KR102123022B1 - 피부에 효능이 있는 고농도 프로바이오틱스를 포함하는 조성물 - Google Patents
피부에 효능이 있는 고농도 프로바이오틱스를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
피부에 효능이 있는 고농도 프로바이오틱스를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 피부 개선용 조성물에 의하면, 고농도의 생균을 용해한 프로바이오틱스 용해물은 피부 세포에서의 관련 유전자의 발현 유도 또는 억제 등을 통한 우수한 피부 미백 또는 탄력 증가 효과가 있다.
Description
피부에 효능이 있는 고농도 프로바이오틱스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 Pro와 Biotics의 합성어로서, 그리스어로 Pro는 “~을 위한”을, Biotics는 “생명”을 의미한다. 1953년 Kollath는 최초로 프로바이오틱스라는 용어를 사용하면서 “영양실조 환자의 건강을 되찾는 무기물이나 유기물”로 정의하였다. 1992년 Fuller는 프로바이오틱스를 “급여시 장내균총 균형이 개선되어 동물의 건강에 긍정적인 효과를 주는 생균”으로 정의하였으며, 2001년에 세계보건기구(WHO)에서는 프로바이오틱스를 “인체의 건강에 좋은 작용을 하는 살아있는 균”으로 정의하고 있다. 그 외에 독일의 미생물학자인 Gerhard Reuter는 “생균이건 사균이건 숙주의 건강에 긍정적으로 작용하면 프로바이오틱”이라고 주장하였다.
우리 몸에 서식하는 세균의 약 80%는 장에 서식하고 있고, 장내에는 유익균과 유해균이 존재하여 세균층을 조성하고 있다. 장내에 유익균의 비율이 많을수록 유해균의 수는 감소하게 되므로, 이러한 유익균의 수는 건강의 지표가 될 수 있다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로, 일반적으로 식품, 건강기능식품, 또는 의약품으로 섭취되고 있다.
화장품 산업에서도 프로바이오틱스 미생물을 원료로 한 피부 미용 제품들이 개발되고 있으나, 화장품 원료 전성분 표기시 미생물의 농도를 ppm 또는 %로 표현하고 화장품에 첨가되는 미생물의 수는 명확히 제시되지 않아 소비자들이 제대로 판단할 수 없는 경우가 일반적이다(한국등록특허 10-1371189). 예를 들어, 1 ml당 1,000마리의 미생물 용해물을 원료 A라 하고, 1 ml당 100,000,000 마리의 미생물 용해물을 원료 B라고 할 때, 원료 A와 B를 각각 1%(=100ppm)씩 첨가한 화장품 제품은 용해된 미생물 수에서 차이가 나는 제품이지만, 제품을 구매하는 소비자들은 동일한 함량의 미생물 용해물이 첨가된 제품으로 오인하게 된다. 또한, 상기 가정한 원료 A를 10%, 원료 B를 1% 각각 첨가된 제품에서의 화장품 원료 전성분 표기시, 원료 A를 넣은 제품이 원료 B를 넣은 제품보다 미생물 용해물이 고함량 들어간 것으로 오인될 수 있다. 따라서, 화장품 원료, 피부외용제, 또는 피부 미용을 위한 건강기능 식품에 적합한 미생물을 대상으로, 피부에 실효성이 있는 프로바이오틱스 용해물의 균 수에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 고농도의 프로바이오틱스 용해물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 고농도의 프로바이오틱스 용해물을 포함하는 피부 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 고농도의 프로바이오틱스 용해물을 포함하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 고농도의 프로바이오틱스 용해물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로바이오틱스”는 적당량을 섭취했을 때 숙주에게 이로움을 주는 살아있는 미생물을 의미할 수 있다. 상기 프로바이오틱스는 위산, 담즙산에서 죽지 않고 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여 장내 미생물 균형(intestinal microbial balance)을 개선하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “용해물”은 상기 프로바이오틱스 미생물 내에 포함된 세포 내 생물학적 구성성분, 예를 들어, 세포벽 또는 막 등의 구성성분, 및 프로바이오틱스가 배양 중 세포 외에 방출한 대사산물이 함유된 배양물과 같은 유용성분의 파쇄물을 포함하는 것을 의미할 수 있다. 상기 용해물은 조사(irradiation), 열 불활성화와 같이 프로바이오틱스의 대사산물의 변형을 유도하는 방법을 제외한 압력 또는 초음파 파쇄에 의해 제조될 수 있다. 상기 미생물 내의 유용성분들은 과도한 온도 및 에너지로 인한 변질이 용이한바, 현존하는 생산 공정 중 가장 안정적으로 미생물 내의 피부 유용 성분을 얻을 수 있는 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)로 발효물을 3회 이상 처리하여 용해물을 제조하였다.
