KR20150020521A

KR20150020521A - 인체 유래 복합 균주를 이용한 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150020521A
Application number: KR1020147009394A
Authority: KR
Inventors: 이현용; 최우석; 최운용; 김남영; 권희석; 임혜원
Original assignee: 서원대학교산학협력단; 양봉임; 주식회사 세바바이오텍
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-02-26
Also published as: KR101627850B1; WO2015012421A1

Abstract

본 발명은 인체 유래의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 복합 유산균을 이용한 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 항산화 및 피부미백 효능을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 인체 유래의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 유산균의 열수추출물 및 상기 균주를 이용한 황금 발효물질은 높은 항산화 및 피부 미백 활성을 보였으며, 더 많은 생리활성 물질 및 유효물질을 용출하여 적은 양으로도 최대의 효과를 가져다 줄 수 있어 경제적으로도 유리한 효과가 있다.

Description

인체 유래 복합 균주를 이용한 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 기능성 화장료 조성물{Method of fermentation using complex strains and cosmetic composition comprising thereof}

본 발명은 인체 유래의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9과 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 복합 유산균을 이용한 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 항산화 및 피부미백 효능을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

멜라닌은 태양광선 중 유해한 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 수단으로 동물, 식물 및 미생물에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 물질로 자외선, 건조, 극한온도 등에 대한 생존 능력을 높여주지만, 과도한 멜라닌 생성은 인체에 기미, 주근깨, 검버섯을 형성하고 피부노화를 촉진시키며, 악성 흑색종의 피부암 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다. 더욱이 멜라닌은 화학적 물리적으로 매우 안정한 물질이어서, 일단 생성된 색소는 피부에 커다란 손상 없이 단기간에 분해하여 제거하기가 거의 불가능하기 때문에 이를 방지 및 치료하기 위한 방법으로 피부미백제로서 멜라닌의 합성을 저해하는 물질을 사용하고 있다. 또한, 식품에서는 채소, 과일, 생선 등의 갈변화 현상을 일으켜 품질을 저하시키는 문제점이 있다(Bell and Weeler, 1986; Chen et al., 1991; Lerner and Fitzpatrick, 1950). 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트의 세포 내 멜라노솜(melanosome)에서 티로시나아제 효소의 연속적 산화반응으로 생합성된다.

티로시나아제는 멜라닌 생합성과정의 주요 엔자임으로 페놀화합물을 기질로 이용하는 구리 함유 효소이다. 티로신(Tyrosine)은 티로시나아제에 의하여 L-3,4-dihydroxyl-L-phenylalanine(LDOPA)로, L-DOPA를 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화가 되고 이것이 다시 5,6-dihydroxy indole, indole 5,6-quinone으로 산화되어 최종적으로 중합에 의해 멜라닌이 생합성 된다(Lopez et al., 1992).

티로시나아제 저해물질로 알려진 것에는 아스코르브산(ascorbic acid), 누룩산(kojic acid, Lee et al., 2006), 하이드로퀴논(hydroquinone, Fitton and Goa, 1991;Parvez et al., 2006), 벤조산(benzoic acid), 레티노이드(retinoid), 알부틴(arbutin, Maeda and Fukuda, 1996) 등이 있는데, 특히 코지산(kojic acid)과 알부틴(arbutin)은 강한 미백효과를 가지고 있으나 제품 안정성 및 경제성 등의 문제로 사용에 어려움이 있다(Ando et al., 1993; Masuda et al., 1996).

따라서 부작용이 없고 비용이 저렴하여 안정성이 우수한 항산화 및 피부 미백용 화장료 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 인체에서 유래한 유산균인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P를 복합적으로 발효하였을 때 이들 균주를 각각 발효하였을 때 보다 더 많은 생리활성 물질 및 유효물질을 용출하여 더 적은 양으로도 더 많은 효과를 가져다 줄 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주의 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 유효성분으로 함유하는 건강기능성식품을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 황금 가루(Scutellaria baicalensis GEORGE)에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 접종한 후 발효시켜 항산화 또는 피부 미백 효과를 발휘하는 것일 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주의 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 유효성분으로 함유하는 건강기능성식품을 제공한다.

