KR102121540B1

KR102121540B1 - 별꽃의 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102121540B1
Application number: KR1020190178856A
Authority: KR
Inventors: 이대우; 문은정; 김다애; 이동현; 김남주; 신나렴; 유태선; 장문건; 김지은
Original assignee: (주)더마랩
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-06-10

Abstract

본 발명은 별꽃(Stellaria media)을 초고압 전처리한 후 아임계 추출하여 제조된 별꽃추출물을 락토바실러스 균주(Lactobacillus spp.)로 발효하여 제조되는 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 피부노화를 유발할 수 있는 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 우수한 멜라닌 억제 효능을 나타내었다. 또한 인체 피부에서 색소침착 개선, 피부수분 보유량 증가의 효능을 나타내었다. 본 발명의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 자외선 및 미세먼지로 인한 피부 과색소침착 개선용 및 미백용, 보습용 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

별꽃의 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing the Stellaria media extract fermented by Lactobacillus spp.}

본 발명은 별꽃(Stellaria media)의 락토바실러스 균주(Lactobacillus spp.) 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 별꽃을 초고압 전처리한 후 아임계 추출하여 제조되는 별꽃추출물을 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(L. delbrueckii) 중 1종 이상의 균주로 발효한 것을 유효성분으로 함유하여, 자외선과 미세먼지로부터 피부를 보호하여 우수한 멜라닌 억제 효과를 나타내며, 아울러 미백 및 보습효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 우리 몸의 항상성을 저해하는 외부 요인의 위해를 막아주는 일차적인 보호기관이다. 즉, 외부의 화학적, 물리적, 생물학적 장벽기능을 수행하고 있으나 다양한 환경적 요인과 접촉하고 있기 때문에 손상을 받게 된다. 외부의 주요 스트레스 요인으로는 자외선, 미세먼지, 황사, 급격한 온도 및 습도 변화 등을 들 수 있으며 이들은 활성산소종을 생성하여 피부노화를 가속시킨다(박선영 및 심중현, 2016).

최근 미세먼지는 건강에 가장 큰 유해요인으로 여겨지고 있다. 미세먼지는 호흡기뿐만 아니라 피부를 통해서도 몸 속에 침입한다. 피부로 침투한 미세먼지는 각종 피부질환을 일으키는 원인이 된다. 사람의 피부는 크게 표피층과 진피층으로 이루어진다. 표피층은 피부장벽을 형성, 먼지 등의 체내 침투를 막는다. 하지만 중금속, 환경호르몬 등을 함유한 미세먼지는 이 같은 피부장벽을 무너뜨리고 체내에 침투한다. 또한, 지름이 0.01㎜ 안팎인 미세먼지는 지름이 2~5배인 모공도 손쉽게 통과한다. 이렇게 침투한 미세먼지는 갖가지 피부 질환의 주요 원인이 된다.

미세먼지는 염증반응을 일으키고 피부장벽에 손상을 주어 피부건조 및 아토피피부염을 악화시킬 수 있다. 그리고 미세먼지는 미토콘드리아에서 활성산소(reactive oxygen species)를 생산하여 콜라겐 합성을 감소시키고 콜라겐 분해를 증가시켜 주름생성 등의 현저한 피부노화를 일으킬 수 있다. 또한 미세먼지에 붙은 PAH가 멜라닌세포를 증식시켜 얼굴에 색소반점을 증가시킬 수 있다. 특히 아시아인은 피부 색깔이 백인보다 어둡기 때문에 미세먼지로 인한 노화현상으로 색소반점이 증가할 위험이 높다(Particulate matter and skin, Korean J Fam Pract 2014; 4(2): 116-121).

이에 따라 최근 미세먼지 차단, 미세먼지 클렌징 등의 보호 효과가 있는 ‘안티폴루션’ 화장품의 사용이 급증하고 있다.

번루(繁縷), 아장초(鵝腸草), 성성초(星星草)라고도 불리는 별꽃은 우리나라 전국 각지의 들녘 길가 풀숲이나 밭 또는 집부근의 빈터 논둑이나 도랑가 또는 개울가 등지에 흔히 자란다. 석죽목 석죽과에 속하는 관속식물로서 한해살이 또는 두해살이 풀이며 어린 잎과 줄기를 나물로 먹는다. 쇠별꽃(Stellaria aquatica)과 비슷하나 별꽃은 쇠별꽃보다 크기가 작으며 암술대가 3개로 암술대가 5개인 쇠별꽃과 뚜렷이 구분된다(국립생물자원관, 국가생물종정보관리체계구축, 2016; 김태정, 한국의 야생화와 자원식물, 2008). 별꽃은 예로부터 다양한 피부질환에 사용되어 왔으며 상처, 화상 및 타박상과 같은 피부손상에 적용될 수 있다(Lihua Ma et al., 2012). 또한 별꽃은 피부 유래 세포에서 항염증 및 항산화 효과를 나타내며, 가려움증을 완화시키고 피부진정 효과와 보습 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Marta Rogowska et al., 2017; Oyebanji B. O. et al., 2012).

