) 또는 글루타민(Gln, Q) 중 어느 하나로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 CalB 변이체는 야생형 CalB의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환; 및 219번째 아미노산인 루이신이 글루타민으로 치환; 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.

본 발명에서 용어 "상응하는 위치(corresponding position)"는, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 발명에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.

본 발명에서, 본 발명에 사용되는 단백질 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 단백질과 본 발명의 단백질의 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써, 본 발명의 단백질의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.

본 발명에서 제공하는 CalB의 변이체는, 상기에서 설명한 CalB 활성을 갖는 단백질 중 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, CalB 활성이 변이 전 단백질 대비 증가된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 CalB의 변이체를 포함하는 미생물의 경우, CalB의 가수분해(hydrolysis), 에스터 반응(esterification) 및 아미노화 반응(amidation) 활성이 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 내재적 CalB의 활성에 비해 증가할 수 있다. 이는 야생형 미생물이 상기 CalB 활성을 나타내지 못하거나, CalB 활성을 나타내더라도 미미한 활성을 나타내는 것에 반해, 본 발명의 CalB의 변이체를 통해 CalB 활성을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 야생형 CalB의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산닌이 알라닌으로 치환되고 219번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 CalB1422-L278L은 CalB1422-278 변이체 6종(L278L, L278G, L278A, L278Y, L278D, L278H) 중에서 가장 우수한 지방산 아미드의 생성과 우도땅콩오일의 소모를 나타내었다(도 4).

본 발명에 있어서, 야생형 CalB의 아미노산 서열에서 80번째 아미노산이 알라닌으로 치환; 및 219번째 아미노산이 글루타민으로 치환; 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 CalB의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 80번째 및/또는 219번째 위치에 상응하는 아미노산 중 선택된 하나 이상의 아미노산은 고정되고, 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 80번째 및/또는 219번째 위치에 상응하는 아미노산 위치 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.본 발명에 있어서, 상기 CalB의 변이체는 CalB의 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, CalB 변이형 폴리펩티드, CalB 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드, CalB 활성 변이체, CalB 변이체, 변이형 CalB 등과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화(Southern hybridization) 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 본 발명에 있어서, CalB의 변이체는 레진에 흡착하여 고정화되어 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 레진은 효소 고정화에 사용되는 레진이라면 특별히 제한되지 않으나, 아크릴레진일 수 있다. 또한, 상기 CalB의 변이체는 레진 중량 1 g당 20 내지 30mg, 구체적으로는 레진 중량 1 g당 25 mg으로 고정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 레진 고정화 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "우도땅콩"은 한국 우도에서 재배된 땅콩을 의미한다. 땅콩(Arachis hypogaea L., Peanut)은 콩과 땅콩속(Arachis)의 1년생 초본성이다. 열대원산의 고온성 여름작물로서, 한국, 인도, 중국, 미국, 아프리카, 인도네시아, 미얀마, 태국 등지에 분포하고 있다. 가지가 곧게 서는 직립형, 지면 가까이 옆으로 퍼지는 포복형 그리고 반직립형으로 분류된다. 종실의 기름함량은 일반적으로 생육온도가 높을수록 증가하는 경향이 있다.

본 발명에서 용어, "동백(Camellia japonica L., Camellia oil)"은 바닷가에 자라는 상록활엽 소교목이다. 한국, 중국, 일본 등지에 분포하고 있다. 동백은 꽃이 질 때 송이 째 떨어지는 특징을 지니며 꽃은 차로 이용한다. 과거에는 열매에서 기름을 짜서 동백기름이라 하여 머리를 치장하는데 귀한 재료로 쓰였다.

본 발명에서 용어, "비자"는 겉씨식물 구과목 주목과의 상록교목인 비자나무(Torreya nucifera, Torreya)의 열매로, 가을에 익은 열매를 따서 껍질을 벗겨 버리고 햇볕에 말려 사용한다. 비자는 맛은 달고 성질은 평하며, 기생충을 구제하고 대변이 잘 나오게 하며 기침을 멎게 하는 것으로 알려져 있다. 비자나무의 목재는 질이 좋기 때문에 각종 기구재, 특히 바둑판으로서 귀중한 재목이다. 기름을 짜서 식용하며, 공해에 강하므로 가로수로 적합하다. 한국(내장산), 일본 등지에 분포한다.