나아가 본 발명은 (a) 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주 100ml을 20 ~ 50분 동안 50 ~ 60kHz의 초음파 처리하여 균주를 파쇄하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 파쇄된 균주와 그 파쇄액을 50 ~ 70℃의 물 500㎖ ~ 1L을 첨가하여 12 ~ 24 시간동안 열수추출하는 단계를 포함하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)단계의 천연물질은 황금, 가시오가피, 녹차, 녹두, 해바라기씨, 자목련 꽃, 모란 뿌리, 삼나무, 초마황, 해송잎, 백리향, 더덕, 도라지, 황기, 당귀, 애엽, 모과, 인삼 또는 산삼일 수 있다.

본 발명은 인체 피부 유래의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 복합 유산균을 이용한 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 항산화 및 피부미백 효능을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 균주를 복합적으로 발효하였을 때 이들 균주를 각각 발효하였을 때 보다 더 높은 항산화 및 피부 미백 활성을 보였으며, 더 많은 생리활성 물질 및 유효물질을 용출하여 적은 양으로도 최대의 효과를 가져다 줄 수 있어 경제적으로도 유리한 효과가 있다.

도 1은 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P의 시간에 따른 균주 배양 정도를 측정한 그래프이다.
도 2는 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 시간에 따른 균주 배양 정도를 측정한 그래프이다.
도 3은 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 유산균을 복합 배양하였을 때의 시간에 따른 균주 배양 정도를 측정한 그래프이다.
도 4는 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P군, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P군, 본 발명의 상기 2가지 유산균을 복합 배양 발효한 군 및 대조군으로 일반 유산균인 Lactobacillus casei 발효 군을 대상으로 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P군, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P군, 본 발명의 상기 2가지 유산균을 복합 배양 발효한 군 및 대조군으로 일반 유산균인 Lactobacillus casei 발효 군을 대상으로 환원력을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P군, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P군, 본 발명의 상기 2가지 유산균을 복합 배양 발효한 군 및 대조군으로 일반 유산균인 Lactobacillus casei 발효 군을 대상으로 멜라닌 합성 저해율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P군, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P군, 본 발명의 상기 2가지 유산균을 복합 배양 발효한 군 및 대조군으로 일반 유산균인 Lactobacillus casei 발효 군을 대상으로 티로시네이즈 저해율을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 발명은 인체 피부 유래의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 복합 유산균을 이용한 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 함유한 항산화 및 피부미백 효능을 갖는 기능성 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

최근 많은 여성들뿐만 아니라 남성의 경우에도 미용에 대한 관심이 급증하면서 피부미백, 여드름, 아토피 피부염 및 주름 개선을 위한 다양한 기능성 화장품들이 출시되고 있다. 그러나 시중에 판매되고 있는 대부분의 기능성 화장품의 경우, 합성 화합물을 사용한 제품들이 대부분인데 합성화합물이 첨가된 화장품은 피부에 따라 민감한 피부반응을 유발시킬 수 있어, 다양한 피부 부작용을 초래하는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 부작용이 없고 비용이 저렴하여 안정성이 우수한 피부 미백용 화장료 제조를 위하여 연구하고 있던 중 유산균에 주목하였다.

유산균은 전 세계적으로 광범위하게 이용 및 응용되는 중요한 미생물이며 치즈, 발효유 및 유산균 음료 등의 발효 유제품과 김치, 청국장과 같은 식품산업에 오랫동안 사용되어 왔다. 유산균은 예로부터 장 질환에 대한 치료 및 예방의 정장효과를 가지고 있어 장내 유해균의 증식을 막고, 유익한 균의 생장에 좋은 조건을 만들어 주어 식중독 방지, 장내 부패방지, 변비예방, 발암 억제, 면역력의 증가 등의 여러 가지 생리활성을 가진다고 알려져 있어 다양한 유제품, 식품 및 화장품산업에 사용되고 있다.

