KR102394644B1

KR102394644B1 - 케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 미생물 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-ht1 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102394644B1
Application number: KR1020170122391A
Authority: KR
Inventors: 김은미; 박준성; 이영란; 황경환
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2022-05-09
Also published as: KR20180035682A

Abstract

본 명세서에는 케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 미생물 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1이 개시된다. 상기 신규한 미생물은 녹차에서 유래된 것으로서, 37 ℃ 및 pH 6의 약산성 조건에서도 우수한 케라틴 분해 활성을 갖는 효과가 있다. 또한, 본 명세서는 상기 신규한 미생물, 이의 배양물 또는 이로부터 분리한 케라티네이즈를 유효성분으로 포함하는 각질 케어 용도를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

Description

케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 미생물 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 및 이의 용도{NOVEL CHRYSEOBACTERIUM CAMELLIAE DOLSONGI-HT1 HAVING KERATINOLYTIC ACTIVITY AND USE THEREOF}

본 명세서에는 케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 미생물 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 및 이의 용도가 개시된다.

일반적으로 피부는 피부 바깥쪽부터 표피, 진피, 피하지방층의 세 부분으로 분류된다. 이중 표피는 다시 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 세분되며, 기저층의 표피세포는 피부 상부로 올라오면서 분화되어 최종적으로는 각질층에 도달하게 된다. 각질층에 도달한 표피세포는 핵이 소실되고 케라틴이라고 불리는 불수용성 단백질로 채워지면서 죽은 세포로 전환된다.

각질세포는 차례차례로 계속 만들어지지만 최외각층의 오래된 각질세포가 탈리하기 때문에 일정한 두께를 유지하고 있는데, 이처럼 새로운 세포가 각질층까지 올라와 죽은 세포가 되어 떨어져 나가는 과정을 턴오버 (Turn Over)라고 한다. 정상피부의 경우 각질층은 15 내지 20층으로 구성되고, 이들이 완전히 분리되는데 15 내지 20일이 소요 (British J. of Dermatology, 86, 14-19, 1974; K.M.Halprin, 향장회지, 12(4), 265-271, 1988)되므로 하루에 약 1층의 각질세포층이 떨어져 나간다고 볼 수 있다.

이러한 각질층이 정상적으로 박리되지 않고 피부 표면에 남아 있게 되면 각질층은 두꺼워지고 얼굴빛은 칙칙하고 어두워진다. 또한, 피부 표면이나 모발의 모낭에 남아 있는 불순물은 산소나 미생물에 의해 산화되거나 분해되고, 염증과 같은 피부 트러블을 일으킨다. 이러한 불순물의 주성분은 케라틴이며, 이는 세포가 죽고 난 후에도 피부 표면에 남아 있게 된다.

케라틴은 분자량이 크고 불용성이며 잘 분해되지 않아서 세정제 단독으로는 쉽게 제거되지 않지만 효소를 이용하여 작게 분해함으로써 효과적으로 제거할 수 있다. 이처럼 안정한 단백질 분해효소를 사용하면 피부 표면에 부착된 케라틴층을 제거하여 더욱 부드러운 피부로 만들 수 있다.

기존에 개발된 케라티네이즈 (keratinase)는 닭의 깃털이나 가금류의 폐기물 등 동물성 원천으로부터 선별된 미생물로부터 얻어진 경우가 대부분이었다. 따라서, 친환경 화장품 원료 소재로의 개발을 위해 식물이나 혹은 토양 유래 케라티네이즈의 개발을 필요로 하고 있다. 종래 녹차 유래 미생물에 관한 보고는 있었으나 상기 미생물의 우수한 케라티네이즈 활성에 대해서는 보고된 바가 없다.

