KR102389749B1 - 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바１０１ 균주 및 이의 용도 - Google Patents
피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바１０１ 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 신규 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 인간 피부로부터 분리 및 동정한 신규한 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 상기 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물, 피부주름 개선용 화장료 조성물, 피부장벽 기능 강화용 식품 조성물 및 피부주름 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 피부 유래 신균주 및 상기 균주의 배양액은 피부세포에서 각질세포외막(cornified envelope: CE)의 형성능이 우수하고 엘라스타제(elastase) 및 히알루로니다아제(hyaluronidase)의 억제 활성이 우수하여 피부장벽 기능 강화 및 항주름 활성을 갖는 기능성 화장품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 신규 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대인들의 경제수준이 향상되고 사회생활의 참여도가 높아지면서 피부 미용 건강에 대한 관심이 다양한 연령층에서 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부노화를 방지하고 피부 스트레스를 억제하여 피부노화 방지 및 깨끗하고 건강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 미용 관련 화장품 및 식품이 개발되고 있다.
피부층 중 가장 바깥층을 이루는 표피세포(Epithemal cell)는 외부환경의 다양한 자극으로부터 체내를 보호하는 방벽 역할을 수행하고, 동시에 피부에서 과량의 수분 손실 및 건조가 일어나는 것을 방지한다. 표지세포 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(Stratum cormeum)은 각질형성세포가 분화되어 형성된 것으로, 분화가 완료된 각질 세포와 이를 둘러싼 지질층으로 구성된다. 이렇듯 각질층 형성에 중요한 역할을 하는 각질형성세포는 표피의 제일 아래층인 기저층(Basal layer)에서 증식되다가 일정 시점이 되면 증식을 멈추고 표피층으로 이동하면서 분화가 된다. 이러한 과정을 각화(Keratinization)라고 부른다. 각화 과정에서 각질형성세포는 피부장벽을 형성하게 되는데, 피부장벽은 표피세포의 보호 역할에 있어 가장 핵심적인 요소이다.
또한, 표피의 상부층으로 각질형성세포로 이루어진 각질층 즉, 피부장벽은 벽돌을 쌓아놓은 형태이며, 포스포리피드, 세라마이드, 및 콜레스테롤 등으로 구성된 이중막의 지질이 피부장벽 구조를 지지하는 역할을 한다. 피부장벽은 독성물질이나 미생물, 기계적 자극, 자외선에 대해 가장 중요한 일차방어선이며, 피부를 통한 전해질이나 수분손실을 억제하여 피부가 정상적인 기능을 수행할 수 있는 환경을 제공한다.
따라서 피부장벽이 손상되면 피부가 건조하고 거칠어지며 유해환경에 쉽게 노출되므로 공격적인 화학물질과 미생물들이 피부 속으로 쉽게 침투하여 문제성 피부 예컨대, 아토피피부염, 접촉성 피부염, 건선, 노인성 건조피부 등을 유발할 수 있다. 이와 같은 피부장벽의 중요성에 대한 인식이 높아지면서 피부장벽 강화는 화장제, 스킨케어의 새로운 컨셉으로 주목받아 왔으며, 피부질환을 치료하기 위해 피부장벽 기능 개선용 치료법들이 연구되고 있다.
한편, 유산균은 인체 내에서 유익한 역할을 하는 세균으로서 탄수화물과 같은 당을 이용하여 유산(젖산)을 생성하는 균이다. 지금까지 400여종이 발견되었으며 화장품의 제조에도 응용되고 있다. 이러한 유산균들을 일반적인 배양액, 예를 들어 스킴밀크, 웨이, 당류 등을 주성분으로 하는 배지 중에서 배양하여 얻어지는 발효액은, 미백, 보습, 각질층의 턴오버(turn over) 속도 증가에 의한 피부의 소프트닝(skin softning), 피부 주름 완화 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나, 실제 이들 발효액을 함유하는 화장품의 이러한 기능성 효과는 발효액 중의 유효성분에 의하기 보다는 화장품에 첨가된 다른 원료를 통하여 나타내는 경우가 대부분이다.
그러나 아직까지 피부개선 및 피부건강을 위한 기능성 화장품으로서 주원료를 유산균으로 하여 개발된 예가 없다.