본 발명자들은 여자의 손이 남자의 손보다 부드럽고 유산균이 많이 존재한다는 점에 착안하여(The influence of sex handedness and washing on the diversity of hand surface bacteria, PNAS 105(46) 17994-17999) 여자 손에 많이 존재하는 유산균들을 동정 및 생리 활성 실험을 진행하여 그 중 2가지 종류의 Lactobacillus 속의 균을 선별하였고, 상기의 방법으로 얻어진 미생물을 국제 특허 기관에 기탁하여 기탁번호를 각각 KCCM11349P 및 KCCM11254P으로 부여받아 이를 “Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P”및 “Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P”로 명명하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 균주에 항산화 및 피부 미백 효과가 있는지를 알아보기 위하여 천연물인 황금에 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P군, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P군, 본 발명의 상기 2가지 유산균을 복합 배양 발효한 군 및 대조군으로 일반 유산균인 Lactobacillus casei 발효 군을 처리하여 DPPH 소거활성, 환원력 및 총 페놀 함량을 측정한 결과, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 복합 발효한 황금에서는 일반 유산균과 상기 균주를 각각 발효하였을 때보다 DPPH 소거활성, 환원력 및 총 페놀 함량이 높아, 높은 항산화 활성을 보임을 알 수 있었으며(표 1 참조), 이러한 효과는 상기 유산균을 파쇄하여 DPPH 소거활성 및 환원력을 측정하였을 때와 비슷한 결과를 보였다(도 4 내지 5).

다른 일실시예 따르면 천연물인 황금에 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P군, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P군, 본 발명의 상기 2가지 유산균을 복합 배양 발효한 군 및 대조군으로 일반 유산균인 Lactobacillus casei 발효 군을 처리하여 멜라닌 합성 저해능과 티로시네이즈 저해능을 측정한 결과, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 복합 발효한 황금에서는 일반 유산균과 상기 균주를 각각 발효하였을 때보다 멜라닌 합성 저해능과 티로시네이즈 저해능이 월등히 높아 높은 미백 활성을 보임을 알 수 있었으며(표 2 참조), 이러한 효과는 상기 유산균을 파쇄하여 멜라닌 합성 저해능과 티로시네이즈 저해능을 측정하였을 때와 비슷한 결과를 보였다(도 6 내지 7).

따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9와 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 복합 유산균은 항산화 및 피부 미백 효과가 우수하므로 기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 균주는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 20 중량%로 첨가할 수 있다.

락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 복합 균주를 화장료 총 중량에 대해 0.001 중량% 미만으로 첨가하는 경우에는 본 발명의 화장료 조성물이 가지는 다양한 생리활성 효과를 나타내지 않으며, 반면 20 중량%를 초과하여 첨가될 경우에는 세포 등에 독성으로 작용하거나 또는 목적하는 효과를 첨가량에 비례하여 얻지 못하기 때문에 경제성을 고려하여 상기 기술된 범위 이내의 함량으로 첨가하는 것이 바람직하며, 또한 첨가량에 따른 화장료 조성물 가격이 상승되므로 경제적이지 못한 문제점이 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 복합 균주를 발효할 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 화장방법을 제공한다.

본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 인간의 피부에 도포하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 피부에 도포하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다.

본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 피부 주름 개선 효과가 우수한 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

발명의 실시를 위한 형태

< 실시예 1>

신균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM11349P 및 락토바실러스 파라카제이 KCCM11254P의 분리

본 발명자들은 신규한 유산균 분리를 위해 20 ~ 40대 남녀 40명에게 실험실시 7일 전에 참여하도록 요청하였으며, 참가자들이 실험 전에 손 씻기 등의 위생 처리를 하지 않도록 미리 실험의 내용을 알리지 않고 불특정일에 실험을 진행하였다.