본 발명에 있어서, 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일은 우도땅콩, 동백 및 비자로부터 각각 추출된 기름을 의미한다. 상기 기름을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 착유법이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일은 일반적인 착유기를 이용한 착유법으로 추출할 수 있고, 구체적으로는 저온착유기를 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 기질은 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며 또는 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일 3종을 모두 포함하는 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 기질은 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 1:1:1의 중량비로 혼합한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 아미노알코올(amino alcohol)은 화장품 원료 제조에 사용될 수 있는 아미노알코올이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 3-아미노-1,2-프로판디올(3-amino-1,2-propanediol), 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol), 2-아미노-1-부탄올(2-amino-1-butanol), 1-아미노-2-프로판올(1-amino-2-propanol), 2-아미노-2-에틸-1,3-프로판디올(2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol), 2-아미노-2-에틸-1,3-프로판디올(2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol) 또는 2-아미노-1,3-프로판디올(2-amino-1,3- propanediol)일 수 있고, 구체적으로 3-아미노-1,2-프로판디올(3-amino-1,2-propanediol), 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol), 그리고 1-아미노-2-프로판올(1-amino-2-propanol)일 수 있고, 보다 구체적으로 3-아미노-1-프로판올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 7 종류의 아미노알코올(3-amino-1,2-propanediol, 3-amino-1-propanol, 2-amino-1-butanol, 1-amino-2-propanol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-1,3- propanediol)을 우도땅콩오일 대비 1:1의 몰비로 동일 부피의 용매(hexane)에 용해하고 실시예 4의 고정화 효소 10%(w/v)를 넣고 50℃에서 약 68시간동안 반응시킨 결과, 3-아미노-1,2-프로판디올, 3-아미노-1-프로판올, 그리고 1-아미노-2-프로판올의 아미노화 효율이 높음을 확인하고(도 6), 3-아미노-1-프로판올을 아미노알코올로서 사용하였다.

상기 a) 단계의 유기용매는 무극성용매:알코올을 1:0.5-1.5의 부피비로 혼합한 것일 수 있고, 구체적으로 1:1의 부피비로 혼합한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 무극성용매는 화장품 원료 제조에 사용될 수 있는 무극성용매라면 특별히 제한되지 않으나, 헥산(hexane)일 수 있다.

상기 알코올은 화장품 원료 제조에 사용될 수 있는 알코올이라면 특별이 제한되지 않으나, 예를 들면, 에탄올 또는 TAA(ter-amyl alcohol)일 수 있고, 구체적으로 TAA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 헥산은 TAA에 비해 끓는점이 낮아 반응 후 정제가 용이한 장점이 있으나 아미노알코올이 잘 용해되지 않는 문제가 있다. 이에, 이를 개선하기 위하여 헥산에 TAA를 혼합한 용매를 효소 반응에 이용하였으며, 본 발명의 일 구현예에서도 효소 반응시 용매로 헥산만을 사용한 경우, 우도땅콩오일의 소모속도가 매우 느리고 유사세라마이드 생성 역시 느린 반면, TAA 및 헥산 혼합 용매를 사용한 경우 우도땅콩오일의 소모속도가 빠르고 유사세라마이드의 생성 농도도 높음을 확인하였다(도 7).

상기 a) 단계의 CalB의 변이체와 기질, 아미노알콜 및 유기용매의 혼합물은 1:15 내지 25의 중량비로 첨가하는 것일 수 있고, 구체적으로 1:20의 중량비로 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1차 효소 반응은 40 내지 60℃에서 40 내지 70시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 구체적으로 50℃에서 40 내지 48시간 동안 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 반응물은 a) 단계에서 반응되지 않은 잔여 지방산 아미드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 b) 단계의 불포화 지방산은 화장품 원료 제조에 사용될 수 있는 불포화 지방산이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 올레산(oleic acid), 리놀렌산(Linolenic acid), 스테아리돈산(Stearidonic acid), 아이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid), 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid), 리놀렐아이드산(Linolelaidic acid). 아라키돈산(Arachidonic acid), 도코사테트라엔산(Docosatetraenoic acid), 팔미토레산(Palmitoleic acid), 센산(Vaccenic acid), 폴린산(Paullinic acid), 엘라이드산(Elaidic acid), 곤도산(Gondoic acid), 에루스산(Erucic acid) 또는 네르본산(Nervonic acid)일 수 있고, 구체적으로 올레산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 b) 단계의 상기 유기용매는 무극성용매일 수 있고, 화장품 원료 제조에 사용될 수 있는 무극성용매라면 특별히 제한되지 않으나, 헥산(hexane)일 수 있다.