종래, 대한민국 공개특허 제2019-0108425호에는 '쇠별꽃 추출물을 포함하여 인간 지방유래 줄기세포의 증식, 줄기세포를 지방세포로의 분화 촉진, 줄기세포 배양액의 사이토카인 분비 촉진 및 상처치유 효과, 기질 금속단백질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 활성 억제능으로 인한 피부볼륨감, 피부재생, 피부탄력, 피부주름개선, 피부상처치료에 효과적인 피부 외용제 조성물'이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2011-0080470호에는 별꽃의 당 발효물을 함유하는 건강식품 조성물이 개시되어 있다.

본 발명자들은 피부 미백 및 보습 효능을 나타낼 수 있는 국내 자생 식물소재를 발굴하고자 연구를 진행하였으며, 1차 스크리닝을 통해 최종적으로 별꽃을 선택하였다. 별꽃을 초고압 전처리한 후 아임계 추출하여 제조되는 추출물을 락토바실러스 균주로 발효할 경우에 자외선 및 미세먼지로 유발된 멜라닌의 억제 효과가 크게 증진되고, 또한 피부 과색소침착 개선, 피부장벽 강화 및 수분 보유력 증가 활성이 나타나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 별꽃을 초고압 전처리한 후 아임계 추출한 것을 대상으로 락토바실러스 균주로 발효하여 제조한 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 자외선 및 미세먼지로 인한 피부 멜라닌 생성을 억제하며, 피부 과색소침착 개선, 피부장벽 강화 및 보습력 증가 활성이 우수한 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 조건에서 추출하고, 락토바실러스 균주로 발효하여 제조되는 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 초고압 전처리는 별꽃을 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물로 100~120분 동안 가압 처리하는 것이며, 상기 아임계 조건에서의 추출은 상기 전처리된 별꽃에 용매를 가하여 120~200℃, 0.1~15 MPa 조건에서 10~30분 동안 아임계 추출하는 것임을 특징으로 한다.

발효에 사용되는 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)이다.

상기 화장료 조성물은 자외선 및 미세먼지로 인한 피부 과색소침착(hyperpigmentation) 개선용인 것을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 피부 미백용 또는 피부보습용인 것을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A)별꽃을 또는 별꽃에 추출용매를 가한 것을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물로 100~120분 동안 가압 처리하는 초고압 전처리 단계; (B)추출용매를 가하여 120~200℃, 압력 0.1~15 MPa의 조건에서 10~30분간 추출하는 아임계 추출 단계; (C)상기 (B)단계에서 얻어진 추출물을 락토바실러스 균주를 이용하여 pH 5.0~6.0, 35~40℃의 조건에서 48~72시간 동안 발효하는 발효단계; 및 (D)여과하는 단계를 포함하는 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 (A) 또는 (B)단계에서 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리에칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용된다.

상기 (C)단계의 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 천연소재로 제조되어 안전하며, 자외선 및 미세먼지에 의한 피부 과색소침착(hyperpigmentation) 개선 활성이 우수하고, 피부미백, 피부장벽 강화 및 보습효능이 매우 우수하므로 피부 과색소침착 개선용, 미백용, 피부장벽 강화 및 보습용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 자외선 조사 및 미세먼지 처리 B16F10 세포주에서 본 발명의 일 실시예에 따른 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 tyrosinase, dopachrome tautomerase(DCT) 및 α-glucosidase의 발현 억제효능 실험결과를 나타내는 사진도이다.
도 2는 자외선 조사 및 미세먼지 처리 B16F10 세포주에서 본 발명의 일 실시예에 따른 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2) 발현 증가효능 실험결과를 나타내는 사진도이다.
도 3은 B16F10 및 HaCaT 공동배양 조건에서 본 발명의 일 실시예에 따른 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 수지상돌기 성장 억제효능 실험결과를 나타내는 사진도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 별꽃 락토바실러스 발효추출물 함유 크림의 피부색소 침착 개선 시험결과를 나타내는 사진도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 발명의 내용을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따르면 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 조건에서 추출하고, 락토바실러스 균주로 발효하여 제조되는 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조된다.

(A)별꽃 자체 또는 별꽃에 추출용매를 가한 것을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 초고압의 물로 가압 전처리하는 단계; (B)상기 전처리된 별꽃에 추출용매를 가한 후, 아임계 조건에서 추출하여 추출물을 제조하는 단계; (C) 상기 추출물을 락토바실러스 균주로 발효하는 단계; 및 (D) 여과하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다.

이하, 상기 제조방법을 구체적으로 설명한다.

먼저 전처리, 아임계추출 및 발효를 위해 건조된 별꽃을 준비한다. 이때, 화장료의 성분으로 사용 가능한 별꽃의 전초가 사용된다.

