KR20240008176A - 신규한 락토바실러스 유산균 hk9 복합 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장품 조성물 - Google Patents
신규한 락토바실러스 유산균 hk9 복합 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 HK9 복합 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 마치현, 홍삼, 당귀, 구운 감초, 병풀, 알로에 아보레센스 및 더덕 뿌리를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 생균과 함께 발효시켜 얻은 발효물의 추출물은 다양한 피부 향장 기능성이 현저히 향상되는 효과가 있으며, 세포독성 역시 낮아 기능성 화장료의 유효성분으로 유용할 수 있다.
Description
본 발명은 김치에서 분리한 신규한 락토바실러스 플란타룸 HK9 복합 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장품 조성물에 관한 것이다.
유산균이 과거부터 전통적으로 사용되고 있는 분야인 발효 유제품을 비롯하여 각종 식품에 전 세계적이고 광범위하게 이용되고 있는 산업적으로 중요한 미생물이다. 최근에 식품 외에도 인체의 여러 부위에 다양하게 작용하는 유효한 효능들이 알려 지면서 유익 유산균들을 이용해 피부에 도움이 되는 화장품에 적용하고자 하는 연구들이 많이 이루어지고 있다. 이런 화장품 산업에 이용하고자 하는 연구들은 대부분 기대하고자 하는 활성을 갖는 균주를 자연계에서 새롭게 ?O아 활용하고자 하는 연구들이 대부분이다. 하지만 이러한 목적하는 유산균이 새롭게 발견하는 경우는 상대적으로 적으며, 이를 이용한 기능성 화장품 개발에 많은 시간이 소요되고 있는 실정이다.
따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해 기존에 유동되고 있는 유산균으로 새로운 기능성 효과를 탐색하여야 한다. 특히, 유산균 자체를 파쇄시킨 파쇄물과 생균을 활용한 발효물은 유산균을 활용한 새로운 패러다임으로 항산화 및 미백효과 등의 다양한 생리활성을 증진시킨다고 알려져 있다.
이에, 본 발명자는 기탁번호 김치에서 분리한 신규한 유산균으로서, 기탁번호 KFCC 11933P으로 기탁된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 생균과 함께 복합 천연물을 발효시켜 얻은 발효물의 추출물에서, 다양한 향장 기능성이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 마치현, 홍삼, 당귀, 구운 감초, 병풀, 알로에 아보레센스 및 더덕 뿌리를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HK9 생균과 함께 발효시켜 얻은 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
상기 락토바실러스 플란타룸 HK9 생균은 기탁번호 KFCC 11933P으로 기탁된 생균을 사용하는 것이 특히 바람직하고, 하기 유산균을 추가로 사용할 수 있다.
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium longum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus HK9, Lactobacillus paracasei, Saccharomyces exiguus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae, Rhodopseudomonas palustris, Saccharomyces fragilis, Aspergilus niger, Bacillus subtilus, Bacillus stearothermophilus 및 Acetobacter xylinum 중 1종 이상.
상기 추출물은 상기 발효물을 실온에서 20-100 kHz 주파수로 60-120분 동안 초음파 처리하여 생균을 파쇄시킨 후 고상의 발효 잔여물을 제거한 상등액을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물은 항산화; 광노화 억제; 피부 주름 예방 또는 개선; 피부 염증 예방 또는 개선; 피부 미백; 피부 보습; 피부 유익균 항상성 개선; 여드름 예방 또는 개선; 및 스킨 마이크로비움 환경 개선 효능을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 기능성 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 스킨, 로션, 세럼, 에센스, 에멀젼, 파우더, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 클렌저, 비누, 샴푸, 린스, 입욕제, 세정제, 콘실 스틱 등의 화장료 형태로 사용할 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
본 발명에서 사용한 락토바실러스 플란타룸 HK9 (기탁번호 KFCC 11933P) 생균의 염기서열(DNA sequence) 분석결과는 하기와 같다.
TGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAG
TGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAA
ACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTC
GGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACC
ATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGG
CCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGG
AGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAA
CATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT
ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTA
AAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGT
GCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTG
ACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCG
TAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATT
AAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC
CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCT
TGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGG
TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA
CCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAAC
CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT
GCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCC
ATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC
GCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC
ATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAG
본 발명에 따른 마치현, 홍삼, 당귀, 구운 감초, 병풀, 알로에 아보레센스 및 더덕 뿌리를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HK9 생균과 함께 발효시켜 얻은 발효물의 추출물은 다양한 피부 향장 기능성이 현저히 향상되는 효과가 있으며, 세포독성 역시 낮아 기능성 화장료의 유효성분으로 유용할 수 있다.
