KR101258991B1

KR101258991B1 - 우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법

Info

Publication number: KR101258991B1
Application number: KR1020110041188A
Authority: KR
Inventors: 송문수; 우현철; 장태오; 민준홍; 유양훈; 이연건; 민태홍; 박상진; 장현주
Original assignee: 그린텍이십일 주식회사
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2013-04-26
Also published as: KR20120122811A

Abstract

본 발명은 우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법에 대한 것으로, 상기 미생물들은 우방자 추출물 내 아크틴을 아크티게닌으로 효율적으로 전환시킨다.

Description

우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법{PREPARATION METHOD OF ARCTIGENIN INCLUDING FERMENTATION OF MICROORGANISM IN MEDIUM CONTAINING ARCTIUM LAPPA L.}

본 발명은 우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법에 대한 것이다.

최근 기능성 화장품이 주목받게 되면서, 미백 효능이 뛰어난 화장료의 개발, 연구가 활발해지고 있다. 이러한 미백용 화장료들의 대다수는 멜라닌 생성을 억제하는 기전을 이용하는데, 이는 지산, 알부틴, 아스콜빈산 유도체, 루시놀 등은 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 타이로시나제의 활성을 저해하여 멜라닌 생성을 억제하도록 하거나, 타이로시나제 유전자의 프로모터 영역을 제어하여 타이로시나제 단백질의 합성을 저해할 수 있는 저해제나 타이로시나제의 mRNA를 불활성화하는 등 유전자 레벨에서의 조절을 이용하기도 한다.

한편, 우방자는 우엉(Arctium lappa L.)의 종자로, 예로부터 한방에서는 감기, 기침,한약재인후통, 두통, 편도선염, 피부병 등의 약재로 사용되어 왔다.

본 발명자들은 우방자을 이용한 화장료 조성물을 연구하던 중, 우방자로부터 아크티게닌을 높은 순도로 수득할 수 있으며, 특히 특정 미생물을 이용하면 우방자 추출물 내 아크틴(arctin)을 높은 효율로 아크티게닌(arctigenin)으로 전환시킬 수 있다(도 1)는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아크티게닌을 높을 수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 우방자 추출물 내 아크틴을 아크티게닌으로 전환함으로써,제조하높은 수율로 아크티게닌을 제조할 수 있게 한다.

도 1은 미생물을 이용한 아크틴의 아크티게닌으로의 전환을 나타낸다.
도 2는 아크티게닌의 1H-NMR(400MHz, CDCl3) 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 아크티게닌의 ¹³C-NMR(CDCl₃, 100MHz) 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 아크티게닌의 구조식이다.
도 5는 아크티게닌의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 아크틴의 구조식이다.
도 7은 아크닌의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 온도와 압력 조건별 우방자 유지의 추출 수율을 나타낸다.
도 9는 서로 다른 균주들을 이용하여 우방자 추출물을 발효시켜 제조한 분말을 나타낸다(a: 누룩 발효 분말, b: 효모 발효 분말, c: 바실러스 서브틸리스 발효 분말, d: 락토바실러스 플란타룸 발효 분말).
도 10은 아크티게닌 표준물질의 피부 자극 시험 결과를 나타낸다(1: 1% sodium lauryl sulfate 수용액, 2: 아크티게닌 3.0% 및 1,3-BG Solution, 3: 아크티게닌 1.0% 및 1,3-BG Solution).

본 발명은 우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌(acrtigenin)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 우방자 추출물을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 효모(Saccharomyces cerevisiae), 누룩(Aspergillus oryzae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 락토바실러스 플란타리움( Lactobacillus plantarum)으로부터 선택되는 하나 이상을 아크틴을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 효모(Saccharomyces cerevisiae), 누룩(Aspergillus oryzae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 락토바실러스 플란타리움( Lactobacillus plantarum)으로부터 선택되는 하나 이상을 아크틴을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 우방자 추출물은 우방자를 물 또는 유기 용매인 용매로 추출하는 것이다. 바람직하게는 상기 용매는 물, 주정, 탄소수 3 이하의 저가 알코올이다. 보다 바람직하게는 상기 용매는 주정, 메탄올이나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 우방자 내 아크닌이 포함되는 추출물을 제조할 수 있는 적절한 용매를 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 미생물은 효모(Saccharomyces cerevisiae), 누룩(Aspergillus oryzae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarum)이 될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 미생물은 누룩이다. 본 발명의 실시 시 상기 균주들은 일반적인 효모, 누룩, 바실러스 서브틸리스, 락토바실러스 플란타리움 균주이면 되고, 아크틴을 아크티게닌으로 전환시키는 활성을 갖는 한, 특별히 균주의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 미백, 주름 개선, 항산화 또는 피부 보습 효능을 갖는다.