상기 b) 단계의 CalB의 변이체와 반응물, 불포화 지방산 및 유기용매의 혼합물은 1:15 내지 25의 중량비로 첨가하는 것일 수 있고, 구체적으로 1:20의 중량비로 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 2차 효소 반응은 40 내지 60℃에서 40 내지 70시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 구체적으로 50℃에서 60시간 동안 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 전술한 바와 같이 2 단계의 효소 반응을 통해 유사세라마이드를 제조한다. 2 단계의 효소 반응이 아닌 단일 단계로 효소 반응할 경우, 기질인 우도땅콩오일의 몰수보다 아미노알코올의 몰수가 높으면 유사세라마이드의 전환율이 낮아지고, 아미노알코올과 우도땅콩오일의 몰수가 동일하면 미반응 디글리세리드(Diglyceride, DG)와 모노글리세리드(Monoglyceride, MG)가 잔류하며(도 10), 우도땅콩오일의 몰수가 아미노알코올보다 1.5배 높은 경우에도 미반응 지방산아미드가 60% 이상 잔류하는 바(도 11), 1 단계 효소 반응에서 미반응 지방산아미드가 잔류하는 문제를 해결하고 유사세라마이드 전환 수율을 높이기 위하여 2단계 반응을 시도하였다(도 12). 그 결과, 도 13과 같이 2차 반응에서 지방산 아미드가 대폭 줄고 유사세라마이드의 생성량이 증가하여 최종 80% 이상의 유사세라마이드가 제조된 것을 확인하였다.

즉, 본 발명은 CalB 활성을 증가시킨 CalB 변이체를 사용하여 2 단계의 효소 반응을 수행함으로써 유사세라마이드를 고수율로 제조하는 것에 의의가 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 유사세라마이드 생산방법으로 제조된 유사세라마이드를 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

여기에서 사용된 용어는 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 유사세라마이드는 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말 형태 또는 액상 형태로 0.001 ~ 1 중량%, 0.001 ~ 0.8 중량%, 0.001 ~ 0.6 중량%, 0.001 ~ 0.4 중량%, 0.001 ~ 0.2 중량%, 0.001 ~ 0.1 중량%, 0.001 ~ 0.05 중량%, 0.001 ~ 0.03 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 구체적으로 0.001 ~ 0.016 중량%. 보다 구체적으로 0.001 ~ 0.008 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

상기 유사세라마이드는 인간 표피 각질 세포내 필라그린 생성량을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 유사세라마이드는 양성대조군인 레티노산에 비해 낮은 세포 독성을 나타내며, 세포내 필라그린 생성량이 기존에 공지된 보습용 화장품 원료의 일종인 세라마이드NP와 유사한 수준으로 증가하는 경향을 나타내는 바, 세라마이드NP만큼 보습 효과가 우수한 것을 확인하였다.

본 발명에서 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 유사세라마이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 글리세롤, 글리세린, 지방족 에스테르, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄세스퀴오레이드, 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 카르복시폴리머, 시토스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 콜레스테롤, 스테아레스-4, 디세틸포스페이트, 마카다미아 오일, 카르복시비닐폴리머, 산탄검 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 소디움히아루로네이트, 페녹시에탄올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다

본 발명의 방법에 따라 제조된 유사세라마이드 또는 유사세라마이드 복합체는 수분증발을 억제하고 각질층의 구조을 유지하는 기능을 나타낼 뿐만 아니라 상피 세포에서 케라틴 섬유에 결합하는 필라멘트 관련 단백질인 필라그린(Filaggrin) 생성능을 나타내는 바, 화장료 조성물로 활용할 수 있다.