도 1은 실시예 1 및 비교예 1-10의 세포독성을 평가한 그래프이다.
도 2는 실시예 1 및 비교예 1-10의 광노화 보호 활성을 평가한 그래프이다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1-10의 콜라겐 생성율을 비교한 그래프이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1-10의 MMP-1 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 5은 실시예 1 및 비교예 1-10의 PGE2(Prostaglandin E2)의 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1-10의 티로시나제 효소의 활성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 7은 실시예 1(HK9 복합 발효 추출물), 비교예 1-10의 히알루론산 생성양을 비교한 그래프이다.
도 8은 실시예 1 및 비교예 1-10의 피부 유익균인 스타필로코코스 에피더미스의 생육을 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명에서 사용한 락토바실러스 플란타룸 HK9 (기탁번호 KFCC 11933P) 유전계통수(Phylogenetic tree) 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1 및 비교예 1-10의 광노화 보호 활성을 평가한 그래프이다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1-10의 콜라겐 생성율을 비교한 그래프이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1-10의 MMP-1 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 5은 실시예 1 및 비교예 1-10의 PGE2(Prostaglandin E2)의 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1-10의 티로시나제 효소의 활성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 7은 실시예 1(HK9 복합 발효 추출물), 비교예 1-10의 히알루론산 생성양을 비교한 그래프이다.
도 8은 실시예 1 및 비교예 1-10의 피부 유익균인 스타필로코코스 에피더미스의 생육을 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명에서 사용한 락토바실러스 플란타룸 HK9 (기탁번호 KFCC 11933P) 유전계통수(Phylogenetic tree) 분석결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
화장료 조성물
본 발명은 유효물질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태일 수 있다. 더욱 구체적인 형태로는 화장수, 유액, 크림, 스킨, 로션, 세럼, 에센스, 에멀젼, 파우더, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 클렌저, 비누, 샴푸, 린스, 입욕제, 세정제 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 폼(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 유효물질에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 유효물질을 함유하는 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 유효물질이 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 유효물질을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> HK9 복합 발효물(기탁번호 KFCC 11933P)의 추출물 제조
1-1. 발효용 배지의 준비
마치현, 홍삼, 당귀, 구운 감초, 병풀, 알로에 아보레센스 및 더덕 뿌리를 모두 건조 분말 상태로 준비하고, 이들을 각각 1:1:1:1:1:1:1 중량비로 혼합하여 총 100g의 혼합분말을 준비하였고, 이를 증류수 900 mL에 첨가하였다.
상기 혼합물에 yeast extract 0.5 wt%, peptone 1 wt%, glucose 2 wt%, magnesium sulfate 0.01 wt%, manganese sulfate 0.005 wt%, potassium phosphate 0.2 wt% 및 tween80 0.1 wt%를 추가로 첨가하고 멸균하여 발효용 배지를 준비하였다.
1-2. 복합 발효물의 제조
유산균 균주로서 락토바실러스 플란타룸 HK9 (기탁번호 KFCC 11933P)를 MRS(De Man, Rogosa and Sharpe agar) 배지에서 미리 배양해 균체 농도가 1x105 CFU/mL 내지 1x108 CFU/mL로 종배양액을 준비한다.
다음으로, 상기 1-1에서 준비한 발효용 배지에 상기 종배양액을 5 %(v/v) 농도로 접종한 후, 35 ℃에서 3 일간 100 rpm 의 교반 속도로 배양하여 HK9 복합 발효물 (HK9 Ultra Complex)을 제조하였다.
1-3. HK9 복합 발효물의 추출물 제조
발효가 완료된 배양액 전체를 실온에서 초음파 처리기에서 80 KHz의 주파수로 90분 동안 초음파 처리를 진행하여 유산균을 파쇄시킨 후, 원심분리를 진행하여 상층액만 취해 동결 건조를 진행하여 분말로 제조 후 실험 시료로 사용하였다.
상기 상층액에는 마치현, 홍삼, 당귀, 구운 감초, 병풀, 알로에 아보레센스, 더덕 뿌리 분말이 제거된 상태이다.