한국 공개특허공보 제10-2001-0035745호

일 측면에서, 본 명세서는 케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 각질 제거용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1) 균주 (기탁번호 : KCCCM11883P)를 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 녹차 유래 균주인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 pH 6 내지 9에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 pH 6에서의 케라틴 분해 활성이 pH 9에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 50 내지 60%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 35 내지 65 ℃의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 35 내지 40 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 균주로부터 분리된 케라티네이즈를 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 케라티네이즈는 균주의 배양물, 균주의 파쇄물 또는 배양물의 파쇄물로부터 분리된 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 식물 유래의 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈를 유효성분으로 포함하는 각질 제거용 화장료 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 각질 제거에 유효한 양의 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈를 이를 필요로 하는 대상에게 적용하는 것을 포함하는 각질 제거 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 대상의 각질 제거를 위한 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈의 각질 제거 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 대상의 각질 제거를 위한 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈 함유 조성물을 제조하기 위한 용도를 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈는 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물의 형태로 대상에게 적용 또는 도포하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈는 대상의 피부 또는 두피에 적용 또는 도포하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 크리세오박테리움 카멜리아에는 녹차 유래 균주인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 크리세오박테리움 카멜리아에는 케라틴 분해 활성을 갖는 기탁번호 KCCCM11883P인 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1)인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 pH 6 내지 9에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 pH 6에서의 케라틴 분해 활성이 pH 9에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 50 내지 60%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 35 내지 65 ℃의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 35 내지 40 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 미생물을 제공하는 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 각질을 제거하고 피부를 정돈해 주는 각질 케어 용도를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1의 16S rDNA 부분 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1로부터 생산되는 케라티네이즈의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1로부터 생산되는 케라티네이즈의 pH에 따른 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1 균주 및 Chryseobacterium camelliae THG C4-1 균주의 케라티네이즈 활성 비교 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서는 케라틴 분해 활성을 갖는 신규한 균주, 케라틴 분해 활성을 갖는 상기 균주의 배양물 및 상기 균주로부터 분리된 케라티네이즈를 제공한다.

본 명세서에 따른 미생물은 본 발명이 속한 기술분야에서 공지된 통상적인 물리화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지거나 또는 이보다 우수한 활성을 가지도록 개선 또는 개량된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 0.5%(w/v) 케라틴을 포함하는 배양 배지에서 케라티네이즈를 생산하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 pH 6 내지 9에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 균주는 pH 6 이상, pH 6.5 이상, pH 7.0 이상, pH 7.5 이상, pH 8.0 이상, 또는 pH 8.5 이상이면서 pH 9.0 이하, pH 8.5 이하, pH 8.0 이하, pH 7.5 이하, pH 7.0 이하, 또는 pH 6.5 이하에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 pH 6에서의 케라틴 분해 활성이 pH 9에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 50 내지 60%, 더욱 구체적으로, 52 내지 58%, 54 내지 58%, 55 내지 57% 또는 56%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 35 내지 65 ℃의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 균주는 35 ℃ 이상, 36 ℃ 이상, 37 ℃ 이상, 38 ℃ 이상, 39 ℃ 이상, 40 ℃ 이상, 42 ℃ 이상, 44 ℃ 이상, 46 ℃ 이상, 48 ℃ 이상, 또는 50 ℃ 이상이면서 65 ℃ 이하, 64 ℃ 이하, 63 ℃ 이하, 62 ℃ 이하, 61 ℃ 이하, 60 ℃ 이하, 58 ℃ 이하, 56 ℃ 이하, 54 ℃ 이하, 52 ℃ 이하, 또는 50 ℃ 이하의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 35 내지 40 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 또는 80% 이상이면서 85% 이하, 84% 이하, 83% 이하, 82% 이하, 81% 이하, 또는 80% 이하의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 36 내지 39 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 36 내지 37 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 37 내지 38 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 균주는 37 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae)를 유효성분으로 포함하는 각질 제거용 화장료 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 배양물을 유효성분으로 포함하는 각질 제거용 화장료 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) 유래 케라티네이즈를 유효성분으로 포함하는 각질 제거용 화장료 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 크리세오박테리움 카멜리아에는 기탁번호 KCCCM11883P인 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1)인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 배양물은 본 명세서에 따른 미생물을 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액 (여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소 (lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액, 상기 배양물의 추출물 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 측면에서, 상기 배양물은 배양물의 여과액 또는 배양물을 원심분리한 배양 상등액인 것이 바람직할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 pH 6 내지 9에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 pH 6 이상, pH 6.5 이상, pH 7.0 이상, pH 7.5 이상, pH 8.0 이상, 또는 pH 8.5 이상이면서 pH 9.0 이하, pH 8.5 이하, pH 8.0 이하, pH 7.5 이하, pH 7.0 이하, 또는 pH 6.5 이하에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 pH 6에서의 케라틴 분해 활성이 pH 9에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 50 내지 60%, 더욱 구체적으로, 52 내지 58%, 54 내지 58%, 55 내지 57% 또는 56%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 35 내지 65 ℃의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 35 ℃ 이상, 36 ℃ 이상, 37 ℃ 이상, 38 ℃ 이상, 39 ℃ 이상, 40 ℃ 이상, 42 ℃ 이상, 44 ℃ 이상, 46 ℃ 이상, 48 ℃ 이상, 또는 50 ℃ 이상이면서 65 ℃ 이하, 64 ℃ 이하, 63 ℃ 이하, 62 ℃ 이하, 61 ℃ 이하, 60 ℃ 이하, 58 ℃ 이하, 56 ℃ 이하, 54 ℃ 이하, 52 ℃ 이하, 또는 50 ℃ 이하의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 35 내지 40 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 또는 80% 이상이면서 85% 이하, 84% 이하, 83% 이하, 82% 이하, 81% 이하, 또는 80% 이하의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 36 내지 39 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 36 내지 37 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 37 내지 38 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 37 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 케라티네이즈는 크리세오박테리움 카멜리아에의 배양물에서 분리된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 유효성분은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 명세서에 따른 녹차 유래의 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1), 이의 배양물 및 이로부터 분리한 케라티네이즈는 식물로부터 유래하여 친환경 화장품의 원료 소재로 유용하게 이용될 수 있고, 종래 다른 케라티네이즈와 비교하여 약산성 조건 및 케라티네이즈의 최적 활성을 나타내는 고온 조건 대비 낮은 온도 조건에서도 우수한 활성을 보여 분리 기원에 의한 특이적인 효과를 나타낸다.