본 명세서에서 사용되는 단위 “cfu/ml”는 미생물의 농도를 표현하기위해 통상적으로 사용되는 단위로, colony forming unit/g 또는 ml(cfu/g 또는 ml)로 사용될 수 있다. 상기 단위는 화장품 분야에서 미생물의 농도를 나타내기 위해 통상적으로 사용하는 ppm 또는 %와는 달리 용해된 미생물의 균 수를 나타내는 것인바, 화장품 원료로서 첨가되는 경우 피부에 실효성이 있는 균의 수를 표현하는 것일 수 있다.
상기 “화장료 조성물”은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누비의료용, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매, 담체, 부형제, 희석제, 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 또는 항진균제를 더 포함하는 것일 수 있고, 이들의 종류와 양은 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 용해된 균의 수는 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “고농도”는 1.0×108 cfu/ml을 초과하는 프로바이오틱스 미생물의 농도를 의미하는 것일 수 있다. 상기 “농도”는 용해된 미생물의 균 수를 의미하는 것일 수 있다. 상기 용해된 균의 수는 원핵세포류(Prokaryotes)는 1.0×108 내지 1.0×1012 cfu/ml, 예를 들어, 1.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml, 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml로, 세포의 크기가 큰 진핵세포류(Eukaryotes)는 1.0×108 내지 1.0×1011 cfu/ml, 예를 들어, 1.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml, 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml로 상기 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부 개선용일 수 있다.
상기 “개선”은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 피부 개선은 피부 미백 또는 피부 탄력 개선일 수 있다. 상기 "피부 미백"은 멜라닌의 합성을 저해하여 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 상기 "피부 탄력 개선"은 콜라겐의 생성을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 균은 락토바실러스 (Lactobacillus sp.) 속 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium sp.) 속으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 "락토바실러스 (Lactobacillus sp.) 속"은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 크레모리스(Lactobacillus cremoris), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 파라플랜타럼(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 및 락토바실러스 그라미니스(Lactobacillusgraminis)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 "비피도박테리움 (Bifidobacterium sp.) 속"은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 및 비피도박테리움 슈도카테눌라툼 (Bifidobacterium pseudocatenulatum)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 락토바실러스 속은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 상기 비피도박테리움 속은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)일 수 있다. 구체적으로, 상기 락토바실러스 속은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802 (수탁번호: KCCM12344P), 또는 상기 비피도박테리움 속은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 (수탁번호: KCCM12346P)일 수 있다. 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802의 16S rRNA의 염기서열은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)의 염기서열과 80 % 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내는 것일 수 있다. 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801의 16S rRNA의 염기서열은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 의 염기서열과 80 % 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부세포에서 멜라닌(melanin) 생성을 억제하거나, 프로콜라겐(procollagen)을 발현하는 것일 수 있다. 상기 “멜라닌”은 생성이 억제되면 피부 미백 효과를 나타내는 것일 수 있다. 상기 “프로콜라겐”은 발현이 증가되면 피부 탄력 증가 효과를 나타내는 것일 수 있다.