<비교예 1> 마치현 추출물 제조
마치현 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 마치현 추출물을 비교예 1로서 준비하였다.
<비교예 2> 홍삼 추출물 제조
홍삼 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 홍삼 추출물을 비교예 2로서 준비하였다.
<비교예 3> 당귀 추출물 제조
당귀 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 당귀 추출물을 비교예 3으로서 준비하였다.
<비교예 4> 구운 감초 추출물 제조
구운감초 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 구운감초 추출물을 비교예 4로서 준비하였다.
<비교예 5> 병풀 추출물 제조환류냉각
병풀 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 병풀 추출물을 비교예 5로서 준비하였다.
<비교예 6> 알로에 아보레센스 추출물 제조
알로에 아보레센스 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 알로에 아보레센스 추출물을 비교예 6로서 준비하였다.
<비교예 7> 더덕 뿌리 추출물 제조
당귀 뿌리 분말 100g과 증류수 900mL를 계량하여 환류냉각 추출장치에 넣고 100℃에서 24시간 열수추출 하였다. 추출 용액을 거름종이로 여과하여 더덕 뿌리 추출물을 비교예 7로서 준비하였다.
<비교예 8> 락토바실러스 플란타룸(기탁번호 ATCC 14917) 발효물 제조
락토바실러스 플란타룸(기탁번호 ATCC 14917) 배양액 전체를 실온에서 초음파 처리기에서 300 KHz의 주파수로 120분 동안 초음파 처리를 진행하여 유산균을 파쇄시킨 후, 원심분리를 진행하여 상층액만 취해 동결 건조를 진행하여 분말로 제조 후 실험 시료로 사용하였다.
<비교예 9> 복합 발효물(기탁번호 ATCC 10241)의 추출물 제조
실시예 1에서 락토바실러스 플란타룸 HK9 (기탁번호 KFCC 11933P) 대신에 락토바실러스 플란타룸 (기탁번호 ATCC 10241)을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 복합 발효물의 추출물을 제조하였다.
<비교예 10> 복합 발효물(기탁번호 ATCC 14917)의 추출물 제조
실시예 1에서 락토바실러스 플란타룸 HK9 (기탁번호 KFCC 11933P) 대신에 락토바실러스 플란타룸 (기탁번호 ATCC 14917)을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 복합 발효물의 추출물을 제조하였다.
<실험예 1> 세포 독성 평가
세포 배양
사람 피부 세포주의 하나인 CCD986-sk를 우태아혈청(Fetal bovine serum)을 10% 첨가한 배지(Dulbecco's modified Eagel' medium)에서 배양하였다. 상기 세포는 배양접시에 배양 후 2일마다 배지를 교환해주면서 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 대식 세포주인 Raw cell도 상기와 같은 방법으로 배양을 진행하였다.
세포 독성 평가
사람 피부 세포주(CCD986-sk)를 48-well 플레이트에 1×104cell/well 농도로 접종한 뒤, 실시예 및 비교예 시료들을 각각 농도별 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% (w/v)로 투여한 후, 24시간 배양 후 물질투여 없이 배양한 세포를 음성 대조군으로 하여 세포 생존도 분석을 Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)를 사용해 진행하였다.
도 1은 실시예 1 및 비교예 1-10의 세포독성을 평가한 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1 내지 10 모두 전 농도에서 세포 생존율 90% 이상을 나타내어 세포독성이 관찰되지 않아, 화장료 유효성분으로서 안전한 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 항산화 활성 평가
항산화 활성 실험은 DPPH 소거활성 측정 실험을 하였다. 대조군으로 Trolox 10μg/ml, 실시예 및 비교예의 시료 각각 1%(w/w) 농도 수용액을 100mM sodium acetate buffer(pH 5.5) 990μL를 분주한 시험관에 0.5mM DPPH 용액 (Abs, EtOH soln.) 0.5 mL를 넣어 교반하고, 암실에서 5분간 반응을 유도한 후 잔존 radical의 농도를 spectrophotometer를 이용하여 517nm에서 측정하였다. As와 Ac에 실험군과 대조군의 흡광도 값을 각각 아래 수학식 1에 대입하여 계산하였다. 여기서 As는 시료의 흡광도, Ac는 무처리군의 흡광도 측정값이다.