구체적으로, 종래 케라티네이즈가 갖는 특성과 비교하여 볼 때, 약산성 조건에서도 최적의 pH 조건 (알칼리 조건)과 비교했을 때 약 56%의 활성을 가지며, 37 ℃의 온도 조건 (대부분의 케라티네이즈는 고온에서 최적 활성을 보임)에서도 최적의 온도 조건인 50 ℃와 비교했을 때 약 80% 이상의 활성을 갖는다.

상기 화장료 조성물에는 유효성분 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 분말, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 샴푸, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

시험예 1. 녹차로부터 미생물의 분리

식물 유래의 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물을 선별하기 위해, 케라틴을 탄소원과 질소원으로 사용하는 액체 최소배지(0.5% soluble keratin을 포함하는 M9 배지: CaCl₂ 0.015 g/L, Na₂HPO₄ 6.78 g/L, KH₂PO₄ 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L)를 사용하여 미생물을 30 ℃ 또는 37 ℃에서 배양하였다.

본 시험예에 따른 최소배지를 이용한 미생물의 선별방법은 미생물의 성장 속도에 따라 목적으로 하는 미생물을 선별하는 방법으로서, 케라티네이즈 활성이 낮은 미생물은 배양 단계에서 자발적으로 제거되므로 활성이 높은 효소를 포함하고 있는 활성 미생물을 선별할 수 있다. 최소배지에서 성장이 가능한 미생물은 케라티네이즈 활성을 보유하고 있다는 것을 의미한다.

이에 따라, 제한된 배지에서 한국 제주도 돌송이 차밭의 녹차로부터 케라틴 분해 활성을 갖는 미생물을 분리하였다.

시험예 2. 분리된 미생물의 동정

상기 시험예 1에서 분리한 케라티네이즈 활성을 갖는 미생물을 동정하기 위해, 미생물의 16S ribosomal RNA 부분 서열을 암호화하는 DNA 서열을 분석하여 그 종과 속명을 파악하였다.

미생물을 액체 배지에서 배양시킨 후, 미생물로부터 genomic DNA를 추출하여 일반적으로 박테리아 동정에 사용되는 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 서열번호 2)/1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 3) 프라이머를 사용하여 PCR (polymerase chain reaction) 방법으로 증폭시키고 이의 서열을 분석하였다.