이어서 상기 별꽃 자체 또는 상기 별꽃에 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리에칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추출용매를 가한 후 초고압으로 가압하여 전처리한다. 상기 식물성 오일이란 식물의 씨나 과육 등을 압착 등의 방법으로 추출한 오일을 의미하는 것으로, 올리브오일, 해바라기씨오일, 호호바오일, 야자오일, 아보카도오일 등이 사용될 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 전처리는 상기 별꽃 또는 상기 별꽃에 추출용매를 가한 것을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물을 가압매개로 하여 100~120분 동안 가압 처리하는 것으로 이루어진다.

이후, 전처리가 이루어진 별꽃에 추출용매를 가하여 아임계 조건에서 추출하고 여과, 농축하여 별꽃 추출물을 제조한다. 보다 바람직하게는 상기 아임계 추출은 120~200℃, 0.1~15 MPa 조건에서 10~30분 동안 아임계 추출하는 것으로 이루어진다.

이어서, 제조된 상기 별꽃 추출물에 락토바실러스 균주 배양물을 가하여 발효하고 여과, 농축하여 별꽃 발효추출물을 제조한다. 보다 구체적으로는 별꽃 추출물을 락토바실러스 사케이, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 플란타룸 및 락토바실러스 델브루엑키로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 균주를 이용하여 pH 5.0~6.0, 35~40℃의 조건에서 48~72시간 동안 발효하는 경우에 우수한 활성을 나타내었으며, 특히 락토바실러스 델브루엑키 균주를 이용하여 발효하는 경우에 가장 우수한 활성을 나타내었다.

이와 같이 초고압 전처리, 아임계 추출 및 락토바실러스 발효의 3단계를 거처 제조되는 상기 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 통상의 방법에 의해 추출되는 별꽃 추출물, 전처리 없이 아임계 조건에서 추출된 별꽃 아임계 추출물 및 락토바실러스 이외의 균주에 의해 발효되는 별꽃 발효추출물에 비하여 자외선 및 미세먼지에 대한 우수한 피부세포 보호 및 미백 효능을 나타내었다. 또한 피부색소 침착 개선, 피부장벽 강화 및 피부보습 증대 효과를 나타내었다.

본 발명의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 B16F10 세포주의 생존률에 영향을 미치지 않으면서(시험예 1), 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하였다(시험예 2). 또한 자외선과 미세먼지의 피부 수용체인 melanocortin 1 receptor(MC1R)과 aryl hydrocarbon receptor(Ahr)의 mRNA 발현을 억제하였으며(시험예 3), 멜라닌 생성에 주요하게 작용하는 tyrosinase의 활성을 억제하였다(시험예 4). 또한, 본 발명의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 tyrosinase 뿐만 아니라 멜라닌 생성에 관여하는 DCT 및 α-glucosidase의 발현을 억제하였으며(시험예 5), 항산화 작용을 통해 멜라닌 생성 억제에 관여하는 nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)의 발현을 증가시켰고(시험예 5), B16F10의 수지상돌기의 성장을 억제하는 효과가 우수하였다(시험예 6).

또한, 상기 별꽃 락토바실러스 발효추출물이 함유된 크림을 2주간 피부에 도포하였을 때 인체피부 과색소침착을 개선하고(시험예 8), 피부장벽 강화 및 피부 수분보유력 증가 효능을 나타내었다(시험예 9). 또한 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 인체 피부에 자극을 일으키지 않았다(시험예 10).

그러므로 상기 별꽃 발효추출물은 자외선 및 미세먼지로 인한 피부 과색소침착 개선용 및 피부미백, 피부장벽 강화 및 피부 보습용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 여성청결제, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1: 별꽃 추출물의 제조

건조된 별꽃 전초 100g에 추출용매로서 정제수를 5배 중량을 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 95℃로 가열하여 2시간 동안 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

제조예 2: 별꽃 초고압 전처리 추출물의 제조

건조된 별꽃 전초 100g을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 50℃, 80MPa의 물로 120분 동안 초고압으로 가압처리를 하였다(TFS-10L, Toyo Koatsu Co. LTD). 이후 비닐 파우치를 제거한 후 전처리된 별꽃에 정제수 5배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 95℃로 가열하여 2시간 동안 추출하였다.

제조예 3: 별꽃 아임계 추출물의 제조

건조된 별꽃 전초 100g에 추출용매로서 정제수를 5배 중량을 가하고 아임계 조건인 200℃, 압력 15MPa에서 30분간 추출하였다.

제조예 4: 별꽃 초고압 전처리 아임계 추출물의 제조

건조된 별꽃 전초 100g을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고, 50℃, 80 MPa의 물로 120분 동안 초고압으로 가압처리를 하였다. 이후 비닐 파우치를 제거한 후 전처리된 별꽃에 정제수 5배 중량을 넣고 아임계 조건인 200℃, 압력 15 MPa에서 30분간 추출하였다.