[수학식 1]
| 시료명 | DPPH free radical scavenging ratio (%) |
| Trolox (positive control) | 69 |
| 실시예 1 | 82.12 |
| 비교예 1 | 51.04 |
| 비교예 2 | 49.11 |
| 비교예 3 | 57.12 |
| 비교예 4 | 38.91 |
| 비교예 5 | 40.92 |
| 비교예 6 | 38.12 |
| 비교예 7 | 49.63 |
| 비교예 8 | 41.72 |
| 비교예 9 | 61.38 |
| 비교예 10 | 59.24 |
표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1이 양성 대조군인 trolox 뿐만 아니라 비교예 1-10과 대비해 항산화 활성이 현저히 높게 나타남을 확인할 수 있다.
<실험예 3> 자외선에 대한 광노화 보호 효능 평가
자외선으로부터 인간 피부세포를 보호할 수 있는지 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 사람피부세포주(CCD986-sk)는 10% 우혈청을 포함한 DMEM배지에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 그 다음, 배양된 CCD986-sk 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 1ⅹ104 개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 및 비교예의 시료를 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% (w/w) 농도로 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 이후 인산완충용액(PBS)으로 세척하고, PBS를 넣은 상태에서 200mJ/cm2농도의 UVB를 조사하였다. 시료를 처리하지 않은 세포들은 대조구로 동일하게 배양하였다.
자외선 조사 24시간 후, 실시예 1 및 비교예 1-10의 시료를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에 3-[4,4-디메틸아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 용액을 넣고 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 이후 DMSO를 넣고 녹인 후 ELISA reader를 이용하여 540nm의 파장에서 형성된 포르마잔 다이의 광학적 농도(OD)를 측정하였다. 자외선을 조사하지 않은 세포의 OD값을 100%로 계산하여 상대적인 값을 세포의 생존수로 나타내어 광노화 보호 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 실시예 1 및 비교예 1-10의 광노화 보호 활성을 평가한 그래프이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않은 대조군(UVB)의 경우 자외선 처리에 따라 세포 생존도가 50% 이하로 떨어지는 것을 확인할 수 있는 반면에, 실시예 및 비교예 시료를 처리한 시험군에서는 대조군 보다 세포 생존도가 향상되는 결과를 보였으며, 특히 실시예 1이 비교예 1-10의 모든 대조 시료들에 비해 현저한 세포 생존도의 향상 결과를 확인할 수 있었다. 이 결과는 실시예 1에 따른 HK9 복합 발효물의 추출물이 자외선에 대한 피부세포 보호 효능에 현저한 효과가 있음을 의미한다.
<실험예 4> 콜라겐 생성율 평가
피부 탄력에 관여하는 콜라겐 생성량을 증진시켜 주름 개선 효능이 있는지 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 인간 사람피부세포주(CCD986-sk)는 10% 우혈청을 포함한 DMEM배지에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 그 다음, 배양된 CCD986-sk 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 1ⅹ104 개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 및 비교예의 시료를 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%(w/v) 농도로 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 시료를 처리하지 않은 세포들은 대조군(control)으로 동일하게 배양하였다. 24시간 배양 후, 배지를 취하여 Protocollagen Type 1 c-peptide EIA kit(TAKARA)를 사용하여 각 처리군의 콜라겐의 양을 아무것도 처리하지 않은 control과 비교 측정하여, 도 3에 나타내었다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1-10의 콜라겐 생성율을 비교한 그래프이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 비교예 1-10의 경우 대조군(control)에 비해 큰 증가가 있지 않은 반면, 실시예 1의 경우 현저한 콜라겐 생성을 확인할 수 있었다.
<실험예 5> 콜라겐분해효소(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 생성 억제 효능 평가
피부 세포는 자외선 노출에 의하여 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 생성이 증가하게 되고, 이렇게 생성된 MMP-1은 피부의 콜라겐을 분해하여 피부 주름을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 실험예에서는 자외선 조사에 의하여 유도되는 콜라겐분해효소(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 생성 억제 효능을 평가하여 주름 개선 효능이 있는 지를 확인하였다.