이에 본 발명자들은 인체, 특히 사람의 피부로부터 유래된 신규한 유산균을 분리 및 동정하였고, 상기 신규 유산균들이 피부장벽 개선 및 항주름 활성이 우수하여 기능성 화장품 및 기능성 식품의 제조에 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 피부에서 유래된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 기능 강화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부주름 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 피부에서 유래된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 각질세포외막(cornified envelope: CE) 형성능을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 엘라스타제(elastase) 억제 또는 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 기능 강화용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 피부주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 인간 피부로부터 분리 및 동정한 신규한 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 상기 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물, 피부주름 개선용 화장료 조성물, 피부장벽 기능 강화용 식품 조성물 및 피부주름 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 피부 유래 신균주 및 상기 신균주 배양액은 피부세포에서 각질세포외막(cornified envelope: CE)의 형성능이 우수하고 엘라스타제(elastase) 및 히알루로니다아제(hyaluronidase)의 억제 활성이 우수하여 피부장벽 기능 강화 및 항주름 활성을 갖는 기능성 화장품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신균주에 대한 성장곡선 및 배양시간에 따른 pH의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 엘라스타제 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 히알루로니다아제 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 세포독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 피부장벽 강화효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 엘라스타제 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 히알루로니다아제 억제 효능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 세포독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에서 신균주 배양액에 대한 피부장벽 강화효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 피부장벽 강화 및 항주름 활성을 갖는 인간 피부 유래의 신규 유산균 및 이의 용도를 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 유산균 자체를 주요성분으로 하는 피부장벽 개선 및 항주름 활성을 갖는 기능성 화장품 제조의 원료가 될 수 있는 새로운 유산균을 동정하기 위해 연구하던 중, 인간의 피부 유래 신규 균주인 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주를 분리 및 동정하였고, 이의 항주름 및 피부장벽 강화 활성을 확인함으로써, 상기 신균주를 기능성 화장품의 제조에 사용할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 수득한 인체의 피부시료로부터 피부에 존재하는 신규 미생물을 분리하였고, 동정된 균주의 16s rRNA 서열을 분석한 결과, 종래 존재하지 않았던 신규한 유산균임을 확인하였으며, 상기 균주를 '락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101'로 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2019년 12월 26일자로 기탁하여, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주에 대하여 기탁번호 KCTC14086BP를 부여받았다.
한편, 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 신균주의 항주름 및 피부장벽강화 활성을 확인하기 위해, 상기 균주를 배양한 배양액을 대상으로 피부 주름의 주요 원인인자로 알려진 엘라스타제(elastase) 및 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 대한 억제 활성이 있는지 분석하였는데, 그 결과, 본 발명의 신균주의 배양액이 엘라스타제 및 히알루로니다아제의 억제 활성이 있는 것으로 나타났다.
엘라스타제(elastase)는 피부의 노화에 관여하는 대표적인 효소 중에 엘라스타제가 있는데 이 효소는 조직 내의 용수철 작용을 하는 엘라스틴을 분해하는 효소이다. 엘라스타제는 연령이 증가하거나 자외선 등의 외부 자극에 의해 과잉 생성된다. 엘라스타제의 과잉생성은 엘라스틴을 과도하게 분해시켜 콜라겐간의 결합이 약하게 되어 피부주름이 생성되며 피부탄력을 감소시킨다. 특히, 40대 이후 엘라스타제의 작용에 의해 피부의 탄력이 급격히 감소하게 되는데 이는 엘라스타제의 작용이 나이를 먹음에 따라 매우 활발해져 엘라스틴 섬유가 일부 소멸되거나 응집현상이 나타나고, 콜라겐 섬유가 감소하기 때문이다. 따라서 이러한 엘라스타제의 활성을 억제함으로써 피부의 주름생성을 억제할 수가 있다.
또한, 히알루로니다아제(Hyaluronidase)는 히알루론산(hyaluronic acid)을 가수분해하는 효소로서 히알루론산은 피부의 보습 기능에 있어서 중요한 작용을 하는 물질로 다량의 수분을 함유할 수 있는 능력을 가지고 있어 피부에서 히알루론산이 감소되면 피부가 건조해지는 원인이 될 수 있으며 주름을 초래하는 원인이 된다.
따라서 본 발명의 신균주 자체 또는 이의 배양물은 엘라스타제(elastase) 억제 활성 및 히알루로니다아제 (hyaluronidase) 억제 활성이 우수하여 피부 보습 유지 및 피부 주름 생성을 억제할 수 있다.