도 1은 저온착유기이다.
도 2는 동백씨앗, 우도땅콩, 비자씨앗 착유 공정도이다.
도 3은 동백오일, 우도땅콩오일, 비자오일에 대한 지방산 조성표이다.
도 4는 CalB1422-L278 변이체별 중성지방 감소 및 유사세라마이드 생성 정도를 분석한 TLC 결과이다.
도 5는 유가식 발효를 통해 배지내로 분비된 CalB1422-L278L를 SDS-PAGE 및 활성분석 결과이다.
도 6은 아미노알코올별 중성지방 유사세라마이드 전환속도를 비교한 TLC 결과이다.
도 7은 유사세라마이드 전환반응용 용매 비교 결과이다.
도 8은 우도땅콩오일로부터 유사세라마이드를 제조하는 2단계 효소 반응 과정을 보여주는 도이다.
도 9는 우도땅콩오일로부터 유사세라마이드를 제조하는 1단계 반응 과정을 보여주는 도이다.
도 10은 기질 몰비에 따른 유사세라마이드 전환율을 비교한 TLC 결과이다.
도 11은 1단계 반응산물을 분석한 TLC 결과이다.
도 12는 우도땅콩오일로부터 유사세라마이드를 제조하는 2단계 반응 과정을 보여주는 도이다.
도 13은 2단계 반응을 통한 유사세라마이드 제조 및 전환율의 비교 결과이다.
도 14는 2단계 효소 반응을 통한 유사세라마이드 제조 공정도이다.
도 15는 우도땅콩오일로부터 유사세라마이드를 제조한 결과이다.
도 16은 동백오일로부터 유사세라마이드를 제조한 결과이다.
도 17은 비자오일로부터 유사세라마이드를 제조한 결과이다.
도 18은 3종 오일(우도땅콩오일, 동백오일, 비자오일)로부터 유사세라마이드 복합체를 제조한 결과이다.
도 19는 유사세라마이드 처리 후 인간 표피 각질 세포에서의 세포 생존력을 나타낸 도이다. 데이터는 용매 제어의 %로 나타내었다(평균 ± SD, * p <0.05, 유사세라마이드 및 세라마이드 NP vs. 용매대조군).
도 20은 유사세라마이드 처리 후 인간 표피 각질 세포내 필라그린 함량을 나타낸 도이다. 데이터는 용매 제어의 %로 나타내었다(평균 ± SD, * p <0.05, 유사세라마이드 및 세라마이드 NP vs. 용매대조군).

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

실시예 1. 제주오일 추출

사용된 제주산 식물은 동백씨앗, 우도땅콩, 비자씨앗이었다.

일반적인 기계적인 오일 착유법은 고온에서 볶은 후 유압식 착유방법을 이용하여 착유한다. 이는 오메가3와 같은 유효성분의 파괴시키는 단점이 있다. 저온착유법은 압착지점에만 열을 전달하는 방식인 엑스펠러 추출방법과 동일하게 추출하되, 추출 시 발생되는 열은 원물과 오일이 서로 분리되는 최소한의 온도인 50℃로 조절하여 착유한다. 동백씨앗, 우동땅콩, 비자씨앗의 껍질을 제거하고 씻은 후 건조시켜 사용하였으며, 저온착유기(도 1)를 이용하여 착유한 오일은 원심분리기를 이용하여 8000rpm, 4℃에서 1시간동안 불순물을 침전시킨 후 상층인 오일만 사용하였다(도 2).

실시예 2. 제주오일의 분석

제주 특화 천연오일 3종을 분석하기 위해, 자동주입기를 장착한 가스 크로마토그래피 시스템과 불꽃 이온화 검출기(Flame ionization detector, FID)를 사용하였다.

그 결과, 동백씨오일에서 불포화 지방산인 올레산(oleic acid)이 79.9%로 과반이상을 차지하고 있음을 확인하였다(도 3). 우도땅콩오일에는 불포화지방산인 리놀렌산(linoleic acid) 및 올레산이 43.2 %, 40 %로 각각 포함되어 있으며, 비자오일에서도 46.1 %, 34.2 %로 포함되어 있음을 확인하였다.

상기 결과를 통하여 각각의 천연오일에서 불포화 지방산이 과반이상을 차지하고 있어 기능성 원료로 개발 가능성이 높음을 알 수 있다.

실시예 3. 최적효소의 선별

유사세라마이드 생산용 최적의 효소 선정을 위하여 CalB1422(한국특허 제10-1460228호) 및 CalB1422-278 변이체 6종(L278L, L278G, L278A, L278Y, L278D, L278H) (한국특허출원 제10-2019-0110299호)을 이용하여 아미노화 (amidation) 반응효율을 비교하였다. 상기 CalB1422-278 변이체 6종 중 CalB1422- L278L의 경우 T80A 및 L219Q 변이만을 포함하였다. 기질로는 제주 특화 천연오일 3종 중 하나인 우도땅콩오일과 3-amino-1-propanol을 기질 몰비 2:1로 혼합하고, 각각의 효소는 기질 대비 5%(w/v)를 사용하여 50℃에서 약 66시간 반응하면서 시간대별로 생성되는 지방산 아미드와 소모되는 우도땅콩오일의 양을 GC(Gas chromatography)와 TLC(Thin-layer chromatography)를 통하여 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 L278L 및 L278A는 빠른 속도로 지방산 아미드의 생성과 우도땅콩오일의 소모속도를 나타내었으며 L278G와 L278H도 이와 유사한 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

상기 결과에 따라, 이후 유사세라마이드 생산용 효소로 CalB1422-L278L 변이체(서열번호 1)를 사용하였다.