다른 양상은 고농도의 프로바이오틱스 용해물을 포함하는 피부 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 프로바이오틱스, 용해물, 용해된 균의 수, cfu/ml, 고농도, 균, 개선, 멜라닌, 프로콜라겐 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 "건강기능식품"은 상기 건강식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합 양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 50 중량부로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올, 음료, 및 비타민 복합제 등에 한정되지 않고 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 고농도의 프로바이오틱스 용해물을 포함하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.
상기 피부외용제 조성물에 있어서, 프로바이오틱스, 용해물, 용해된 균의 수, cfu/ml, 고농도, 균, 개선, 멜라닌, 프로콜라겐 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 “피부외용제”는 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭, 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함하는 것일 수 있다. 이들의 양은 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 프로바이오틱스 생균을 고체 배지에서 20℃ 내지 50℃ 온도, 예를 들어, 25℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 120시간, 예를 들어, 10시간 내지 24시간 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 액체 배지에 접종한 후 배양기에서 20℃ 내지 50℃ 온도, 예를 들어, 25℃ 내지 40℃에서 24시간 진탕 배양시켜 종균을 형성할 수 있다. 상기 액체 배지에서 미리 배양한 균을 20℃ 내지 50℃ 온도, 예를 들어, 25℃ 내지 37℃에서 10시간 내지 120시간, 예를 들어, 10시간 내지 24시간 동안 교반하면서 이루어질 수 있다. 상기 교반은 30 내지 300 rpm의 교반속도, 예를 들어, 50 내지 200rpm의 교반속도로 이루어질 수 있다. 이때, pH는 4.0 내지 6.5, 예를 들어, 5.0 내지 6.0인 상태를 유지할 수 있다. 상기 교반 발효는 균이 2.0×1011 cfu/ml의 농도로 발효를 하는 것일 수 있다. 상기 배양된 프로바이오틱스 생균을 용해하여 용해물을 얻은 후, 상기 용해물에 용해된 균의 수가 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml가 되도록 조절하여 제조될 수 있다.
상기 교반시 통기 조건은 0.2 내지 2.0 vvm, 예를 들어, 0.2 내지 1.2 vvm일 수 있다.
상기 활성화시 혐기조건에서 활성화시킬 수 있고, 혐기조건에서 배양시킬 수 있으며, 상기 교반시 조건은 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 사용하여 혐기 조건을 유지할 수 있다.
일 양상에 따른 피부 개선용 조성물에 의하면, 고농도의 생균을 용해한 프로바이오틱스 용해물은 피부 세포에서의 관련 유전자의 발현 유도 또는 억제 등을 통한 우수한 피부 미백 또는 탄력 증가 효과가 있다.
도 1은 프로바이오틱스 용해물을 제조하는 공정을 도식화한 것이다.
도 2는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802 (수탁번호: KCCM12344P) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 (수탁번호: KCCM12346P)을 동정한 결과이다.
도 3는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물이 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml cfu/ml의 생균 수에서 우수한 피부 미백 효과를 갖는다는 것을 확인한 결과이다; (A)는 동일한 농도(2.0×108)에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 멜라닌 함량을 비교한 그래프이고, (B)는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물의 농도에 따른 멜라닌 함량을 비교한 그래프이다.
도 4은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물이 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml의 생균 수에서 우수한 피부 탄력 증가 효과를 갖는다는 것을 확인한 결과이다; (A)는 동일한 농도(2.0×108)에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 프로콜라겐 함량을 비교한 그래프이고, (B)는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물의 농도에 따른 프로콜라겐 함량을 비교한 그래프이다.
도 5은 2.0×109 및 2.0×1010 cfu/ml의 농도에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 세포의 생존율을 비교한 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802 (수탁번호: KCCM12344P) 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 (수탁번호: KCCM12346P)을 동정한 결과이다.
도 3는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물이 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml cfu/ml의 생균 수에서 우수한 피부 미백 효과를 갖는다는 것을 확인한 결과이다; (A)는 동일한 농도(2.0×108)에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 멜라닌 함량을 비교한 그래프이고, (B)는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물의 농도에 따른 멜라닌 함량을 비교한 그래프이다.