본 발명의 화장료 조성물은, 당업계의 통상적으로 제조되는 어떠한 제형에도 제조될 수 있으며 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 제형으로 제조될 수도 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

미생물의 준비

효모(Saccharomyces cerevisiae) (KCCM 35053), 누룩(Aspergillus oryzae) (KCCM 11530), 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis)(ATCC 6633) 및 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014)를 사용하였다. 상기 효모, 누룩 및 바실러스 서브틸리스는 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms)에서 분양받았으며, 상기 락토바실러스 플란타리움은 American Type Culture Collection로부터 분양받았다.

우방자는 시중에서 판매하는 일반 우방자를 구입하여 사용하였다. 본 실시예 및 실험예에서 사용한 “%”는 특별한 기재가 없는 한, “중량 %”를 의미한다.

<실험예 1>

우방자를 초임계 이산화탄소 추출한 결과, 아크티게닌을 순도 95% 이상의 결정 상태로 얻을 수 있었다. 이때, 초임계 이산화탄소 추출 후 별도의 정제 공정은 수행하지 않았다.

<실험예 2> 우방자로부터 아크틴 및 아크티게닌의 표준물질 제조

아크틴 및 아크티게닌의 표준물질 제조

우방자 1㎏을 80% 메탄올 수용액으로 추출하여 농축시키고 동결건조기를 이용하여 파우더 형태로 80g을 얻었다. 파우더에 100% 물을 가하여 용해시킨 후, 이를 n-Hexane 500㎖를 가하여 탈지, 탈색을 시켰다. 이를 EtOAc, CHCl₃, n-BuOH를 가하여 용매 분획하였으며, EtOAc fraction을 농축하여 12g을 얻었다. 얻어진 추출물을 silica gel column chromatography(n-Hexane:EtOAc=1:1)를 5㎖/min의 유속으로 용출하여 10개의 분획을 얻었으며, 이 중 TLC (n-Hexane: EtOAc=1:2) 상에서 단일 compound로 보이는 4번 분획을 농축하여 100㎎을 얻었으며, 이를 NMR 기기분석을 실시하였다. 1H-NMR(400MHz, CDCl₃) δ: 2.54 (4H, br), 2.84 (2H, br), 3.72 (6H, s), 3.80 (3H, s), 6.50-6.82 (6H, m), 13C-NMR(CDCl₃, 100MHz) δ: 34.5, 38.3, 40.9, 46.5, 55.7, 71.3, 129.4, 110.8, 111.3, 113.9, 114.3, 121.2, 121.9, 129.5, 146.4, 144.2, 144.3, 146.5, 178.6의 signal이 관측 되었다. 따라서 1H(도 2) 및 13C-NMR(도 3)을 종합하여 비교 분석한 결과 아크티게닌(도 4)으로 동정하였으며, HPLC 분석(도 5)을 통해 95% 이상의 순도임을 확인 하였다. n-BuOH fraction을 농축하여 15g의 농축물을 얻었으며, 상기와 같은 silica gel chromatography(CHCl3:MeOH=3:1)를 반복 실행하여 NMR 기기분석을 통해 아크틴(도 6)으로 동정하였으며, HPLC 분석(도 7)을 통해 95% 이상의 순도임을 확인하였다.

정성 및 정량 분석

아크티게닌, 아크틴의 정성 및 정량 분석은 HPLC(Agilent 1100)를 사용하였으며, 측정하고자 하는 시료를 10㎖ volumetric flask에 넣고 메탄올로 눈금을 맞춘 후 60분간 초음파기기를 이용하여 sonication을 시킨 후 0.2㎛ filter를 이용하여 syringe filtering 후 표1의 분석 조건으로 분석 하였다.