실시예 4. 효소의 대량생산 및 고정화

CalB1422-L278L의 대량생산을 위해서 효모 Y2805(YGa-ST3-CalB1422- L278L) 균주를 5 L 발효조를 이용하여 유가식 발효 배양하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ YNB(0.67 % 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5 % 카사미노에시드, 2 % 글루코스) 배지에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지(2 % 포도당, 3 % 효모추출물, 1.5 % 펩톤)에서 배양하여 활성화하고 1.8 L의 본 배양액(2 % 포도당, 3 % 효모추출물, 1.5 % 펩톤)에 접종하여 30℃에서 발효하였다. 배양 중 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30 % 포도당, 15 % 효모 추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 45 시간 동안 발효하였다. 배양 중 세포의 성장 정도는 시간 별로 시료를 취하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고 배지에 분비 생산된 리파제의 양과 활성을 SDS-PAGE와 pNPP(p-nitrophenyl palmitate)법으로 분석하였다.

그 결과, 분비 생산된 단백질의 양은 630 mg/L 였으며 배양상등액의 리파제 활성은 78,300 U/L의 값을 나타내었다.

생산된 리파제를 회수하고 레진에 고정화하기 위하여 6000 rpm으로 20 분간 원심분리한 후 0.1 ㎛ 크기의 여과막을 통과시켜 균체를 완전히 제거하였다. 회수한 배양상등액은 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)를 반복적으로 첨가하여 한외여과(분자량 30kDa 컷-오프) 막을 통과시키는 방법으로 배양액을 농축하였다. 단백질의 고정화는 아크릴레진(Lewatit VP OC 1600, Lanxess)에 흡착하는 방법을 이용하였다. 고정화는 레진 중량 1 g당 25 mg의 단백질을 사용하였으며, 18℃에서 24시간 동안 흡착시켰다. 24시간 후 반응상등액에 대해 SDS-PAGE 및 정량분석을 수행하였다.

그 결과, 배양상등액의 리파제가 70% 이상 흡착고정화 되었음을 확인하였다(도 5).

실시예 5. 효소 반응을 위한 최적 아미노알코올의 선별

우도땅콩오일로부터 유사세라마이드 제조를 위한 아미노화 반응(amidation)에는 다양한 아미노알코올의 사용이 가능하다. 효소 반응을 위한 최적의 아미노알코올을 선정하기 위하여, 7 종류의 아미노알코올(3-amino-1,2-propanediol, 3-amino-1-propanol, 2-amino-1-butanol, 1-amino-2-propanol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol, 2-amino-1,3- propanediol)을 우도땅콩오일 대비 1:1의 몰비로 동일 부피의 용매(hexane)에 용해하고 실시예 4의 고정화 효소 10%(w/v)를 넣고 50℃에서 약 68시간동안 반응시켰다.

그 결과, 도 6과 같이 3-아미노-1,2-프로판디올(3-amino-1,2-propanediol), 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol), 그리고 1-아미노-2-프로판올(1-amino-2-propanol)의 아미노화 효율이 높음을 확인하였다.

실시예 6. 효소 반응을 위한 최적 용매의 선정

효소 반응을 위한 최적 용매를 선정하기 위하여, 효소 반응에서 가장 많이 사용되는 헥산(hexane)과 TAA(ter-amyl alcohol) 및 헥산을 50%(v/v)씩 혼합한 용매를 비교하였다. 헥산은 TAA에 비해 끓는점이 낮아 반응 후 정제가 용이한 장점이 있으나 아미노알코올이 잘 용해되지 않는 문제가 있다. 이를 개선하기 위하여 헥산에 TAA를 혼합한 용매를 이용하여 효소 반응시킨 후, 헥산과의 효과를 비교하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 효소 반응시 용매로 헥산만을 사용한 경우, 우도땅콩오일의 소모속도가 매우 느리고 유사세라마이드 생성 역시 느린 반면, TAA 및 헥산 혼합 용매를 사용한 경우 우도땅콩오일의 소모속도가 빠르고 유사세라마이드의 생성 농도도 높음을 확인하였다.