또한 본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명의 신균주에 대한 피부장벽 강화 활성이 있는지를 확인하기 위해, 각질형성세포인 HaCaT 세포를 본 발명의 신규 유산균의 배양액 존재 하에서 배양한 후, 피부 장벽에 주요한 역할을 하는 각질세포외막의 형성 여부를 확인하였는데, 그 결과, 본 발명의 신규 유산균의 배양액 처리군에서는 모두 각질세포외막의 형성이 증가한 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 유산균이 피부 장벽을 강화시킬 수 있고 동시에 피부 주름을 개선할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 상기 "피부 장벽"이란, 피부 가장 바깥층인 표피의 상부층으로 각질형성세포로 이루어진 각질층을 의미한다. 독성물질이나 미생물, 기계적 자극, 자외선에 대해 가장 중요한 일차방어선이며, 피부를 통한 전해질이나 수분손실을 억제하여 피부가 정상적인 기능을 수행할 수 있는 환경을 제공하는 기능을 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "피부장벽 기능강화"란 피부의 가장 외각에 위치하는 각질층의 장벽 기능을 강화하는 것으로, 각질세포외막(cornified envelope: CE)의 형성을 개선 또는 증가시켜 피부의 손실 감소와 피부염증 유발을 방지하여 피부 장벽의 기능을 강화시키는 것을 의미한다.
그러므로 본 발명은 피부에서 유래된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물을 제공할 수 있으며, 또한 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다. 또한 상기 "배양물"은 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 신균주를 배양하고 수득한 배양액을 사용하였다.
나아가 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
나아가 본 발명은 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 기능 강화용 식품 조성물을 제공할 수 있으며, 또한 본 발명은 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 동정한 신균주는 락토바실러스 퍼멘텀 아종에 속하는 유산균으로서 상기 유산균은 프로바이오틱스 활성을 가지고 있는 바, 체내 섭취가 가능하다.
따라서 본 발명의 신균주는 피부장벽 강화 및 항주름 활성을 갖는 기능성 화장료 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 피부장벽 강화 및 항주름 활성을 갖는 기능성 식품 조성물로도 사용이 가능하다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 신균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물 군 중 하나 이상을 항주름 또는 피부장벽 기능개선 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말 레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물 군 중 하나 이상을 를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물 등의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다. 또한, 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로서 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
사람 피부 유래 신규 유산균의 분리 및 동정
<1-1> 시료 채취 및 유산균 분리
춘천에서 거주하는 30명의 피험자들의 동의하에 온도와 습도가 일정한 상태에서(온도 22 ± 2 ℃. 습도 50 ± 5%) 안면의 양쪽 볼 부분, 이마 부분 및 손바닥 부분의 피부 표면 미생물을 스왑하였다. 스왑은 Quick Swab kit를(3M Microbiology, USA) 이용하였고, swab 방법은 swab kit 제조사에서 권장하는 방법을 기준으로 검사대상의 표면적 약 12 cm2를 기준으로 채취하였다. 스왑된 각 샘플들은 한천이 함유된 고형 아가 플레이트에 화염멸균한 백금이를 이용하여 획선 도말하여 접종하였고 싱글 콜로니가 확인될 때까지 3일간 37℃의 온도에서 배양한 뒤 다시 독립된 집락인 싱글 콜로니 50개를 개별적으로 취한 후, de Man, Rogosa 및 Sharpe (MRS) 아가 플레이트에 획선 도말하는 방법으로 계대배양하여 균주의 생육 활성을 높였으며, 상기 과정으로 배양된 싱글 콜로니를 분리하여 분리된 균주의 16s RNA 염기서열을 분석하였다.
<1-2> 염기서열분석을 통한 신균주의 동정
상기 <1-1>의 과정에서 순수 분리된 균주들에 대한 동정을 위해 16S rRNA의 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 염색체 DNA 추출키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였고 얻어진 gDNA로부터 유니버설 프라이머[27F :5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3', 1492R: 5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT TC 3']를 이용하여 PCR을 수행하여 염기서열을 분석하였다. 16s rRNA 시퀀싱 수행으로 얻어진 결과에 대한 상동성 검사는 NCBI에서 제공하는 BLAST 서치 데이터베이스를 통해 수행하였다.