아크티게닌 및 아크틴의 HPLC 분석 조건

<실험예 3> 탈유지 우방자의 제조

우방자를 1L 초임계 추출기를 이용하여 온도 30-60 ℃, 압력200, 300 및 400bar의 조건으로 추출하였다(3회 반복). 그 결과, 300 bar 40 ℃에서 약 24%로 soxhlet 추출기를 이용하였을 때, 우방자에 함유되어 있는 유지를 가장 효과적으로 추출할 수 있는 것으로 확인되었다(도 8). 그러므로 우방자 유지을 추출하는 최적의 초임계 추출 조건은 300 bar, 40 ℃로 보인다.

<실험예 4> 아크틴 고함유 우방자 추출물의 제조

상기 실험예 3에서 제조한 탈유지 우방자를 이용하여 하기 실험을 수행하였다. 유지 제거를 위한 초임계 추출을 수행하고, 정제수, 주정, 메탄올로 환류 추출 한 후 추출물을 농축하여, 초임계 추출 잔사에 남아 있는 아크틴을 추출하였다.

그 결과, 주정 및 메탄올을 이용시 아크틴의 추출 수율이 높은 것으로 확인되었으며(표 2), 식품의 제조 공정상 사용 가능한 주정이 추출 용매로 가장 적절한 것으로 판단되었다. 우방자의 초임계 추출 잔사 1㎏을 10 L의 주정을 이용하여 환류 추출 후 2.0 ㎛ Frilter paper로 여과 한 후 진공감압 농축기를 이용하여 농축 하여 400g의 농축액을 얻었으며, 이 농축액을 HPLC로 분석 한 결과, 아크틴의 함량은 10 %로 확인되었다.

<실험예 5> 아크티게닌 전환능이 높은 균주의 스크리닝

상기 실험예 4에서 제조한, 초임계 추출로 유지를 제거한 후, 주정으로 추출한 우방자 추출물을 농축, 동결건조하여 우방자 분말을 제조하였다.

멸균된 삼각 플라스크에 상기 우방자 분말 6.25%, 효모 추출물 1% 및 글루코스 1%를 각각 넣은 후 증류수를 채워 1L를 제조하였으며, 2N NaOH을 이용하여 전체 혼합액의 pH를 7.0으로 조절한 후, 가압멸균(121℃, 15분)하여, 우방자 분말 배지를 제조하였다.

발효 균주로 사용되어진 효모(Saccharomyces cerevisiae)(KCCM 35053)의 전 배양은 YM broth 배지에서 25℃, 5일간 호기, 교반조건(120rpm) 하에서 배양하였고, 누룩(Aspergillus oryzae)(KCCM 11530) 균주는 PDB(Potato dextrose broth)에 26℃, 48시간 배양하였으며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(CKB) 균주는 Nutrient broth에 35℃, 24시간 배양하였다. 또한, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)(ATCC 8014) 균주는 0.05% L-cysteine이 첨가된 MRS (Difco Laboratories) 배지에서 37℃, 24시간 배양하여 사용 하였다.

상기 효모, 누룩, 바실러스 서브틸리스 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액을 각각 상기 우방자 분말 배지의 2%(v/v)가 되게 접종하고, 37℃와 27℃에서 48시간 동안 교반배양(70~80rpm)하였으며, 48시간 후 우방자 분말 발효액을 가압멸균을 함으로써 발효를 완료 하였다. 배양이 완료된 우방자 분말 발효액은 -75℃에서 냉동 보관한 후 동결건조기를 이용하여 48시간 건조하였다. 건조된 발효 분말(도 9) 1g을 메탄올 100㎖에 넣어 80℃에서 1시간 동안 환류 추출하였으며, 추출 후 멤브레인 필터(0.45㎛, Whatman)로 여과하고 0.2㎛ 필터를 이용하여 syringe 필터링 후 표 1의 분석 조건으로 분석 하였다. 그 결과 탈유지 우방자 분말 중에는 아크티게닌이 검출되지 않았으며, 4가지의 균주를 이용한 발효 공정 후의 함량은 누룩을 이용하였을 경우 아크틴으로부터 아크티게닌으로의 전환율이 가장 높았다(표 3).

<실험예 6> 아크틴의 아크티게닌으로의 전환능

실험예 5에서 균주에 따른 아크틴의 아크티게닌으로의 전환능을 시험한 결과, 누룩(Aspergillus oryzae(KCCM 11530)을 이용한 발효가 가장 전환율이 높았는바, 이하 상기 누룩을 이용하여, 아크틴 함량에 따른 발효 후 아크티게닌 전환율을 시험하였다.