실시예 7. 우도땅콩오일을 이용한 유사세라마이드 생산

리파제는 유사세라마이드를 제조하는데 필요한 아미노화(amidation) 반응과 에스터화(esterification) 반응을 동시에 수행하는 효소이다. 우도땅콩오일로부터 유사세라마이드를 생산하는 과정은 도 8에서 보는 바와 같이 1차 지방산의 아미노화 반응(amidation)이 선행되어야 하며 이를 통해 생성된 지방산 아미드에 다시 2차 지방산이 에스터화 반응(esterification)이 되어 최종 유사세라마이드가 형성된다.

먼저 1단계 반응으로 유사세라마이드의 제조 가능성 여부를 확인하였다(도 9). 우도땅콩오일과 아미노알코올의 몰수를 달리하여 1단계 반응으로 유사세라마이드의 생성을 확인한 결과, 아미노알코올의 몰수가 높을수록 유사세라마이드의 전환율이 낮아짐을 확인하였고 아미노알코올과 우도땅콩오일을 동일한 몰수로 공급한 경우에도 미반응 디글리세리드(Diglyceride, DG)와 모노글리세리드(Monoglyceride, MG)가 잔량으로 남는 문제가 있었다(도 10). 또한, 우도땅콩오일의 몰수를 아미노알코올보다 1.5배 높게 공급한 경우에도 1단계 반응에서 65시간 반응 이후 반응이 종료되지 않고 미반응 지방산아미드가 60% 이상 잔류하고 있음을 확인하였다(도 11).

이에, 1단계 전환반응에서 미반응 지방산 아미드가 잔류하는 문제를 해결하고 유사세라마이드 전환수율을 높이기 위하여 2단계 반응을 시도하였다(도 12). 1차 반응에서 생성된 수분, 그리고 미반응 아미노알코올 등을 증류를 통해 제거한 후 최종산물을 회수하였다. 2단계 반응에서는 1차 반응에서 미반응 상태로 잔류하고 있는 지방산 아미드를 유사세라마이드로 추가 전환하기 위해서 잔류 지방산 아미드 양을 정량하고 이와 동일한 몰수의 올레산을 첨가하였다. 2차 반응 기질을 헥산에 용해하고 실시예 4에서 제조한 10%(w/v)의 고정화효소를 첨가한 다음 50℃에서 추가 반응을 진행하였다.

그 결과, 도 13과 같이 2차 반응에서 지방산 아미드가 대폭 줄고 유사세라마이드의 생성량이 증가하여 최종 80% 이상의 유사세라마이드가 제조된 것을 확인하였다.

상기 결과에 따라 우도땅콩오일로부터 유사세라마이드를 제조하는 최적공정 및 반응조건은 도 14와 같다. 구체적으로, 아미노알코올우도땅콩오일 1L 및 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol) 117ml, 용매(헥산:TAA 1:1(v/v)) 1,117ml를 혼합하여 2,234ml의 1차 반응 기질을 제조하고 이에 실시예 4의 고정화효소 111.7g을 투여한 후 50℃에서 48시간 동안 1차 반응시켰다. 반응물로부터 효소를 제거 후 200℃에서 2시간 동안 증류하여 수분 및 잔여 아미노알코올을 제거한 다음 2차 반응을 진행하였다. 2차 반응 기질로 잔여 지방산 아미드 1L에 올레산을 잔여 지방산 아미드의 몰수만큼 첨가(최대 600ml)하고, 2차 용매로 헥산(최대 1.6L), 실시예 4의 고정화효소 160g을 투여한 후 50℃에서 60시간 동안 2차 반응시켰다. 이후, 반응물로부터 효소를 제거 후 200℃에서 2시간 동안 증류하였다.추가로 탈색 및 탈취 공정을 수행하여 유사세라마이드를 제조하였다.

그 결과, 도 15와 같이 약 87%의 우도땅콩오일 유래의 유사세라마이드 생성이 확인되었다.

실시예 8. 동백오일을 이용한 유사세라마이드 생산

실시예 7과 동일한 방법으로 제주 천연오일인 동백오일을 사용하여 유사세라마이드를 제조하였다. 1차 반응을 40시간 동안 수행하고 반응물로부터 효소를 제거 후 증류하여 수분 및 잔여 아미노알코올을 제거한 다음 2차 반응을 진행하였다. 그 결과, 도 16에서 보는 바와 같이 약 87%의 동백오일 유래의 유사세라마이드 생성이 확인되었다.