구체적으로, 인간 사람피부세포주(CCD986-sk)는 10% 우혈청을 포함한 DMEM배지에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 그 다음, 배양된 CCD986-sk 세포주를 트립신으로 처리하여 단일세포 현탁액을 만든 후, 6-well에 1ⅹ104 개씩 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후, 우혈청이 포함되지 않은 DMEM배지로 교환하여 다시 24시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 및 비교예의 시료를 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% (w/v) 농도로 각각 첨가하여 24시간 배양하고 UVB를 조사하였다. 그 다음, 배양한 배지를 수거하여 MMP-1 생성양은 머크사의 QIA55 MMP-1, ELISA Kit 장비를 잉요하여 측정하였다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1-10의 MMP-1 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 시료를 처리하지 않고 자외선(UVB) 처리한 군에서는 MMP-1 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있고, 비교예 1-10의 대부분의 시료에서 MMP-1 생성 억제율이 높지않은 반면, 실시예 1의 경우는 이들에 비해 MMP-1 생성 억제율이 현저히 높은 것을 알 수 있다.
<실험예 6> 항염증 효능 평가
시료들의 피부 염증 억제 효과를 평가하기 위해 대식 세포주인 RAW 264.7 세포를 이용하여 48-well plate에 1×10⁴ cell/well로 분주하고 24시간동안 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 24시간 이후 실시예 및 비교예의 시료를 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% (w/v) 농도로 처리하여 추가 배양 후 LPS(Lipopolysaccharide)를 well당 200ng씩 투여하여 염증 반응을 유도하였다. 이후 배양한 배지 150μL를 PGE2(Prostaglandin E2)가 도포된 96-well plate에 옮겨담고 50μL의 1차 항체 용액을 분주하여 상온의 진탕배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음 50μL의 PGE2 접합체를 첨가하여 상온의 진탕배양기에서 2시간 동안 추가 배양하였다. 이후 각 well을 PBS 용액으로 세척 해준 다음, 암실에서 기질 용액을 200μL 추가하여 30분간 배양하였다. 마지막으로 100μL의 stop solution을 추가하여 반응을 종료시키고 450nm에서 마이크로 플레이트 판독기를 이용해 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로는 동량의 LPS를 처리한 정상 세포로 설정하였다.
도 5은 실시예 1 및 비교예 1-10의 PGE2(Prostaglandin E2)의 생성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, LPS로 염증 반응을 유도한 음성대조군은 PGE2 생성을 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 비교예 1-10 의 모든 시료들에서는 PGE2 생성이 다소 감소되는 경향을 나타냈다. 이이 반해, 실시예 1의 경우 PGE2 생성이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이로서 실시예 1에 따른 HK9 복합발효추출물이 우수한 항염증 효능이 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 7> 미백 효능 평가
시료들의 미백 효능을 확인하기 위해 티로시나제 활성 저해율을 평가하였다. 구체적으로, 버섯 유래의 티로시나제를 0.1M 인산완충용액에 2000 units/mL로 녹여 동결 보존하였고 기질로 L-3,4-디 하이드록시페닐알라닌 (L-3,4-dihydroxylphenyl alanine, L-DOPA)을 직전에 조제하여 분석하였다.
티로시나제 활성 저해율은 티로시나제 (78 units/mL), 1/15M 인산 완충용액을 함께 넣어 25℃에서 5분간 미리 반응시키고 실시예 및 비교예의 시료를 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% (w/v) 농도로 투여 하였고, 양성대조군으로는 알부틴을 사용하여 처리하였다. 다음으로, L-DOPA를 넣어 475nm에서 10분간 흡광도를 측정한 뒤 하기 수학식으로부터 티로시나제 저해율(%)을 산출하였다.
티로시나제 활성 저해율(%)=[(A-B)-(C-D)/(A-B)]x100
A: 시료가 없는 대조군의 475nm에서 흡광도
B: 시료와 효소가 없는 대조군의 475nm에서 흡광도
C: 시료와 효소를 넣은 실험군의 475nm에서 흡광도
D: 효소가 없는 대조군의 475nm에서 흡광도
도 6은 실시예 1 및 비교예 1-10의 티로시나제 효소의 활성 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 정상 대조군의 티로시나제 활성 100% 대비 알부틴을 처리한 양성대조군은 티로시나제 활성이 약 57%로 나타나 티로시나제 활성 저해율이 약 43%로 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 실시예 및 비교예 모두 티로시나제 활성 저해 효능이 나타났다. 특히, 실시예 1의 티로시나제 활성 저해율이 비교예 1-10의 모든 시료들에 비해 현저히 우수하게 나타났고, 실시예 1의 경우 1% 처리농도에서 양성대조군인 알부틴 보다도 미백 효능이 우수함을 확인할 수 있었다.