즉, 500㎖ flask를 이용하여 아크틴의 함량에 따른 발효 공정 후의 전환율을 확인 하였다. 탈유지 우방자 분말 1㎏을 10L의 주정을 이용하여 환류 추출한 후 2.0 ㎛ Frilter paper로 여과 한 후 진공감압 농축기를 이용하여 농축 하여 얻은 아크틴 10% 함량의 농축액을 이용하여 균주의 접종량을 달리하며 26℃에서 48시간 교반배양(70~80rpm) 하였으며, 48시간 후 우방자 분말 발효액을 가압멸균을 함으로써 발효를 완료 하였다. 배양이 완료된 우방자 분말 발효액은 -75℃에서 냉동 보관한 후 동결건조기를 이용하여 48시간 건조하였다. 건조된 발효 분말 1g을 메탄올 100㎖에 넣어 80℃에서 1시간 동안 환류 추출하였으며, 추출 후 멤브레인 필터(0.45㎛, Whatman)로 여과하고 0.2㎛ 필터를 이용하여 syringe 필터링 후 표 1의 분석 조건으로 분석 하였다. 그 결과, 30%와 50%의 접종에서 아크티게닌의 함량이 유사하게 나왔으나(표 4), 이는 전구체인 아크틴이 100% 가수분해 된다고 가정할 경우, 아크틴 100g에서 글루코스 30g이 가수분해 되고 약 70g의 아크티게닌이 생성되어야 하므로, 생물전환율은 50.7%인 결과이다.

즉, 상기 결과는 탈유지 우방자 분말을 이용한 추출 과정에서 아크티게닌의 전구체로서 활용하고자 하는 아크틴뿐만이 아니라 발효 균주의 탄소원으로 활용 가능한 여러 미지의 배당체들도 같이 추출되어 나온 결과로 추측된다.

그러므로 우방자를 75% 에탄올로 추출한 후 macroporous resin을 이용하여 정제 하고, 덱스트린 등의 부형재를 이용하여 아크틴 20% 함유 우방자 분말을 제조하였다. 상기 아크틴 20 % 함유 분말을 이용하여 30%의 균주를 접종한 후 발효를 시킨 후 상기와 동일한 방법으로 분석한 결과(표 4) 아크티게닌의 함량이 9.81%로 20%의 아크틴을 기준으로 한 생물 전환율은 70.1%로 확인하였다.

누룩 접종량에 따른 발효 후 아크티게닌 함량

발효를 통해 생물 전환된 20% 아크틴 분말을 1L 초임계 추출기를 이용하여 실험예 3에서 확인된 최적의 유지 제거 조건인 300bar, 40℃에서 추출을 시행하여 90%의 수율로 아크티게닌을 회수 하였다. HPLC를 이용한 회수된 아크티게닌의 함량을 분석한 결과 아크티게닌의 순도는 95%로 확인되었다.

<실험예 7> 아크티게닌 표준물질의 세포 독성 시험

아크티게닌을 화장품 완제품 제형에 처방할 수 있는 함량을 확인하고자 세포 독성을 확인 하였다. B16-f1 melanoma cell를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 96-well plate에 1×10⁴ cells/well로 100㎖씩 넣고 5% CO2, 37℃ 조건하에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 시험액(아크티게닌 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 ㎍/㎖)을 α-MSH과 함께 각 그룹 당 3개의 well에 처리한 뒤 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군은 아크티게닌을 첨가하지 않고, α-MSH만 첨가한 것으로 한다. 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 확인한 결과(표 5), 0.1-3.0㎍/㎖의 농도에서 95% 이상의 세포 생존율을 나타내었다.