실시예 9. 비자오일을 이용한 유사세라마이드 생산

실시예 7과 동일한 방법으로 제주 천연오일인 비자오일을 사용하여 유사세라마이드를 제조하였다. 1차 반응을 40시간 동안 수행하고 반응물로부터 효소를 제거 후 증류하여 수분 및 잔여 아미노알코올을 제거한 다음 2차 반응을 진행하였다. 그 결과, 도 17에서 보는 바와 같이 약 87%의 비자오일 유래의 유사세라마이드 생성이 확인되었다.

실시예 10. 3종 복합오일을 이용한 유사세라마이드 복합체 생산

실시예 7과 동일한 방법으로 제주 천연오일 3종(우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일)을 사용하여 유사세라마이드 복합체를 제조하였다. 동백오일, 우도땅콩오일 및 비자오일을 1:1:1의 중량비로 혼합하고 기질로서 첨가하였다. 1차 반응을 40시간 동안 수행하고 반응물로부터 효소를 제거 후 증류하여 수분 및 잔여 아미노알코올을 제거한 다음 2차 반응을 진행하였다..

그 결과, 도 18에서 보는 바와 같이 약 81%의 3종 복합오일 유래의 유사세라마이드 복합체 생성이 확인되었다.

실시예 11. 3종 복합오일 유래의 유사세라마이드 복합체의 보습 효과 확인

실시예 10에서 제조한 3종 복합오일 유래의 유사세라마이드(pseudo-ceramide) 복합체의 보습 효과를 시험물질에 대한 세포 생존율 및 세포내 필라그린(filaggrin) 생성량을 측정하여 확인하였다. 유사세라마이드 복합체는 DSMO(Dimethyl Sulfoxide) 및 에탄올(1:1 w/w) 혼합물, 양성대조군인 레티노산 또는 공지된 보습용 화장품 원료인 세라마이드NP는 에탄올에 1000 μg/mL로 녹여 각각 스톡 용액(stock solution)을 제조한 후 새로운 배지로 최종 농도가 0.008%, 0.016%, 0.031%, 0.063%, 0.125%, 0.25%로 되도록 희석하여 사용하였다. 용매대조군(Solvent control, 또는 음성대조군)으로는 시험물질이 포함되지 않은 용매를 사용하였다. 세포 생존율 시험에 대한 양성대조군으로 레티노산(Retinoic acid)을 사용하였으며, 세포내 필라그린 생성량에 대한 양성대조군으로는 세라마이드NP를 사용하였다.

성인 피부에서 분리한 1차 세포(Primary cell)인 인간 표피 각질 세포(Human epidermal keratinocytes, HEKs, ATCC, USA)를 배양접시의 바닥에 접종한 후 1% 항생제(Antibiotic-Antimycotic)을 포함하는 배지(Defined Keratinocyte-SFM, Gibco, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(HERAcell 150i, Thermo, USA)에서 배양하였다.

11-1. 세포 생존율 평가

세포 생존율은 MTT 어세이를 이용하여 분석하였다. HEKs를 24-웰 플레이트에 7Х10⁴ cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 뒤, 각 농도별로 희석한 시험물질이 포함된 배지로 교환한 후 48시간 배양하였다. 48시간 배양 후 농도별 시험물질 처리에 의한 세포모양 변화 유무를 현미경으로 관찰한 후, 각 웰에 MTT 용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)의 최종 처리 농도가 0.05%가 되도록 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO를 1,000 μL씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 540 nm (BioTek, USA)에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 유사세라마이드는 0.016% 이하의 농도에서 세포 모양의 변화가 없었고, 세포 독성 또한 미미한 것으로 나타났다(도 19). 더욱이, 양성대조군인 레티노산의 처리농도(0.0005%) 보다 16~32배 이상 높은 처리농도(0.008~0.25%)로 처리하였음에도 불구하고, 세포 독성이 낮은 것을 확인하였다.