도 4은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물이 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml의 생균 수에서 우수한 피부 탄력 증가 효과를 갖는다는 것을 확인한 결과이다; (A)는 동일한 농도(2.0×108)에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 프로콜라겐 함량을 비교한 그래프이고, (B)는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물의 농도에 따른 프로콜라겐 함량을 비교한 그래프이다.
도 5은 2.0×109 및 2.0×1010 cfu/ml의 농도에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 세포의 생존율을 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 균주의 분리 및 동정
신규한 유산균의 분리를 위해 20~30대 출산 후 6 개월간 모유 수유를 하는 산모 10명에게 모유 시료를 수집하여 미리 제작한 MRS Agar 배지에 초기 미생물을 접종하였다. 접종된 초기 샘플은 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 얻어진 미생물 콜로니를 다시 MRS Agar 배지에 2차 접종을 하여 균주를 얻어냈다. 2차 접종에서 얻어진 콜로니 별로 발효를 한 결과 가장 활성이 뛰어난 미생물을 선택하였다.
도 2는 상기의 방법으로 얻어진 미생물을 랩지노믹스 검사센터에 의뢰하여 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과로, 본 발명에서 얻어진 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)임을 확인하였다. 상기 분리된 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802(서열번호 1)로 명명하였으며, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁번호 KCCM12344P로 기탁하였다.
실시예 2. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 발효 용해물의 제조
실시예 1에서 분리동정된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 35℃에서 10시간 내지 24시간 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 또는 modified MRS 액체 배지에 접종한 후 배양기에서 25℃ 내지 35℃에서 24시간 진탕 배양시켜 종균을 형성하였다.
MRS 또는 modified MRS 액체 배지에서 미리 배양한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균을 25℃ 내지 35℃에서 10시간 내지 24시간 동안 교반하였다. 상기 교반은 50 내지 200rpm의 교반속도로 이루어졌다. 상기 교반시 통기 조건은 0.2 내지 1.2 vvm 이며, pH는 5.0 내지 6.0인 상태를 유지하였다. 상기 교반 발효는 균이 2.0×1011 cfu/ml의 농도로 발효를 하였다.
상기 제조된 2.0×1011 cfu/ml의 생균이 용해된 용해물을 10배씩 희석하여 2.0×106, 2.0×107, 2.0×108, 2.0×109, 2.0×1010 cfu/ml의 생균이 용해된 용해물을 제조하였다.
실시예 3. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)균주의 분리 및 동정
경기 지역에서 모집된 출생 5일 이내의 신생아 25명(남 16, 여 9)의 분변 시료를 수집하여 비피더스 유산균의 선발배지인 TOS(transgalactosylated oligosaccharide) 한천 배지에서 혐기적으로 배양하였다. 상기 배지에서 생장하는 1,269개 균주를 콜로니 별로 분리하여 이들 분리한 균주에서 132개 균주를 현미경 검경을 통하여 1차 선별하였다. 상기 선별된 132개의 균주는 다시 MRS 액체배지(시스테인 0.05% 함유)에 배양하여 생존하는 균주를 선발하였다.
도 2는 상기의 방법으로 얻어진 미생물을 랩지노믹스 검사센터에 의뢰하여 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과로, 본 발명에서 얻어진 균주는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)임을 확인하였다. 상기 분리된 균주는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801(서열번호 2)로 명명하였으며, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁번호 KCCM12346P로 기탁하였다.
실시예 4. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 발효 용해물의 제조
실시예 3에서 분리동정된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균을 MRS 고체 배지에서 30℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 24시간 혐기조건에서 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 또는 modified MRS 액체 배지에 접종한 후 배양기에서 30℃ 내지 40℃에서 24시간 진탕 혐기 조건에서 배양시켜 종균을 형성하였다.