<실험예 8> 보습 효능 평가
보습 효능을 확인하기 위해 가장 보편적으로 사용하는 hyaluronic acid(HA) 생성량을 측정했다.
사람 각질세포주 (HaCAT)를 2ⅹ105/mL 농도로 6-well plate에 접종 후 24시간 배양 후 serum-free DMEM으로 배지를 교체하며, 실시예 및 비교예의 시료들을 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% (w/v) 농도로 처리하였다. 샘플 처리 후 24시간이 지난 뒤, 배지를 회수하여 15,000ⅹg에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 사용해 HA 측정용 ELISA kit를 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 의해 측정하여 아무것도 처리하지 않은 대조군과의 상대적인 비교량을 도 7에 나타내었다.
도 7은 실시예 1(HK9 복합 발효 추출물), 비교예 1-10의 히알루론산 생성양을 비교한 그래프이다.
도 7에 나타난 바와 같이, 아무 시료도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 비교예 1-10의 모든 시료 처리군에서는 대조군 대비 히알루론산 생성량에 크게 증가하지 않은 반면에, 실시예 1의 시료 처리군에서는 히알루론산 생성량이 현저히 향상됨을 확인할 수 있었다. 이 결과는 실시예 1에 따른 HK9 복합 발효물의 추출물이 피부 보습을 통한 피부 장벽 개선에 우수한 효능이 있음을 의미한다.
<실험예 9> 피부에 도움을 주는 미생물군총 (스킨 마이크로비움, Skin Microbiome) 유지 효능 평가
실시예 1의 복합 발효물의 추출물이 피부에 우호적인 미생물군총 유지에 도움을 줄 수 있는 지를 확인하기 위해 인체 피부에 생존하면서 피부에 긍정적인 효과를 준다고 알려진 피부 유익균인 스타필로코코스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis) 균의 생육 촉진과 동시에 피부 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네 (Propionibacterium acnes) 균과 피부에 염증을 일으키는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 균의 생육 억제능을 평가하였다. 우선 Tryptic Soy Broth (TSB) 미생물 배지에 스타필로코코스 에피더미스 ATCC 12228 균주를 1×106 CFU/mL 농도로 접종하고, 여기에 실시예 및 비교예1-10의 시료들을 0.05%, 0.03%, 0.01% (w/v) 농도로 처리하였다. 이 배양액을 35-37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 뒤 배양액을 600nm 에서 흠광도를 측정해 아무것도 처리하지 않은 대조군의 흡광도와 비교해 상대 생육도 (Relative cell growth) 로 생장률을 비교하였다.
도 8은 실시예 1 및 비교예 1-10의 피부 유익균인 스타필로코코스 에피더미스의 생육을 비교한 그래프이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 아무 시료도 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 비교예 1-10의 모든 시료 처리 농도군에서는 대조군 대비 피부 유익균의 생육이 크게 억제되거나 거의 증가되지 않은 반면, 실시예 1의 시료 처리군에서는 피부 유익균의 성장이 현저히 촉진됨을 확인할 수 있었다.
다음으로, 실시예 1의 복합 발효물의 추출물이 피부 유익균의 증식과 함께 피부에 문제를 일으키는 여드름 균의 생육을 억제하는 지를 확인하기 위해 피부 여드름 원인 균의 하나인 프로피오니박테리움 아크네 ATCC 6919 균을 RCM (Reinforced Clostridial Medium) 배지에 37℃에서 혐기적으로 2일간 배양한 배양액 200μL를 0.7% soft agar 를 포함한 배지 12 mL가 들어있는 페트리디쉬에 넣고 잘 흔들어 섞는다. 이후 15-20분 이내에 실시예 및 비교예의 시료들을 0.05%, 0.10%, 0.50% (w/v) 농도로 제조된 검액 20 μL를 주입한 paper disk 를 페트리디쉬에 올려 놓았다. 이 페트리디쉬를 혐기 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양후, disc의 직경을 포함한 clear zone을 측정하여 항균 정도를 측정하였다. 대조군으로는 화장품 제조에 많이 사용되는 항균제인 phenoxyethanol도 같은 농도로 처리해 형성된 clear zone 의 크기를 비교하였다.