염기서열 분석 결과, Chryseobacterium camelliae strain THG C4-1 (KACC 16985; Sequence accession no. (16S rRNA) JX843771) 16S rRNA 부분 서열과 99%의 상동성, Chryseobacterium taiwanense 16S rRNA 부분 서열과 98%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다.

이에, 본 명세서에서 분리 및 배양된 신규한 미생물 균주는 16S rDNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통하여 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae)임을 확인하였으며, 이를 크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) Dolsongi-HT1로 명명하고, 상기 신규 미생물 균주를 2016년 09월 01일자로 기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 KCCM11883P로 기탁하였다. 서열번호 1의 Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1 16S rDNA partial sequence는 도 1에 나타내었다.

시험예 3. 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 ( Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1)의 특성 분석

상기 시험예 2에서 동정한 신규한 균주로부터 생산되는 케라티네이즈의 활성을 pH 및 온도 조건에 따라 분석하였다.

케라티네이즈 시료는 Nutrient broth 액체 배지에 미생물을 접종하여 30 ℃에서 약 20 시간 동안 배양한 후, 5,000 rpm에서 원심분리하여 균주를 제거하고 배양액을 얻어 사용하였다. pH는 5 내지 10 범위, 온도는 30 내지 60 ℃ 범위에서 케라티네이즈의 활성을 분석하였고, 케라티네이즈의 활성은 케라틴 아주리 (keratin azure)를 기질로 사용하여 활성을 측정하였다. 케라틴 아주리는 케라티네이즈에 의해 분해 시 azure dye가 나오면서 반응액이 파란색으로 바뀌고, 이를 595 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 그 활성도를 비교할 수 있다.

구체적으로, pH 5 내지 10 범위의 버퍼와 시료를 1:1 (v/v)로 섞어, 케라틴 아주리 기질과 혼합하여 약 10 시간 동안 37 ℃에서 교반하며 반응시켰다. 이때, 케라틴 아주리는 약 0.5% (w/v)로 첨가하였다. 온도 변화에 따른 시험의 경우, pH 9 tris buffer를 사용하여 버퍼와 시료를 1:1 (v/v)로 섞어 케라틴 아주리 기질과 혼합하여 약 10 시간 동안 각각의 온도에서 교반하며 반응시켰다.

크리세오박테리움 카멜리아에 (Chryseobacterium camelliae) Dolsongi-HT1 유래의 케라티네이즈 활성 분석 결과, 다른 케라티네이즈와 마찬가지로 50 ℃의 고온에서 가장 높은 활성을 보였으며, 37 ℃에서도 가장 높은 활성과 비교하여 80% 이상의 활성을 보이는 것을 확인하였다(도 2 참조). pH의 경우 다른 케라티네이즈와 마찬가지로 pH 9의 알칼리 조건에서 활성이 가장 높은 것을 확인하였다. 또한, 일반적으로 케라티네이즈의 경우 산성 조건에서 최적의 알칼리 조건과 비교하여 그 활성이 매우 낮은 것에 비해, 본 명세서에 따른 케라티네이즈의 경우 pH 6의 약산성 조건에서 최적의 활성과 비교하여 약 56% 정도의 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3 참조). pH 5 내지 6은 화장품 제형의 제조 시 일반적으로 사용되는 pH 조건으로서, 이에 따라 본 명세서에 따른 케라티네이즈는 화장품의 원료 소재로서 매우 유용함을 알 수 있다.

시험예 4. 케라티네이즈 활성 비교

상기 시험예 2에서 동정한 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1) 균주와 크리세오박테리움 카멜리아에 THG C4-1 (Chryseobacterium camelliae THG C4-1) 균주의 케라티네이즈 활성을 하기와 같이 비교하였다.

케라티네이즈 시료는 LB (Luria-Bertani) 액체 배지에 상기 균주를 각각 접종하여 30 ℃에서 약 20 시간 동안 배양한 후, 5,000 rpm에서 원심분리하여 균주를 제거하고 배양액을 얻어 사용하였다. pH는 8, 온도는 37 ℃에서 상기 시험예 3과 동일한 방법으로 케라티네이즈의 활성을 분석하였다. 구체적으로, pH 8의 버퍼와 시료를 1:1 (v/v)로 섞어, 케라틴 아주리 기질과 혼합하여 약 10 시간 동안 37 ℃에서 교반하며 반응시켰다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 균주는 크리세오박테리움 카멜리아에 THG C4-1 균주에 비해 약 1.8배 높은 케라티네이즈 활성을 나타내어 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 균주가 동종 균주 대비 매우 우수한 효과를 갖는 것을 확인하였다.