제조예 5 - 8: 별꽃 발효물의 제조

제조예 1의 별꽃 추출물에 미생물이 최종 농도 1×10⁶ CFU/ml이 되도록 접종한 후, 48시간 동안 발효하였다. 발효 균주 및 조건은 하기 표 1에 나타내었다.

이후 발효한 별꽃추출물을 100℃, 30분 조건에서 실활하여 냉침한 후 여과지를 이용하여 여과하여 별꽃 발효추출물을 제조하였다.

제조예 9 - 12: 별꽃 락토바실러스 발효물의 제조

제조예 1의 별꽃 추출물에 락토바실러스 균주를 최종 농도 1×10⁶ CFU/ml이 되도록 접종한 후, 혐기 조건 37℃에서 48시간 동안 발효하였다. 각 발효물 제조에 사용된 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(제조예 9), 락토바실러스 크리스파투스(제조예 10), 락토바실러스 플란타룸(제조예 11) 또는 락토바실러스 델브루엑키(제조예 12)이다.

상기 발효물을 100℃, 30분 조건에서 실활하여 냉침한 후 여과지를 이용하여 여과하여 별꽃 락토바실러스 발효물을 제조하였다.

제조예 13 - 16: 별꽃 발효추출물의 제조

제조예 4의 별꽃 초고압 전처리 아임계 추출물에 하기 표 1의 미생물이 최종 농도 1×10⁶ CFU/ml이 되도록 접종한 후, 48시간 동안 발효하였다. 이후 발효한 별꽃추출물을 100℃, 30분 조건에서 실활하여 냉침한 후 여과지를 이용하여 여과하여 별꽃 발효추출물을 제조하였다.

시료	사용균주	온도	조건
제조예 5	Bifidobacterium longum	37℃	혐기
제조예 13
제조예 6	Saccharomyces cerevisiae	27℃	호기
제조예 14
제조예 7	Bacillus subtilis	27℃	호기
제조예 15
제조예 8	Streptococcus thermophilus	37℃	혐기
제조예 16

실시예 1 - 12 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 제조

제조예 4의 별꽃 초고압 전처리 아임계 추출물에 락토바실러스 균주를 각각 최종농도 1×10⁶ CFU/ml가 되도록, 하기 표 2의 조합으로 동량 혼합하여 혐기 조건 37℃에서 48시간 동안 발효하였다. 상기 발효물을 100℃, 30분 조건에서 실활하여 냉침한 후 여과지를 이용하여 여과하여 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 제조하였다.

	L. sakei	L. crispatus	L. plantarum	L. delbrueckii
실시예 1	○	-	-	-
실시예 2	-	○	-	-
실시예 3	-	-	○	-
실시예 4	-	-	-	○
실시예 5	○	○	-	-
실시예 6	-	○	○	-
실시예 7	-	-	○	○
실시예 8	○	-	-	○
실시예 9	○	○	○	-
실시예 10	-	○	○	○
실시예 11	○	-	○	○
실시예 12	○	○	○	○

시험예 1: 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 세포독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 B16F10 세포주를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며, 96 well plate에 각각 2×10⁴의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 UV 조사기(BLX-312, Vilber Lourmal, France) 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30 mJ/cm²의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 미세먼지는 디메틸설폭시드에 희석하여 사용하였다(Urban particulate matter NIST SRM 1648a, Sigma-Aldrich, USA). 상기 제조예 및 실시예에서 제조한 시료를 농도가 0.1, 1.0 또는 2.0%가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide (MTT, Sigma, USA) 용액을 각 well에 100 ㎖씩 첨가한 후 (3 ㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 ㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.

구분	세포생존률 (%)
	B16F10
	0.5%	1.0%	2.0 %
자외선/미세먼지 ×	124	128	125
대조군 (자외선/미세먼지 ○)	100	100	100
제조예 1	100	100	98
제조예 2	101	100	97
제조예 3	100	98	96
제조예 4	102	99	100
제조예 5	101	99	97
제조예 6	99	98	98
제조예 7	98	100	99
제조예 8	100	101	99
제조예 9	102	99	100
제조예 10	99	98	97
제조예 11	98	100	96
제조예 12	100	99	98
제조예 13	101	98	101
제조예 14	103	100	100
제조예 15	100	100	102
제조예 16	99	100	100
실시예 1	103	101	98
실시예 2	100	101	96
실시예 3	102	99	97
실시예 4	99	98	96
실시예 5	98	98	96
실시예 6	99	99	101
실시예 7	102	99	100
실시예 8	101	100	99
실시예 9	100	101	98
실시예 10	103	100	96
실시예 11	98	99	100
실시예 12	101	100	98

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 별꽃 추출물 및 발효물 등을 적용한 시료 모두 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 B16F10의 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

시험예 2: 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 멜라닌 생성 저해 여부 확인

자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 멜라닌 생성 억제 효능을 확인해보기 위해 B16F10 세포를 24 well plate에 각각 4×10⁵의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 1회 세척한 후, PBS를 각 well에 1 ml 씩 넣었다. UV 조사기 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30mJ/cm²의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 본 발명의 제조예 및 실시예를 각각 1% 및 2%로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 72시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로는 arbutin을 사용하였으며 샘플은 매일 1회 교체하였다.