염기서열 분석 결과, 본 발명에서 분리한 유산균은 종래 알려지지 않은 신규 유산균임을 알 수 있었으며, 염기서열 상동분석 결과 본 발명의 신규 유산균들은 락토바실러스 속과 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로 나타났다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 신규 유산균을 "Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101"로 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2019년 12월 26일자로 기탁하여, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주에 대해 기탁번호 KCTC14086BP를 부여받았다.
또한, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
<실시예 2>
신균주의 배양액 제조
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신규 유산균에 대해 아래와 같은 방법을 통해 균주 배양액을 수득하였다. 먼저, MRS 아가 플레이트에서 단일 콜로니들을 채취 후, MRS 액체 배지에 접종하고 교반 배양기에서 37℃의 온도 및 100rpm으로 교반하면서 배양을 하였다. 3회 계대 배양 후, 본 배양을 5일 동안 수행하였다. 이후 배양액을 원심분리하여 상층액을 수득한 다음, 0.2um pore size 필터를 이용하여 상층액을 여과시켜 Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101(LF101)의 배양액을 각각 수득하였다.
<실시예 3>
신균주의 배양에 따른 pH 변화분석
본 발명의 신균주 배양에 따른 pH 변화를 확인하기 위해, 본 발명에서 동정한 균주를 배양하면서 시간에 따른 배양액의 pH 변화를 측정하였다.
그 결과, 상기 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신균주는 배양 시 산성성분의 배출 및 세포 밖으로의 분비를 통해 균주 배양액의 pH가 4.0~4.4의 범위를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
신균주의 주름 개선 활성분석
본 발명의 신균주에 대한 항주름 활성이 있는지를 분석하기 위해 엘라스타제 억제효능 및 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제 효능을 분석하였다. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해하는 효소이며 또한 콜라겐을 분해하는 효소로서 주름 생성에 주요한 콜라겐 분해능이 있어 주름을 유발시킬 수 있는 요인이다. 또한 히알루로니다아제는 피부의 자연 노화나 자외선 노출에 의한 광노화 과정에서 중요한 증상들 중 하나인 주름 형성에 직결되는 요인 중 하나이다. 먼저, 엘라스타제 활성 억제 효능 분석은 엘라스타제 효소가 기질인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide와 반응하여 p-nitroanilide를 생성하는 성질을 이용하여 실험을 진행하였는데, 상기 실시예 2에서 수득한 신균주 배양액에 Tris-Hcl에 용해시킨 엘라스타제(elastase)를 첨가하고, 이의 기질인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide을 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신균주 배양액을 첨가하지 않은 대조군(MRS)에 비해 본 발명의 신균주 배양액을 첨가한 군에서 엘라스타제 활성 억제 효능이 있는 것으로 나타났다.
또한, 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제 효능 분석을 위해, 본 발명의 신균주 배양액 10 μL를 취해 히알루로니다아제(0.585 U/ml) 20 μL를 넣고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이후 기질인 Hyaluronic acid 용액 30 μL를 첨가하고 45분간 반응시킨 후에 Acidic albumin solution 240 μL 첨가하고 실온에 10분 동안 반은 시킨 다음 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신균주 배양액을 첨가하지 않은 대조군(MRS)에 비해 본 발명의 신균주 배양액을 첨가한 군에서 히알루로니다아제 활성 억제 효능이 있는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 신균주의 배양액이 주름의 유발 원인으로 알려진 엘라스타제와 히알루로니다아제의 활성을 모두 억제할 수 있는 것을 확인함에 따라 본 발명의 신규 유산균을 항주름을 위한 기능성 화장품의 소재로 사용 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 5>
신균주의 세포독성 여부 분석
본 발명의 신균주에 대한 세포독성 여부를 분석하기 위해, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지조건에서 6웰 플레이트에 2x105 세포수/웰 조건으로 HaCaT 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후에 본 발명의 신균주 각 배양액( 10 μl/well)을 24시간 동안 처리하였다. 배양 후 배지를 제거하고 MTT를 1 mg/웰이 되도록 처리하여 2시간 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO에 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, MTT 어세이 분석 결과, 본 발명의 신균주 배양액 처리 결과, HaCaT 세포들이 거의 100%의 생존율을 보이는 것으로 확인됨에 따라, 본 발명의 신규 유산균은 세포 독성을 유발시키지 않는다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 6>
피부 장벽 강화능 분석
피부 장벽능이 저하되면 보습, 항염증, 미생물(microbiota) 패턴의 변화로 인해 부정적인 효과가 나타나며, 특히 아토피 염증 등 피부 염증 질환들이 유발되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 신균주가 피부 장벽 강화능이 있는지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
각질형성세포인 HaCaT 세포를 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco modified eagle medium (DMEM)배지에서 배양한 다음, 6-웰 플레이트에 2 × 105 cells/well 조건으로 HaCaT 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였으며 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체 후에 본 발명의 각 신균주 배양액을 2일 마다 처리하여 5 일 동안 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 세척한 뒤 2% SDS(Sodium dodecyl Sulfate)와 20 mM DTT(Dithiothreitol) 용액 1 mL 넣고 3분 동안 교반하고 20분간 100 ℃에서 열을 가한 후에 상기 세포들로부터 각질세포외막(cornified envelope: CE)을 추출한 다음, 310 nm에서 흡광도를 측정하여 CE 형성정도를 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 신규 유산균의 배양액으로 각질형성세포인 HaCaT 세포를 배양한 결과, 피부 장벽에 주요한 역할을 하는 각질세포외막의 형성이 증가하는 것으로 나타났으며 따라서 우수한 CE 형성능이 있음을 알 수 있었다.