MRS 또는 modified MRS 액체 배지에서 미리 배양한 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균을 25℃ 내지 37℃에서 10시간 내지 24시간 동안 교반하였다. 상기 교반은 50 내지 200rpm의 교반속도로 이루어졌다. 상기 교반시 조건은 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 사용하여 혐기 조건을 유지하였고, pH는 5.0 내지 6.0인 상태를 유지하였다. 상기 교반 발효는 균이 2.0×1011 cfu/ml의 농도로 발효를 하였다.
상기 제조된 2.0×1011 cfu/ml의 생균이 용해된 용해물을 10배씩 희석하여 2.0×106, 2.0×107, 2.0×108, 2.0×109, 2.0×1010 cfu/ml의 생균이 용해된 용해물을 제조하였다.
실험예 1. 피부 미백 효과를 갖는 프로바이오틱스 용해물의 피부에 실효성이 있는 균수의 확인
우수한 피부 미백효과를 나타내는 프로바이오틱스 용해물의 종류 및 농도를 확인하기 위하여, 프로바이오틱스 용해물을 멜라닌 생성이 유도된 쥐의 색소세포에 처리하여 멜라닌 함량을 마이크로플레이트 리더로 측정하였다.
쥐의 색소세포(murine melanoma)인 B16 F10 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에 현탁시켜 웰당 1×105 cells으로 6-웰 플레이트에 접종하여 웰 바닥에 부착될 때까지 배양하였다. 멜라닌 생성 유도를 위하여, 0.1 μM α-MSH를 처리하고, 이후 2.0×108 cfu/ml의 생균수로 용해한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 용해물 또는 2.0×106, 2.0×107, 2.0×108, 2.0×109, 2.0×1010 cfu/ml의 생균수가 용해된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802 용해물을 첨가한 후 3일간 배양하였다. 멜라닌 생성능 실험의 양성대조군으로 알부틴 100 ppm 을 처리하였다. 배양한 세포는 PBS로 씻고 트립신(trypsin)으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계(hematocytometer)로 계수하여 각 처리 그룹별로 1×106 cells/mL으로 동일한 세포수가 되도록 모아, 1000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 회수된 세포를 60에서 1시간 건조시켜 10% DMSO가 포함된 1M NaOH용액 100 ㎕을 넣어 세포내의 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌 액을 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다.
도 3은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물이 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml의 생균 수에서 우수한 피부 미백 효과를 갖는다는 것을 확인한 결과로, 도 3A는 동일한 농도(2.0×108 cfu/ml)에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 멜라닌 함량을 비교한 그래프이고, 도 3B는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물의 농도에 따른 멜라닌 함량을 비교한 그래프이다.
그 결과 도 3A에 나타난 바와 같이, 동일한 고농도의 프로바이오틱스 용해물 중에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물이 멜라닌 생성 억제 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 또한 도 3B에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물은 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml의 생균 수로 용해된 농도에서 멜라닌 생성 억제 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 다만, 2.0×1010 cfu/ml의 생균 수로 용해된 농도에서는 멜라닌 생성 억제 효과가 오히려 감소함을 확인하였다.
이는 프로바이오틱스 용해물 중에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물이 피부 미백 효과가 가장 우수함을 나타내며, 피부 미백 효과를 목적으로 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 용해물을 제조시, 적정 생균수는 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml임을 알 수 있다. 한편, 도 5에서 후술하는 바와 같이, 2.0×1010 cfu/ml의 농도에서는 프로바이오틱스가 생성하는 여러 종류의 유기산들도 고농도로 존재하기 때문에 쥐의 색소세포 생육을 저해하게 되어 멜라닌의 생성에 영향을 주어 멜라닌 생성 억제 효과가 오히려 감소한 것으로 보인다.
실험예 2. 피부 탄력 증가 효과를 갖는 프로바이오틱스 용해물의 피부에 실효성이 있는 균수의 확인
우수한 피부 탄력 증가 효과를 나타내는 프로바이오틱스 용해물의 종류 및 농도를 확인하기 위하여, 프로바이오틱스 용해물을 사람 섬유아세포에 처리하여 프로콜라겐(Procollagen) 함량을 Pro-collagen ELISA KIT로 측정하였다.