멜라닌 생성률을 확인하기 위해 배지를 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 이후 1 N의 NaOH를 각 well에 500 μl 씩 첨가하고 30분간 shaking하여 생성된 멜라닌을 녹여 multimicroplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.

구분	멜라닌 생성률 (%)
	B16F10
	1.0%	2.0%
자외선/미세먼지 ×	54
대조군 (자외선/미세먼지 ○)	100
제조예 1	84	77
제조예 2	82	76
제조예 3	79	74
제조예 4	70	63
제조예 5	82	75
제조예 6	81	76
제조예 7	83	76
제조예 8	80	74
제조예 9	70	63
제조예 10	69	61
제조예 11	70	62
제조예 12	68	61
제조예 13	75	68
제조예 14	74	67
제조예 15	76	69
제조예 16	74	68
실시예 1	63	55
실시예 2	62	53
실시예 3	62	54
실시예 4	54	48
실시예 5	62	55
실시예 6	63	53
실시예 7	58	50
실시예 8	59	51
실시예 9	61	54
실시예 10	57	50
실시예 11	58	51
실시예 12	57	52
Arbutin 2%	62	43

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 별꽃 추출물 등(제조예 1-3)과 비교하여 초고압 전처리 후 아임계 추출하여 제조된 제조예 4의 추출물에서 더 우수한 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었으며, 별꽃 발효물의 경우 락토바실러스 균주로 발효한 제조예 9 - 12에서 다른 균주로 발효한 제조예 5 - 8과 비교하여 보다 높은 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었다.

별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 추출하여 추출물을 제조하고, 락토바실러스 균주로 발효하여 제조된 본 발명 실시예의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 상기 제조예의 추출물 및 발효물과 비교해 볼 때, B16F10 세포주에서 자외선과 미세먼지에 의한 멜라닌의 생성 증가의 억제 효능이 더욱 우수한 것으로 나타났다. 이는 자외선과 미세먼지로 인해 발생하는 피부 과색소침착(hyperpigmentation)을 개선하는 효과가 우수하다는 것을 나타낸다. 특히 실시예 4, 7, 8, 10 - 12에서 더욱 높은 억제능을 나타내었으며, 실시예 4에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.

시험예 3: 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 MC1R 및 AhR mRNA 발현 억제 여부 확인

자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 멜라닌 생성과 관련된 자외선 수용체인 MC1R과 미세먼지 수용체인 AhR의 mRNA 발현 억제 효능을 확인해보기 위해 B16F10 세포를 24 well plate에 각각 3×10⁶의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)으로 1회 세척한 후 PBS를 각 well에 1 ml 씩 넣었다. UV 조사기 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30 mJ/cm²의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 각각 1% 및 2%로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.

이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 B16F10 세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 MC1R 및 AhR 유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현량을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer , taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 μl로 조정 후 95℃ 5분 1 cycle/95℃ 1분/51℃ 2분/72℃ 1분 28 cycle 증폭, 72℃에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 각각의 primer sequence는 표 5에 나타내었다. MC1R와 AhR 발현량은 각각의 β-actin 발현량으로 나누어 그 값을 보정하였으며, 그 결과는 하기의 표 6에 나타내었다.

Gene	Sequence (5'→3')
MC1R	F: CCT CTG CCT CAA GGG TGC TG
MC1R	R: TCA ACA GTG GAG CTG AGG ACG
AhR	F: GGT GCC TGC TGG ATA ATT CAT CTG
AhR	R: TCG TCC TTC TTC ATC CGT CAG TG
β-Actin	F: TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA
β-Actin	R: TAAA ACG CAG CTC AGT AAC AGT CCG

구분	mRNA 발현량
	MC1R / β-actin		AhR / β-actin
	1.0%	2.0%	1.0%	2.0%
자외선/미세먼지 ×	1.00
대조군 (자외선/미세먼지 ○)	5.58		3.27
제조예 1	5.40	4.46	3.25	3.08
제조예 2	5.21	4.32	3.22	2.98
제조예 3	5.09	4.25	3.20	2.94
제조예 4	4.76	3.84	3.12	2.76
제조예 5	5.26	4.38	3.21	2.97
제조예 6	5.23	4.33	3.20	2.98
제조예 7	5.20	4.31	3.22	2.97
제조예 8	5.24	4.32	3.21	2.96
제조예 9	4.72	3.87	3.11	2.71
제조예 10	4.73	3.76	3.13	2.72
제조예 11	4.70	3.83	3.12	2.71
제조예 12	4.74	3.72	3.10	2.71
제조예 13	4.85	4.08	3.17	2.83
제조예 14	4.88	4.10	3.19	2.84
제조예 15	4.83	4.07	3.18	2.82
제조예 16	4.87	4.12	3.17	2.84
실시예 1	4.58	3.44	3.02	2.33
실시예 2	4.55	3.51	3.01	2.35
실시예 3	4.52	3.46	3.03	2.36
실시예 4	4.33	2.88	2.90	2.06
실시예 5	4.54	3.30	3.03	2.34
실시예 6	4.53	3.32	3.04	2.32
실시예 7	4.41	3.08	2.98	2.18
실시예 8	4.43	3.04	2.96	2.16
실시예 9	4.51	3.40	3.05	2.31
실시예 10	4.40	3.02	2.97	2.15
실시예 11	4.41	3.06	2.96	2.17
실시예 12	4.43	3.08	2.98	2.14