11-2. 세포내 필라그린 생성량 측정

HEKs는 6-well plate에 1Х10⁵ cells/well로 접종하여 24시간 배양한 뒤, 농도별로 희석한 시험물질이 포함된 배지로 교환한 후 48시간 배양하였다. 배양 48시간 후 각각의 배양 상층액을 제거하고 세포 용해 버퍼를 넣고 세포 용해액을 수거하였다. 세포 용해액을 얼렸다 녹였다 한 후 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하였고, 세포 파편이 제거된 상층액으로 세포내 포함된 필라그린 생성량을 인간 플라그린 ELISA 키트(Cusabio, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 필라그린 생성 정도는 총 단백질량으로 보정하여 평가하였고, 단백질량은 표준용액으로 BSA(Bovine Serum Albumin)를 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법에 따라 정량하였다. BSA는 0, 2, 5, 10, 20 μg/mL로 증류수에 단계적으로 희석하고 980 μL의 브래드포드 용액에 각 농도의 BSA 용액을 20 μL씩 넣고 5분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA 표준 커브를 구하였다. 같은 방법으로 6-웰 플레이트에 배양한 HEKs는 0.01% 트리톤(Triton) X-1000.2 M Tris-HCl (pH 8.0)에 용해시켜, 이 세포 용해액과 브래드포드 용액 혼합액의 흡광도를 측정하고 BSA 표준 커브를 이용하여 단백질량을 산출하였다.

그 결과, 유사세라마이드는 0.002%~0.008% 농도에서 세포내 필라그린 생성량이 용매대조군에 비하여 1.22%~5.05% 증가하였으며, 이는 양성대조군인 세라마이드NP와 유사한 증가 수준이었다(표 1(n=3) 및 도 20).

모든 자료는 평균값±표준편차로 나타내었으며, 통계분석은 SPSS® Package Program (IBM, USA)을 사용하여 분석하였다. 모든 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며 통계적인 유의성은 independent samples t-test로 p<0.05 유의수준에서 검증하였다.

상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에 따른 유사세라마이드 복합체는 0.016% 이하의 농도에서 양성대조군인 레티노산에 비해 낮은 세포 독성을 나타내며, 0.002%~0.008% 농도에서 세포내 필라그린 생성량이 기존에 공지된 보습용 화장품 원료의 일종인 세라마이드NP와 유사한 수준으로 증가하는 경향을 나타내는 바, 세라마이드NP만큼 보습 효과가 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Beauty Industry Development Institute Co., Ltd. Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Synthetic pseudo-ceramide complex derived from Jeju natural oil prepared by enzyme catalyst lipase and functional cosmetic raw material including the same <130> KPA191238-KR-P1 <150> KR 10-2019-0119662 <151> 2019-09-27 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB1422-278L <400> 1 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CalB <400> 2 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315

Claims (15)

1. a) 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기질, 아미노알코올(amino alcohol) 및 유기용매의 혼합물과 서열번호 1로 이루어진 CalB의 변이체를 첨가하여 1차 효소 반응시켜 반응물을 생성하는 단계; 및
   b) 상기 a) 단계의 효소 반응물, 불포화 지방산 및 유기용매의 혼합물과 상기 CalB의 변이체를 첨가하여 2차 효소 반응시키는 단계;를 포함하는, 유사세라마이드 생산방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 기질은 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일 3종을 모두 포함하는 것인, 생산방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 기질은 우도땅콩오일, 동백오일 및 비자오일을 1:0.5-1.5:0.5-1.5의 중량비로 혼합한 것인, 생산방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 아미노알코올은 3-아미노-1,2-프로판디올(3-amino-1,2-propanediol), 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol), 2-아미노-1-부탄올(2-amino-1-butanol), 1-아미노-2-프로판올(1-amino-2-propanol), 2-아미노-2-에틸-1,3-프로판디올(2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol), 2-아미노-2-에틸-1,3-프로판디올(2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol) 및 2-아미노-1,3-프로판디올(2-amino-1,3- propanediol)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 생산방법
   
5. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 유기용매는 무극성용매:알코올을 1:0.5-1.5의 부피비로 혼합한 것인, 생산방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 무극성용매 및 알코올은 각각 헥산(hexane) 및 TAA(ter-amyl alcohol)인, 생산방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 CalB의 변이체와 기질, 아미노알코올 및 유기용매의 혼합물은 1:15 내지 25의 중량비로 첨가하는 것인, 생산방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 반응물은 a) 단계에서 반응되지 않은 잔여 지방산 아미드를 포함하는 것인, 생산방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 불포화 지방산 및 유기용매는 각각 올레산(oleic acid) 및 헥산인, 생산방법.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 CalB의 변이체와 반응물, 불포화 지방산 및 유기용매의 혼합물은 1:15 내지 25의 중량비로 첨가하는 것인, 생산방법.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 효소 반응은 40 내지 60℃에서 40 내지 70시간 동안 이루어지는 것인, 생산방법.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 유사세라마이드는 복합체인 것인, 생산방법.
    
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