표 2는 실시예 1 및 비교예 1-10의 피부 유해균인 프로피오니박테리움 아크네(P. acne)의 생육이 억제되서 나타난 clear zone의 크기를 비교한 표이다.
| 시료명 | Clear Zome (mm) | ||
| 0.05% | 0.1% | 0.5% | |
| phenoxyethanol (control) | 12.8 | 14.3 | 16.2 |
| 실시예 1 (HK9 복합 발효물의 추출물) |
12.2 | 13.0 | 17.9 |
| 비교예 1 (마치현 추출물) |
9.2 | 10.8 | 11.7 |
| 비교예 2 (홍삼 추출물) |
12.3 | 12.9 | 13.8 |
| 비교예 3 (당귀 추출물) |
8.1 | 10.6 | 11.0 |
| 비교예 4 (구운감초 추출물) |
8.8 | 9.1 | 10.4 |
| 비교예 5 (병풀 추출물) |
8.0 | 8.9 | 9.5 |
| 비교예 6 (알로에 아보레센스 추출물) |
10.4 | 11.6 | 12.3 |
| 비교예 7 (더덕 뿌리 추출물) |
9.0 | 10.7 | 11.6 |
| 비교예 8 (락토바실러스 플란타룸 HK9 배양액 추출물) |
10.9 | 11.6 | 12.1 |
| 비교예 9 (ATCC 10241 복합 발효물의 추출물) |
11.1 | 12.2 | 14.1 |
| 비교예 10 (ATCC 14917 복합 발효물의 추출물) |
11.0 | 12.0 | 13.9 |
다음으로, 실시예 1의 복합 발효물의 추출물이 피부 유익균의 증식 및 피부 여드름 균의 생육 억제와 함께 피부 염증을 유발하는 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 6538 균을 우선 Tryptic Soy Broth (TSB) 미생물 배지로 37℃에서 진탕하며 2일간 배양한 배양액 200μL를 0.7% soft agar 를 포함한 배지 12 mL가 들어있는 페트리디쉬에 넣고 잘 흔들어 섞는다. 이후 15-20분 이내에 실시예 및 비교예의 시료들을 0.05%, 0.10%, 0.50% (w/v) 농도로 제조된 검액 20 μL를 주입한 paper disk 를 페트리디쉬에 올려 놓았다. 이 페트리디쉬를 혐기 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양후, disc의 직경을 포함한 clear zone을 측정하여 항균 정도를 측정하였다. 대조군으로는 화장품 제조에 많이 사용되는 항균제인 phenoxyethanol도 같은 농도로 처리해 형성된 clear zone 의 크기를 비교하였다.
표 3은 실시예 1 및 비교예 1-10의 피부 유해균인 스타필로코커스 아우레우스 균의 생육이 억제되어서 나타난 clear zone의 크기를 비교한 표이다.
| 시료명 | Clear Zome (mm) | ||
| 0.05% | 0.1% | 0.5% | |
| phenoxyethanol (control) | 13.7 | 16.2 | 17.9 |
| 실시예 1 (HK9 복합 발효물의 추출물) |
14.5 | 17.8 | 19.9 |
| 비교예 1 (마치현 추출물) |
10.4 | 11.2 | 12.5 |
| 비교예 2 (홍삼 추출물) |
12.3 | 13.1 | 14.8 |
| 비교예 3 (당귀 추출물) |
8.0 | 9.7 | 10.6 |
| 비교예 4 (구운감초 추출물) |
8.7 | 10.5 | 11.7 |
| 비교예 5 (병풀 추출물) |
8.3 | 8.5 | 9.6 |
| 비교예 6 (알로에 아보레센스 추출물) |
10.9 | 12.2 | 13.0 |
| 비교예 7 (더덕 뿌리 추출물) |
9.4 | 12.6 | 12.9 |
| 비교예 8 (락토바실러스 플란타룸 HK9 배양액 추출물) |
11.9 | 12.1 | 13.2 |
| 비교예 9 (ATCC 10241 복합 발효물의 추출물) |
12.1 | 12.8 | 14.5 |
| 비교예 10 (ATCC 14917 복합 발효물의 추출물) |
11.6 | 12.4 | 14.0 |
표 2 및 표 3 에 나타난 바와 같이, 기존에 사용되는 항균제를 시용한 대조군에 비해 비교예 1-10의 모든 시료 처리 농도군에서 여드름 균이나 피부 염증균에 대한 항균성이 높지 않았으나, 실시예 1의 시료 처리군에서는 낮은 농도에서는 기존의 합성 항균제인 대조군과 유사한 항균 효과를 보였으나 최대 농도에서는 합성 항균제보다 높은 우수한 항균 효과를 보여 피부내 존재하는 여드름균 및 피부 염증균의 생육을 현저히 억제함을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 실시예 1에 따른 HK9 복합 발효물의 추출물이 피부에 상존하는 유익균의 생육을 촉진하는 반면 피부 유해균의 생육을 억제함으로서 우호적인 인체 피부 미생물 군총 형성에 매우 긍정적인 영향을 주는 것을 알 수 있다.