미리 제작한 MRS agar 배지에 실험 참가자의 손바닥을 찍어, 손에 있는 초기 균을 접종하였으며, 30℃에서 24시간 혐기 배양 후 형성된 콜로니를 백금이로 새로운 MRS Agar 배지에 2차 접종하여 균주를 분리하였다. 2차 접종에서 분리한 균주를 콜로니별로 각각 새로운 10 ㎖ MRS broth에 옮겨 계대배양 하였으며, 콜로니별로 발효를 하여 가장 활성이 뛰어난 미생물 2개를 선택하였다.

상기의 방법으로 얻어진 미생물을 한국미생물보존센터에 의뢰하여, PCR을 이용한 유산균 식별을 하였으며, 상기 미생물을 국제 특허 기관에 기탁하였다.

한국 미생물보존센터 결과, 본 발명에서 얻어진 신규한 2개의 균주는 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 균주인 것을 확인 할 수 있었고, 본 발명자들은 상기 2가지 균주를 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 및 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05라고 명명하였으며, 각각의 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11349P 및 KCCM11254P를 부여받았다. 이하 본 발명에서는 상기 동정한 2가지의 신균주를 “Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P”및 “Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P”로 명명하였다.

< 실시예 2>

신균주인 락토바실러스 람노서스 KCCM11349P 및 락토바실러스 파라카제이 KCCM11254P의 배양 방법

본 발명자들은 상기 실시예1에서 분리한 2종의 인간 피부 유래 유산균인 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P 및 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P을 MRS agar 배지에 배양하여 균수가 최대가 되는 최적의 배양시간을 정한 후, 2ℓ 플라스크에 1ℓ의 증류수와 55%의 MRS broth 파우더와 0.5% L-cysteine hydrochloride를 첨가하여 배지를 제작하였다. 유산균의 배양온도는 36℃이며, 최소한의 교반속도 50 ~ 60rpm로 48시간동안 혐기 배양하여 실험을 진행하였다.

Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P의 시간에 따른 균주 배양 정도를 측정한 결과, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P를 12시간 배양하였을 때 균수가 약 6.4 × 10⁶CFU/㎖로 존재하였고, 24시간 배양하였을 때 균수가 약 3.2 × 10⁷CFU/㎖로 개체 수로 증가되었으며, 48시간 배양하였을 때는 최대인 약 4.3 × 10⁷CFU/㎖까지 개체 수가 증가하였으나, 48시간 이상 배양하였을 때는 개체 수가 서서히 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P 균주의 최적 배양시간은 48시간임을 알 수 있었다(도 1 참조).

Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 시간에 따른 균주 배양 정도를 측정한 결과, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 12시간 경과하였을 때 균수가 약 6.1 × 10⁶CFU/㎖로 존재하였고, 24시간 배양하였을 때 균수가 약 3.0 × 10⁷CFU/㎖로 개체 수로 증가되었으며, 48시간 배양하였을 때는 최대인 약 4.1 × 10⁷CFU/㎖까지 개체 수가 증가하였으나, 48시간 이상 배양하였을 때는 개체 수가 서서히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 균주의 최적 배양시간도 48시간임을 알 수 있었다(도 2 참조).

또한, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 시간에 따른 복합 균주 배양 정도를 측정한 결과, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 2가지 균주를 12시간 복합 배양하였을 때 균수가 약 7.1 × 10⁶CFU/㎖로 나타났으며, 24시간 배양하였을 때는 균수가 약 4.2 × 10⁷CFU/㎖로 균수가 크게 증가되었고, 48시간 배양하였을 때는 최대인 약 4.7 × 10⁷CFU/㎖까지 개체 수가 증가하였으나, 48시간 이상 배양하였을 때는 개체 수가 서서히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 복합 배양의 최적 배양 시간은 48시간임을 알 수 있었으며, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 단독 배양 보다 상기 2균주의 복합 배양을 하였을 때 더욱 많은 세포 개체수가 배양되었음을 알 수 있었다(도 3 참조).