본 명세서의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 유연화장수(스킨로션)

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 2] 영양화장수(밀크로션)

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 3] 영양크림

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 4] 마사지크림

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
파라핀	1.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

[제형예 5] 팩

배합 성분	함량 (중량%)
균주 또는 이의 배양물	0.1
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올 방부제	적량
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

이상, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터

KCCM11883P

20160901

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> NOVEL CHRYSEOBACTERIUM CAMELLIAE DOLSONGI-HT1 HAVING KERATINOLYTIC ACTIVITY AND USE THEREOF <130> 17P540/IND <150> KR 2016-0125611 <151> 2016-09-29 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1198 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1 <400> 1 agctagggtg ggtacggatt attgggttta agggtccgta ggcggatgtg taagtcagtg 60 gtgaaatctc acagcttaac tgtgaaactg ccattgatac tgcatgtctt gagtaaggta 120 gaagtggctg gaataagtag tgtagcggtg aaatgcatag atattactta gaacaccaat 180 tgcgaaggca ggtcactatg tcttaactga cgctgatgga cgaaagcgtg gggagcgaac 240 aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgct aactcgtttt tgggttttcg 300 gattcagaga ctaagcgaaa gtgataagtt agccacctgg ggagtacgtt cgcaagaatg 360 aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga ttatgtggtt taattcgatg 420 atacgcgagg aaccttacca aggcttaaat gggaattgat cggtttagaa atagaccttc 480 cttcgggcaa ttttcaaggt gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgttagg 540 ttaagtcctg caacgagcgc aacccctgtt actagttgct accattaagt tgaggactct 600 agtaagactg cctacgcaag tagagaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc 660 ttacgccttg ggccacacac gtaatacaat ggcaggtaca gagggcagct acacagcgat 720 gtgatgcgaa tctcgaaagc ctgtctcagt tcggattgga gtctgcaact cgactctatg 780 aagctggaat cgctagtaat cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt tcccgggcct 840 tgtacacacc gcccgtcaag ccatggaagt ctggggtacc tgaagtcggt gaccgtaaaa 900 ggagctgcct agggtaaaac aggtaactag ggctaatcgt acaggggaaa ccctaaaagt 960 ttaaccagga accggtagaa ggtgttaagg atagagtgta tatctgtttt gtatatgttg 1020 tatttatcta gtgtatctga gataatggat agataacgct cgaactggca ctacactagt 1080 gagagatatt agtattctta tatattaagt ctctattgag atatcataat cgtggataaa 1140 gacttgacag cggcgagagc ctggatagcg gagtggtgtt agctatgagt gtataatc 1198 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims

크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1) 균주 (기탁번호 : KCCCM11883P).
제 1항에 있어서,
상기 균주는 녹차 유래 균주인 것인, 균주
제 1항에 있어서,
상기 균주는 케라틴 분해 활성을 갖는 것인, 균주
제 1항에 있어서,
상기 균주는 pH 6 내지 9에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것인, 균주
제 1항에 있어서,
상기 균주는 pH 6에서의 케라틴 분해 활성이 pH 9에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 50 내지 60%의 활성을 갖는 것인, 균주
제 1항에 있어서,
상기 균주는 35 내지 65 ℃의 온도에서 케라틴 분해 활성을 갖는 것인, 균주
제 1항에 있어서,
상기 균주는 35 내지 40 ℃에서의 케라틴 분해 활성이 50 ℃에서의 케라틴 분해 활성을 기준으로 75 내지 85%의 활성을 갖는 것인, 균주
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 균주로부터 분리된 케라티네이즈.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 크리세오박테리움 카멜리아에 돌송이-HT1 (Chryseobacterium camelliae Dolsongi-HT1) 균주, 이의 배양물 또는 상기 균주 유래의 케라티네이즈를 유효성분으로 포함하는 각질 제거용 화장료 조성물.
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