화장료의 제조예
본 발명에 따른 유효물질은 목적에 따라 여러 형태의 화장료로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 유효물질을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 화장료의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<화장료 제조예 1> 유연 화장수의 제조
유효물질
10.0 중량부
1,3-부틸렌글리콜
1.00 중량부
디소듐이디티에이
0.05 중량부
알란토인
0.10 중량부
디포타슘글리시리제이트
0.05 중량부
시트르산
0.01 중량부
소듐시트레이트
0.02 중량부
글리세레스-26
1.00 중량부
알부틴
2.00 중량부
하이드로제네이티드캐스터오일
1.00 중량부
에탄올
30.0 중량부
보존제
미량
착색제
미량
착향제
미량
정제수
잔량
<화장료 제조예 2> 영양 크림의 제조
유효물질
10.0 중량부
1,3-부틸렌글리콜
7.00 중량부
글리세린
1.00 중량부
D-판테놀
0.10 중량부
식물 추출물
3.20 중량부
마그네슘알루미늄실리케이트
0.30 중량부
PEG-40 스테아레이트
1.20 중량부
스테아르산
2.00 중량부
폴리소르베이트 60
1.50 중량부
친유형글리세릴스테아레이트
2.00 중량부
소르비탄세스퀴올리에이트
1.50 중량부
세테아릴알코올
3.00 중량부
미네랄오일
4.00 중량부
스쿠알란
3.80 중량부
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드
2.80 중량부
식물성오일
1.80 중량부
디메치콘
0.40 중량부
디포슘글리시리제이트
미량
알란토인
미량
소듐 히아루로네이트
미량
토코페릴아세테이트
적량
트리에탄올아민
적량
보존제
적량
착향제
적량
정제수
잔량
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (5)
- 마치현, 홍삼, 당귀, 구운 감초, 병풀, 알로에 아보레센스 및 더덕 뿌리를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HK9 생균과 함께 발효시켜 얻은 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 플란타룸 HK9 생균은 기탁번호 KFCC 11933P으로 기탁된 생균인 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 추출물은 상기 발효물을 실온에서 20-100 kHz 주파수로 60-120분 동안 초음파 처리하여 생균을 파쇄시킨 후 고상의 발효 잔여물을 제거한 상등액인 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항산화; 광노화 억제; 피부 주름 예방 또는 개선; 피부 염증 예방 또는 개선; 피부 미백; 피부 보습; 피부 유익균 항상성 개선; 여드름 예방 또는 개선; 및 스킨 마이크로비움 환경 개선 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 기능성 화장료 조성물은 화장수, 유액, 크림, 스킨, 로션, 세럼, 에센스, 에멀젼, 파우더, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 클렌저, 비누, 샴푸, 린스, 입욕제, 세정제 또는 콘실 스틱의 형태인 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220085234A KR20240008176A (ko) | 2022-07-11 | 2022-07-11 | 신규한 락토바실러스 유산균 hk9 복합 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장품 조성물 |
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Publications (1)
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|---|---|
| KR20240008176A true KR20240008176A (ko) | 2024-01-18 |
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ID=89716198
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| KR1020220085234A KR20240008176A (ko) | 2022-07-11 | 2022-07-11 | 신규한 락토바실러스 유산균 hk9 복합 발효물의 추출물을 포함하는 기능성 화장품 조성물 |
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|---|---|---|---|---|
| KR102121540B1 (ko) | 2019-12-31 | 2020-06-10 | (주)더마랩 | 별꽃의 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 |
-
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Patent Citations (1)
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| KR102121540B1 (ko) | 2019-12-31 | 2020-06-10 | (주)더마랩 | 별꽃의 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 |
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