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 추출하여 추출물을 제조하고, 락토바실러스 균주로 발효하여 제조된 본 발명 실시예의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 상기 제조예의 추출물 및 발효물과 비교해 볼 때, B16F10 세포주에서 자외선과 미세먼지에 의한 MC1R 및 AhR의 mRNA 발현 증가를 효과적으로 억제하였다. 자외선과 미세먼지 수용체의 발현을 억제하는 효과가 우수하므로 자외선과 미세먼지로 인한 피부 과색소침착을 효과적으로 방지할 수 있음을 나타낸다. 특히 실시예 4, 7, 8, 10 - 12에서 보다 높은 활성을 나타내었으며, 실시예 4에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.

시험예 4: Tyrosinase 활성 억제 여부 확인

멜라닌 생성에 관여하는 주요 효소인 tyrosinase의 활성 억제 효능을 확인해보기 위해 mushroom tyrosinase(Sigma, USA)를 사용하여 억제 정도를 측정하였다. 96 well plate에 80 mM phosphate buffer(pH 6.8)에 8.3 mM의 농도로 녹여 조제한 L-3,4-dihydroxyphenyl alanine(L-DOPA) 용액 100 μl을 넣고 상기 제조예 및 실시예가 각각 최종 1% 및 2%가 되도록 50 μl 씩 첨가하였다. 양성 대조군으로는 kojic acid를 사용하였다. 이후 80 mM phosphate buffer에 250 U로 녹여 조제한 mushroom tyrosinase을 각 well에 100 μl 씩 첨가하였다. 30분간 37℃의 차광 배양기에서 반응시킨 후 multimicroplate reader를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기의 표 7에 나타내었다.

구분	Tyrosinase 활성 (%)
구분	1.0%	2.0%
대조군	100	100
제조예 1	92	87
제조예 2	89	83
제조예 3	87	80
제조예 4	81	72
제조예 5	88	81
제조예 6	87	82
제조예 7	89	83
제조예 8	87	83
제조예 9	75	68
제조예 10	76	69
제조예 11	76	67
제조예 12	74	68
제조예 13	84	75
제조예 14	85	74
제조예 15	84	76
제조예 16	86	74
실시예 1	71	62
실시예 2	72	61
실시예 3	71	63
실시예 4	64	50
실시예 5	70	63
실시예 6	72	61
실시예 7	69	55
실시예 8	67	54
실시예 9	71	60
실시예 10	68	56
실시예 11	67	55
실시예 12	68	54
Kojic acid	54	32

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 추출하고 락토바실러스 균주로 발효하여 제조된 본 발명 실시예의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 제조예의 각각의 추출물 또는 발효물과 비교해 볼 때, tyrosinase의 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타나, 피부 미백효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 4, 7, 8, 10 - 12에서 높은 억제능을 나타내었으며, 실시예 4에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.

시험예 5: 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서의 tyrosinase, DCT, α-glucosidase 및 Nrf2의 단백질 발현 조절 여부 확인

상기 시험예 1 - 4를 통해 실시예 4가 가장 우수한 미백 효능을 나타냄을 확인하였다. 그러므로 본 시험예에서는 자외선 조사 및 미세먼지 처리 조건에서 실시예 4가 멜라닌 생성에 관여하는 주요 효소인 tyrosinase, DCT 및 α-glucosidase와 항산화에 관여하는 Nrf2의 단백질 발현 조절 효능을 가지고 있는지 확인하고자 하였다. B16F10 세포를 24 well plate에 각각 4×10⁵의 세포 농도로 접종하여 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 PBS를 각 well에 1 ml 씩 넣었다. UV 조사기 안에 plate를 넣고 UV lamp를 이용하여 30 mJ/cm²의 광량으로 자외선을 조사하였으며, 미세먼지를 50 μg/ml의 농도로 처리하였다. 실시예 4를 1% 및 2%로 배지에 첨가하여 세포에 처리한 후 72시간 동안 배양하였으며, 샘플은 매일 1회 교체하였다.