따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주인 Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101(LF101) 균주가 주름억제 활성뿐만 아니라 피부 장벽을 강화 및 개선시키는 활성이 있어, 기능성 화장품의 제조에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Shebah biotech Inc
<120> Skin derived novel Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101
strain having effects of enhancing skin barrier and anti-wrinkle
and use thereof
<130> NPDC95211
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<210> 1
<211> 1494
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lactobacillus fermentum subsp. shebah101 16s rRNA sequence
<400> 1
cggcggtgtg cctaatacat gcaagtcgaa cgcgttggcc caattgattg atggtgcttg 60
cacctgattg attttggtcg ccaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct 120
gcccagaagc gggggacaac atttggaaac agatgctaat accgcataac aacgttgttc 180
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gtttccttcg ggaacgcaat gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080
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gcactctagt gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcagatcatc 1200
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cctgcacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1380
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg 1440
gtaacctttt aggagccagc cgcctaaggt gggacagatg attagggtga agtc 1494
Claims (9)
- 삭제
- 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주를 배양하고 원심분리하여 수득한 상기 균주 배양액의 상층액을 유효성분으로 포함하며,
엘라스타제(elastase) 억제활성, 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제활성 및 각질세포외막(cornified envelope: CE) 형성능을 모두 갖는 것을 특징으로 하는,
피부주름 개선 및 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물. - 삭제
- 제2항에 있어서,
상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것을 특징으로 하는, 피부주름 개선 및 피부장벽 기능 강화용 화장료 조성물. - 삭제
- 삭제
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- 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주를 배양하고 원심분리하여 수득한 상기 균주 배양액의 상층액을 유효성분으로 포함하며,
엘라스타제(elastase) 억제활성, 히알루로니다아제(hyaluronidase) 억제활성 및 각질세포외막(cornified envelope: CE) 형성능을 모두 갖는 것을 특징으로 하는,
피부주름 개선 및 피부장벽 기능 강화용 식품 조성물. - 삭제
Priority Applications (1)
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| KR1020210062702A KR102389749B1 (ko) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바１０１ 균주 및 이의 용도 |
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| KR1020210062702A KR102389749B1 (ko) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바１０１ 균주 및 이의 용도 |
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| KR102389749B1 true KR102389749B1 (ko) | 2022-04-22 |
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ID=81452201
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| KR1020210062702A KR102389749B1 (ko) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | 피부장벽강화 및 항주름 활성을 갖는 피부 유래 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바１０１ 균주 및 이의 용도 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102389749B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117736942A (zh) * | 2024-02-20 | 2024-03-22 | 山东中科嘉亿生物工程有限公司 | 改善皮肤衰老的发酵粘液乳杆菌jylf-315及其后生元制剂和应用 |
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| KR20190037036A (ko) | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 주식회사 세바바이오텍 | 배초향 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화 및 주름 개선용 화장료 조성물 |
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-
2021
- 2021-05-14 KR KR1020210062702A patent/KR102389749B1/ko active IP Right Grant
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