사람 섬유아세포(Human Dermal fibroblast; HDF)를 48 well plate(SPL, 한국)에 1X105/well의 수만큼 분주한 후， 37°C，5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양했다. 이후 배지를 제거하고 HBSS으로 워싱 후 무처치군을 제외한 나머지 세포군에 2.0×108 cfu/ml의 생균수로 용해한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 용해물 또는 2.0×106, 2.0×107, 2.0×108, 2.0×109, 2.0×1010 cfu/ml의 생균수가 용해된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 용해물을 첨가하여 72시간 동안 추가로 배양했다. 그 후 배지를 희석한 후 Pro-collagen ELISA KIT(R&D Systems, 미국)를 이용하여 프로콜라겐 합성능을 평가하였다.
도 4는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물이 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml의 생균 수에서 우수한 피부 탄력 증가 효과를 갖는다는 것을 확인한 결과로, 도 4A는 동일한 농도(2.0×108 cfu/ml)에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 프로콜라겐 함량을 비교한 그래프이고, 도 4B는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물의 농도에 따른 프로콜라겐 함량을 비교한 그래프이다.
그 결과 도 4A에 나타난 바와 같이, 동일한 고농도의 프로바이오틱스 용해물 중에 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물이 프로콜라겐 발현 증가 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 또한 도 4B에 나타난 바와 같이, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물은 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml의 생균 수로 용해된 농도에서 프로콜라겐 발현 증가 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 다만, 2.0×1010 cfu/ml의 생균 수로 용해된 농도에서는 프로콜라겐 발현 증가 효과가 오히려 감소함을 확인하였다.
이는 프로바이오틱스 용해물 중에 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물이 피부 탄력 증가 효과가 가장 우수함을 나타내며, 피부 탄력 증가 효과를 목적으로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 용해물을 제조시, 적정 생균수는 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml임을 알 수 있다. 한편, 도 5에서 후술하는 바와 같이, 2.0×1010 cfu/ml의 농도에서는 프로바이오틱스가 생성하는 여러 종류의 유기산들도 고농도로 존재하기 때문에 사람 섬유아세포의 생육을 저해하게 되어 프로콜라겐의 생성에 영향을 주어 프로콜라겐 발현 증가 효과가 오히려 감소한 것으로 보인다.
실험예 3. 고농도 프로바이오틱스 용해물의 독성 평가
상기 제조한 고농도 프로바이오틱스에 세포 독성이 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 멜라닌생성세포(B-16 F10)와 인간 섬유아세포(Hs68), 및 각질형성세포(HaCaT)를 각각 96-웰 플레이트에 1.0 x 106 cells/mL로 접종한 후, 5% CO2, 37℃ 하에서 24 시간 배양하였다. 그 다음 2.0×109 cfu/ml 및 2.0×1010 cfu/ml의 생균수로 용해한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 용해물을 혈청이 없는 DMEM 배지에 세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각각의 웰에 3-MTT((4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; MTT) 용액을 넣고 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 웰의 배지를 제거하고, 각 웰당 DMSO(dimethylsulfoxide; DMSO)를 넣고 ELISA 리더(reader)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는 2.0×109 cfu/ml 및 2.0×1010 cfu/ml의 농도에서 프로바이오틱스 용해물의 종류에 따른 세포의 생존율을 비교한 그래프이다. 그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 2.0×109 cfu/ml의 생균 수로 용해된 프로바이오틱스 용해물들은 세포 독성이 나타나지 않았고, 2.0×1010 cfu/ml의 생균 수로 용해된 프로바이오틱스 용해물들은 모두 세포 독성을 나타남을 확인하였다.
이는 2.0×1010 cfu/ml의 농도에서는 프로바이오틱스가 생성하는 여러 종류의 유기산들도 고농도로 존재하기 때문에 세포의 생육을 저해함에서 기인하는 것으로 보여진다. 결과적으로 기술적으로는 2.0×1010 cfu/ml 이상의 프로바이오틱스를 용해하는 것도 가능하나, 높은 제조 가격으로 인해 실효성이 있는 농도로 제품에 적용하는데 제한이 있고, 세포 독성으로 인해 피부 자극을 유발할 수 있는 문제점이 있다. 따라서 화장품 제품에 적용시 실효성이 있으면서 피부에 안전한 프로바이오틱스 용해물의 적정 균 수는 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml임을 알 수 있다.