이후 lysis buffer(50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.02% sodium azide, 0.5% sodium deoxycholate, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride 및 1 μg/ml aprotinin)를 이용하여 B16F10 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. Bradford protein assay법을 통해 단백질 정량을 실시하였으며 20 μg의 단백질을 10% acrylamide gel에서 분리하였고 nitrocellulose membrane에 단백질을 이동시켰다. 각각의 membrane을 5% non-fat skin milk에 1:1000의 비율로 첨가한 tyrosinase, DCT, α-glucosidase 및 Nrf2 1차 항체 및 1:3000의 비율로 첨가한 2차 항체를 반응시키고 ECL Reagent(Amersham Pharmacia Biotech, UK)를 이용하여 현상하였다. 본 시험예에서 tubulin은 대조군으로서 분석되었다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1의 결과에서 보는 바와 같이, 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 추출하여 락토바실러스 델브루엑키로 발효하여 제조된 실시예 4의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 B16F10 세포주에서 자외선 조사 및 미세먼지 처리에 의해 증가된 tyrosinase, DCT 및 α-glucosidase의 단백질 발현량을 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 도 2의 결과에서 알 수 있듯이 실시예 4는 자외선 조사 및 미세먼지 처리에 의해 감소된 Nrf2의 단백질 발현량을 크게 증가시키는 것으로 나타났다. 이를 통해, 본 발명 실시예 4의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 자외선과 미세먼지로 인한 피부 과색소침착에 영향을 미치는 효소의 발현을 조절하는 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

시험예 6: 수지상돌기 성장 억제 여부 확인

멜라닌세포에서 생성된 멜라노좀은 멜라닌세포의 수지상돌기를 통해 주변의 각질세포로 이동하게 된다. 본 시험예에서는 실시예 4가 수지상돌기의 성장에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. B16F10 세포 및 HaCaT 세포를 6 well plate에 각각 2×10⁵및 2×10⁶의 세포 농도(B16F10:HaCaT = 1:10)로 접종하여 37℃ 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 본 발명의 실시예 4를 1% 및 2%의 농도로 세포에 처리하였다. 실시예 4를 세포에 24시간 동안 처리한 후 카메라가 부착된 현미경을 이용하여 사진촬영하고 Image J Program을 이용하여 수지상돌기의 개수 및 길이를 측정하였다. 또한 2%의 실시예 4를 세포에 처리한 후, 10분, 20분, 30분에 plate를 꺼내어 현미경을 이용해 동일 세포를 사진촬영하였다. 그 결과를 하기의 표 8 및 도 3에 나타내었다.

구분	수지상돌기 성장
구분	수지상돌기 개수	수지상돌기 길이 (/control)
대조군	67	1.00
실시예 4 (1%)	57	0.84
실시예 4 (2%)	52	0.66

표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 추출하고, 락토바실러스 델브루엑키로 발효하여 제조된 본 발명의 실시예 4는 B16F10 및 HaCaT 공동배양 조건에서 수지상돌기 개수 및 길이를 대조군 대비하여 크게 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 도 3의 결과에서 알 수 있듯이 본 발명의 실시예 4는 30분 내의 짧은 시간에 B16F10의 수지상돌기 길이를 감소시키는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 실시예 4는 피부 과색소침착에 영향을 미치는 멜라닌세포의 수지상돌기 성장을 억제하는 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 13: 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 함유하는 세럼의 제조

상기 실시예 4의 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 함유한 세럼을 하기의 표 9의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
별꽃 락토바실러스 발효추출물(실시예 4)	2.0
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
스쿠알란	10.0
글리세릴 스테아레이트	1.0
세테아릴알코올	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

실시예 14: 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 함유하는 크림의 제조

상기 실시예 4의 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 함유한 크림을 하기의 표 10의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
별꽃 락토바실러스 발효추출물(실시예 4)	2.0
부틸렌글라이콜	5.0
프로판다이올	3.0
소듐하이알루로네이트(1%)	2.0
트레할로오스	0.2
다이소듐이디티에이	0.02
1,2-헥산다이올	2.0
카보머	0.15
다이메티콘	4.0
폴리글리세릴-3다이아이소스테아레이트	2.0
시어버터	2.0
세테아릴알코올	1.5
카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드	5.0
비즈왁스	1.0
솔비탄올리에이트	0.8
글리세릴스테아레이트	0.5
올리브오일	0.5
알지닌	0.15
정제수	To 100

시험예 7 : 제형안정도 확인

상기 실시예 13, 14에서 제조한 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 24주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하였다. 또한 온도 순환조건 (-5 ~ 50℃)에서도 안정성을 확인하였다. 결과는 표 11에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인
	실시예 13			실시예 14
	변색	변취	분리	변색	변취	분리
실온(25℃)	0	0	0	0	0	0
냉장(4℃)	0	0	0	0	0	0
항온(50℃)	0	0	0	0	0	0
순환 (-5 ~ 50 ℃)	0	0	0	0	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표 11에서 나타낸 바와 같이 실시예 13, 14의 제형 모두 25℃, 4℃, 50℃ 온도 조건 및 순환조건 하에서 변색 변취 및 분리 현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