< 실험예 1>

천연물 발효를 통한 항산화 활성 증진 분석

본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P 및 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 복합 발효에 항산화 활성 증진 효과가 있는지를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 하였다.

먼저, 2ℓ 플라스크에 100 g의 황금을 파우더 형태로 갈아서 첨가한 후, 1ℓ의 배양 배지를 만들었다. 상기 배지에 실시예 1의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 균주를 각각 5%(v/v)씩 첨가하여 복합 접종한 뒤 48시간 동안 발효하였으며, 발효액을 동결건조 시킨 후 파우더 형태로 만든 다음 DPPH 소거활성, 환원력 및 총 페놀 함량을 측정하였다.

그 결과, 피부유래 유산균인 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 발효하였을 때 일반 유산균 발효보다 DPPH 소거활성, 환원력 및 총 페놀 함량이 높아, 높은 항산화 활성을 보임을 알 수 있었으며, Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 혼합하여 복합 발효한 황금에서는 최대 90%의 DPPH활성을 보여 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 단독 발효에 비해 높은 항산화활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

또한, 피부유래 유산균인 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 발효균주 및 상기 두 균주의 복합물에서 총 페놀함량이 각각 6.49 ㎎/㎖, 5.69 ㎎/㎖, 7.08 ㎎/㎖으로 나타나 일반 유산균보다 2배 정도 높은 총 페놀 함량을 가지고 있어 본 발명의 피부 유래 유산균인 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P 및 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P는 일반 장내 유산균에 비해 항산화 활성이 월등히 높음을 알 수 있었다(표 1 참조).

< 실험예 2>

천연물 발효를 통한 미백 활성 증진 분석

본 발명자들은 천연물 발효를 통한 미백 활성 증진을 알아보기 위하여 본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P, Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 및 상기 두 균주의 복합 배양 발효물의 멜라닌 합성 저해능과 티로시네이즈 저해능을 측정하였다.

먼저, 2ℓ 플라스크에 100 g의 황금을 파우더 형태로 갈아서 첨가한 후, 1ℓ의 배양 배지를 만들었다. 상기 배지에 실시예 1의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 균주를 각각 5%(v/v)씩 첨가하여 복합 접종한 뒤 48시간 동안 발효하였으며, 발효액을 동결건조 시킨 후 파우더 형태로 만든 다음 멜라닌 합성 저해능과 티로시네이즈 저해능을 측정한 결과, 일반 유산균과 비교하였을 때 피부유래 유산균인 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 발효균주 및 상기 두 균주의 복합물에서는 멜라닌 합성 저해능과 티로시네이즈 저해능이 높아 미백 활성이 있는 것을 알 수 있었으며, 특히 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 복합 발효하였을 때 멜라닌 합성 저해능은 42%, 티로시네이즈 저해능은 45%로 나타나 가장 높은 미백 활성을 보임을 알 수 있었다(표 2 참조).

따라서 본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 복합 발효는 일반 유산균 및 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P 각각의 단독 발효보다 유용생리활성 물질 및 유효성분들이 쉽게 용출되며 추출 효율도 좋음을 알 수 있었다.

< 실험예 3>

피부유래 유산균 파쇄물의 항산화 활성 검증

본 발명자들은 본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 복합 배양하여 균주 자체에서 나오는 항산화 활성 물질의 효능을 검증하기 위하여 라디칼 소거능 실험(Radical scavenging activity)과 환원력 측정 실험(Reducing power)을 진행하였다.

먼저, 각각 배양된 유산균과 복합 배양된 유산균을 파쇄하기 위해 각각 총 100ml의 균주를 확보한 후, 20 ~ 50분 동안 50 ~ 60kHz의 초음파 처리하여 균주를 파쇄하였다. 파쇄된 균주와 그 파쇄액을 60 ℃에서 500㎖ ~ 1L 열수 추출하여 균주의 추출액을 얻어 향장 항산화 활성 실험을 진행하였다.