아크티게닌이 세포 생존에 미치는 영향

<실험예 8> 아크티게닌의 미백 효능

B16-f1 melanoma cells를 10% FBS가 함유된 DMEM으로 6 well plate에 1×10⁵ cells/well로 2㎖씩 넣고 5% CO₂, 37 ℃ 조건 하에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 시험액(아크티게닌 및 arbutin을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 ㎍/㎖)을 10% FBS 함유 DMEM 배양액에 넣고, 여기에 성장인자로 α-MSH(100nM)를 첨가하였으며, 5% CO₂, 37℃ 조건으로 72 시간 동안 배양한다. 이때, 대조군은 아크티게닌 및 arbutin을 첨가하지 않고 α-MSH만 첨가하였다. 배양 후 배양액을 제거하여 PBS로 3회 세척하고 이것을 trypsin-EDTA로 처리하여 세포 pellet을 회수한다. 회수된 pellet은 10,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리한 다음 상등액을 제거하였다. 그리고 이세포 pellet을 70℃에서 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1M NaOH 400㎕를 넣어 90℃ 항온조에서 세포내의 멜라닌을 얻었다. 이 액 100㎕를 96-well plate에 넣고 ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 구하였다. 아크티게닌에 대한 α-MSH를 처리한 B16-f1 melanoma cells에서의 멜라닌 생성 억제 효과는 표 6에서와 같이 0.5㎍/㎖에서는 20.7 ± 1.4, 3.0㎍/㎖에서는 51.1 ± 2.1%로 농도 의존적으로 멜라닌의 생성을 억제 하였으며, 3.0㎍/㎖의 동일 농도에서 arbutin의 멜라닌 생성 억제 효과는 25.1 ± 1.5%로 아크티게닌이 arbutin의 200% 멜라닌 생성 억제 효능을 보였다.

아크티게닌의 멜라닌 생성 억제 효과

<실험예 9> 아크티게닌 표준물질의 피부 자극 시험

인체 첩포 실험을 통해 피부자극 실험을 수행하기 위해 3개의 밴드(대일밴드)를 준비하고, 밴드에 피부자극의 대표적인 물질인 Sodium lauryl sulfate 1% 수용액(1), 아크티게닌 3.0% 및 1,3-BG Solution(2) 및 아크티게닌 1.0% 및 1,3-BG Solution(3)을 3개의 밴드에 각각 도포하여 20-40 대 남녀 피험자 7명에게 첩포하였다. 24시간이 경과 한 후 7명중 1명에게서만 미약한 피부자극(도 10)이 나타났으나, 대체적으로 별다른 피부자극이 일어나지 않는 것으로 확인 하였다.

<실험예 10> 화장품 제형중의 아크티게닌의 경시 안정성 시험

아크티게닌의 화장품 제형중의 안정성을 확인하기 위해 표준품으로 확보한 아크티게닌을 1% 함량으로 처방(표 7)하여 비교적 제법이 간단한 손세정제를 제조하여 4주간 냉암소, 상온, 가온(45℃) 조건 하에서 역가를 HPLC(Agillent 1100)를 이용하여 확인 하였다. 확인 결과 냉암소, 상온, 가온 조건 하에서 모두 95% 이상의 역가(표 8)를 유지함을 알 수 있었으며, 이는 아크티게닌이 화장품의 제형상에서도 상당히 안정한 물질임을 의미한다.

아크티게닌 1% 함유 손세정제 처방전

아크티게닌의 제형중의 안정성 시험

Claims

우방자를 초임계 이산화탄소 추출하여 유지를 제거하는 단계;
탈유지 우방자를 주정 또는 메탄올로 환류 추출하고, 이를 농축하는 단계;및
상기 농축물을 포함하는 배지에 효모, 누룩, 바실러스 및 락토바실러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 미생물을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 아크티게닌의 제조 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 초임계 이산화탄소 추출은 30-60 ℃에서 200-400 바(bar)의 압력으로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 미생물은 바실러스 서브틸리스 또는 락토바실러스 플란타리움인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 미생물은 누룩인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 미생물은 아크틴(arctin)을 아크티게닌으로 전환시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
우방자를 초임계 이산화탄소 추출하여 유지를 제거하는 단계;
탈유지 우방자를 주정 또는 메탄올로 환류 추출하고, 이를 농축하는 단계;및
상기 농축물을 포함하는 배지에 효모, 누룩, 바실러스 및 락토바실러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 미생물을 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조 방법.
제 7항에 있어서,
상기 미생물은 누룩인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 7항에 있어서,
상기 미생물은 바실러스 서브틸리스 또는 락토바실러스 플란타리움인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 7항에 있어서,
상기 초임계 이산화탄소 추출은 30-60 ℃, 200-400 바(bar)의 압력으로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제