시험예 8: 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 함유하는 크림의 색소침착 개선 효과 확인

임상시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 18명을 선정하였다. 피험자를 대상으로 안면 피부 부위에 실시예 4를 2% 첨가하여 제조한 크림인 실시예 14를 하루 2회, 14일간 도포하였다. 도포 전 및 도포 후 14일에 동일부위에 대하여 사진촬영을 실시하였다(Visioscope PC35, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany). 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 실시예 4가 함유된 크림인 실시예 14를 14일간 처리한 경우 피부 색소침착을 효과적으로 개선하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 9: 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 함유하는 크림의 TEWL 감소 및 피부수분량 증가 효과 확인

임상시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 8명을 선정하였다. 피험자를 대상으로 안면 피부 부위에 실시예 4를 2% 첨가하여 제조한 크림인 실시예 14를 하루 2회, 14일간 도포하였다. 도포 전 및 도포 후 7일, 14일에 각각 TEWL probe 및 Hydration probe를 이용하여 TEWL과 수분량을 측정하였다(DermaLab Combo, Cortex Tecnology, Denmark). 측정결과는 표 12에 나타내었다.

	TEWL (μg/cm²/min)			피부 수분량 (Capacitance in a.u.)
	도포 전	도포 후 7일	도포 후 14일	도포 전	도포 후 7일	도포 후 14일
측정값 (평균)	12.7	9.4	7.9	193.0	237.5	260.8

상기 표 12에서 나타낸 바와 같이 실시예 14를 4주간 피부에 도포하였을 때 피부장벽이 강화되어 TEWL이 감소되고, 피부 수분량을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 10: 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 인체피부 안전성 확인

임상시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 32명을 선정하였다. 피험자를 대상으로 등 부위에 실시예 4를 정제수에 2%로 희석하여 제조한 시료물질을 IQ Ultra Chamber 및 Micropore tape를 이용하여 도포한 후 48시간 후에 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부평가는 표 13을 적용하여 표 14의 기준으로 평가하였고, 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 물질에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다. 인체 안전성 평가결과는 표 15에 나타내었다.

Score	Description
0	No reaction, normal skin
0.5	Barely perceptible erythema, Doubtful reaction
1	Slight erythema, either spotty or diffuse
2	Moderate uniform erythema
3	Intense redness with erythema
4	Intense redness with erythema & vesicles

Mean score	Evaluation
0.00 ~ 0.87	Low irritancy
0.88 ~ 2.42	Slight irritancy
2.43 ~ 3.440	Moderate irritancy
3.45 ~	Severe irritancy

Product No.	Remove Micropore tape after 48 hr						Remove Micropore tape after 72 hr						Average Mean score
Product No.	0.5 ±	1 ±	2 ±	3 ±	4 ±	Mean score	0.5 ±	1 ±	2 ±	3 ±	4 ±	Mean score	Average Mean score
1	-	-	-	-	-	0	-	-	-	-	-	0	0.0
2	-	-	-	-	-	0	-	-	-	-	-	0	0.0
3	-	-	-	-	-	0	-	-	-	-	-	0	0.0

상기 표 15에서 나타낸 바와 같이 별꽃을 초고압 전처리 후 아임계 추출하고, 락토바실러스 델브루엑키로 발효하여 제조된 본 발명 실시예 4의 별꽃 락토바실러스 발효추출물은 인체 피부에 2% 처리하였을 때 무자극으로 판명되었다.

Claims

별꽃을 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물로 100~120분 동안 가압 처리하는 초고압 전처리 후, 상기 전처리된 별꽃에 용매를 가하여 120~200℃, 0.1~15 MPa 조건에서 10~30분 동안 아임계 추출하고, 락토바실러스 균주로 발효하여 제조되는 별꽃 락토바실러스 발효추출물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유하는 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 자외선 및 미세먼지로 인한 피부 과색소침착 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용 또는 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
(A)별꽃을 또는 별꽃에 추출용매를 가한 것을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 60~80 MPa 조건의 물로 100~120분 동안 가압 처리하는 초고압 전처리 단계;
(B)추출용매를 가하여 120~200℃, 압력 0.1~15 MPa의 조건에서 10~30분간 추출하는 아임계 추출 단계;
(C)상기 (B)단계에서 얻어진 추출물을 락토바실러스 균주를 이용하여 pH 5.0~6.0, 35~40℃의 조건에서 48~72시간 동안 발효하는 발효단계; 및
(D)여과하는 단계를 포함하는 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (A) 또는 (B)단계에서 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리에칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용되는 것임을 특징으로 하는 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 (C)단계의 락토바실러스 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로하는 별꽃 락토바실러스 발효추출물의 제조방법.