<110> Cosmax, Inc.
Morechem Co., Ltd.
<120> A composition comprising a high concentration of probiotics
effective for skin
<130> PN123485
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1579
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Lactobacillus rhamnosus M311802 16S ribosomal RNA
<400> 1
tttatatgag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca 60
agtcgaacga gttctgatta ttgaaaggtg cttgcatctt gatttaattt tgaacgagtg 120
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccttaagt gggggataac atttggaaac 180
agatgctaat accgcataaa tccaagaacc gcatggttct tggctgaaag atggcgtaag 240
ctatcgcttt tggatggacc cgcggcgtat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 300
ggcaatgata cgtagccgaa ctgagaggtt gatcggccac attgggactg agacacggcc 360
caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag 420
caacgccgcg tgagtgaaga aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgttg gagaagaatg 480
gtcggcagag taactgttgt cggcgtgacg gtatccaacc agaaagccac ggctaactac 540
gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa 600
gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagccct cggcttaacc gaggaagtgc 660
atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga 720
aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac 780
gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta 840
aacgatgaat gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgccgcagct aacgcattaa 900
gcattccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg 960
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 1020
acatcttttg atcacctgag agatcaggtt tccccttcgg gggcaaaatg acaggtggtg 1080
catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1140
cttatgacta gttgccagca tttagttggg cactctagta agactgccgg tgacaaaccg 1200
gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc 1260
tacaatggat ggtacaacga gttgcgagac cgcgaggtca agctaatctc ttaaagccat 1320
tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1380
ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1440
gagagtttgt aacacccgaa gccggtggcg taaccctttt agggagcgag ccgtctaagg 1500
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<211> 1504
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<213> Unknown
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<223> Bifidobacterium longum M311801 16S ribosomal RNA
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tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacgg gatccatcaa 60
gcttgcttgg tggtgagagt ggcgaacggg tgagtaatgc gtgaccgacc tgccccatac 120
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tctgggaaag ctttcgcggt atgggatggg gtcgcgtcct atcagcttga cggcggggta 240
acggcccacc gtggcttcga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acattgggac 300
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ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggc ttgacatgtt 960
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tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgcccc 1080
gtgttgccag cggattgtgc cgggaactca cgggggaccg ccggggttaa ctcggaggaa 1140
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ggccggtaca acgggatgcg acgcggcgac gcggagcgga tccctgaaaa ccggtctcag 1260
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tgggcagcac ccgaagccgg tggcctaacc ccttgtggga tggagccgtc taaggtgagg 1440
ctcgtgattg ggactaagtc gtaacaaggt agccgtaccg gaaggtgcgg ctggatcacc 1500
tcct 1504
Claims (10)
- 프로바이오틱스 용해물을 포함하고, 상기 용해물에 용해된 균의 수가 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml이고, 상기 균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 또는 이들의 조합인 것인 피부 미백 및 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) M311802 (수탁번호: KCCM12344P) 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) M311801 (수탁번호: KCCM12346P)인 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 피부세포에서 멜라닌 생성을 억제하거나, 프로콜라겐(procollagen)을 발현하는 것인 조성물.
- 삭제
- 프로바이오틱스 용해물을 포함하고, 상기 용해물에 용해된 균의 수가 2.0×108 내지 2.0×109 cfu/ml이고, 상기 균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 또는 이들의 조합인 것인 피부 미백 및 피부 탄력 개선용 피부외용제 조성물.
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| KR1020180174187A KR102123022B1 (ko) | 2018-12-31 | 2018-12-31 | 피부에 효능이 있는 고농도 프로바이오틱스를 포함하는 조성물 |
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