라디칼 소거능 실험은 자유라디칼을 소거할 수 있는 능력을 통해 항산화능을 보는 실험으로 라디칼 소거능을 측정한 결과, 피부유래 복합 배양 균주의 파쇄물의 농도의존적으로 라디칼 소거율이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 복합 배양 균주 파쇄물의 농도가 100%(v/v)일 때 약 30%에 달하는 라디칼 소거능을 보임을 알 수 있었다(도 4 참조). 이러한 결과는 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P의 복합배양 균주 자체의 성분에서 라디칼을 소거하는 효과가 있음을 나타내는 것이다.

환원력은 산화된 물질을 본래의 물질로 환원시키는 힘으로써 항산화 활성을 판단하는 지표가 된다. 환원력을 측정한 결과, 피부유래 복합균주 배양 파쇄물의 모든 농도에서 각각 단일의 피부유래 유산균 배양 균주의 파쇄물보다 흡광도 값이 증가하였으며, 특히 100 %(v/v)의 농도에서 1.473의 흡광도 값을 보여 가장 높은 항산화 활성을 보임을 알 수 있었다(도 5 참조).

< 실험예 4>

피부유래 유산균 파쇄물의 미백 활성 검증

본 발명자들은 본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 복합 배양하여 균주 자체에서 나오는 미백 활성 물질의 효능을 검증하기 위하여 실험예 3과 동일한 방법으로 균주를 파쇄한 뒤 멜라닌 합성 저해능 실험(Melanin synthesis inhibition activity)과 티로시네이즈 저해 실험(Tyrosinase inhibition) 실험을 진행하였다.

농도별(25, 50, 75, 100%(v/v))로 처리한 시료와 멜라노사이트(Melanocyte)인 Clone-M3 세포를 이용하여 멜라닌 생합성과 세포 생존율에 미치는 영향을 관찰한 결과, 피부유래 복합 배양 균주의 파쇄물 농도의존적으로 멜라닌 합성 저해율이 높아짐을 알 수 있었으며, 이는 각각 단일의 피부유래 유산균 파쇄물의 멜라닌 합성 저해율보다 높았고 특히 피부유래 복합 배양 균주의 농도가 100 %(v/v)일 때 약 35%의 멜라닌 저해능을 보임을 알 수 있었다(도 6 참조).

또한, 티로시네이즈 저해 실험(Tyrosinase inhibition)을 한 결과, 각각 단일의 피부유래 균주 파쇄물의 티로시네이즈 저해율은 최대 28%였지만, 복합 균주 배양 파쇄물의 티로시네이즈 저해율은 최대 35%를 보임을 알 수 있었다(도 7 참조).

따라서 본 발명의 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 복합 배양하였을 때 Lactobacillus rhamnosus HK-9 KCCM11349P와 Lactobacillus paracasei HS-05 KCCM11254P를 각각 배양했을 때 보다 최대의 효율을 보여 미백 관련 화장품으로 사용이 유리하다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11254P

20120217

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11349P

20130108

Claims

락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 유효성분으로 함유하는 항산화용 또는 피부 미백용 화장료 조성물.
락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주의 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 또는 피부 미백용 화장료 조성물.
황금 가루(Scutellaria baicalensis GEORGE)를 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주로 발효시킨 발효물을 함유하는 항산화용 또는 피부 미백용 화장료 조성물.
(a) 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및/또는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주 100ml을 20 ~ 50분 동안 50 ~ 60kHz의 초음파 처리하여 균주를 파쇄하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 파쇄된 균주와 그 파쇄액을 50 ~ 70℃의 물 500㎖ ~ 1L을 첨가하여 12 ~ 24 시간동안 열수추출하는 단계를 포함하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법.
황금 100 중량부 대비 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) HK-9 KCCM11349P 및 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) HS-05 KCCM11254P 균주를 각각 10 내지 500 중량부 첨가하여 45 ~ 50시간 동안 발효하는 단계;를 포함하는 항산화용 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제조하는 방법.