TWI388343B - 含有經發酵及酵素作用綠豆萃取液之抗皮膚衰老化妝品成分及其使用方法 - Google Patents
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Description
本發明係有關於一種含有經發酵及酵素作用綠豆萃取液之抗皮膚衰老化妝品成分及其使用方法，特別是指一種化妝品成份，其含有綠豆經酵母或乳酸菌發酵所製備液體，再經過蛋白脢酵素二次作用所得之活性物質者。
按，由於老化的影響，人類皮膚會出現各種衰老性變化；一般而言，隨著年歲增長，皮膚會變的乾燥，失去彈性，產生皺紋及漸趨暗沉。此外，皮膚會對外在刺激變得更敏感，而且需要較長時間才能修復，這些衰老性變化是自然的，而且無法完全阻擋；然而延遲老化，或是藉著某種方法減緩老化是有可能的，所以大部分的化妝品，主要目的都是為了預防老化。
抑制皮膚老化最有效的方法之一，就是在一化妝品內加入各種抗老成份；最近，有一種經發酵所得到的活性成分，被運用在化妝品。例如：使用枯草桿菌發酵所的發酵液已經作為化妝品成份使用，而枯草桿菌是用於製造發酵食品，例如：發酵黃豆及納豆〔natto〕，此種發酵液的特色是藉微生物，將刺激性成分分解或轉換，以減輕對皮膚的刺激；因此，一般相信由微生物所製備之發酵產品，對皮膚有正面功效，所以可以作為一種化妝品成份使用。
緣是，發明人有鑑於此，秉持多年該相關行業之設計開發及實際製作經驗，試圖要改善各種因老化引起的皮膚問題，結果本發明人證實酵母或乳酸菌發酵處理之綠豆萃取
液，具有優越的抗氧化效能，尤其是當該綠豆萃取物經過蛋白脢的再次作用所得的最終產品，對於改善皮膚老化問題，例如乾燥及細紋，有驚人的效果，從而完成了本項發明。
本發明之一實施例在於提供一種可預防皮膚老化的化妝品成份，含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
本發明之另一實施例在於提供一種可改善皮膚細紋的化妝品成份，含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
本發明之又一實施例在於提供一種可使皮膚保溼的化妝品成份，含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
本發明之又一實施例在於提供一種化妝品成份的化妝運用方法，其步驟為將含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液塗抹於皮膚，以產生加速膠原蛋白合成，促進皮膚細胞活性，及保濕的效用。
為達以上所述之目的，本發明提供一種可預防皮膚老化的化妝品成份，含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
此外，本發明提供一種可改善皮膚細紋，同時濕潤皮膚的化妝品成份，含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
在本發明中，作為化妝品中的活性成分使用的綠豆是豆科中的一年生植物。此植物生長在肥沃壤土〔砂土和粘土適當混合的黑土〕，氣候溫和之處。生長高度約為30到80公分，具有瘦長的莖及垂直葉脈，約有十個木節。先有一對子葉和新葉長出，接著出現三小片複葉。
有別於其他豆科成員，綠豆長久以來就被運用於治療皮膚疾病，做為退熱劑及解毒劑。依據東醫寶鑑〔一本南韓醫
學古籍〕，將綠豆粉塗抹在臉上時，會有美容效果。時至今日，人們仍然會使用乾粉狀的綠豆粉，或是將其和水或蜂蜜混合，運用於臉部按摩。或者綠豆也可作為食物食用。例如，將綠豆粉和水混合，製成綠豆煎餅，或是將綠豆澱粉應用於製造澱粉膠體，綠豆煎餅，綠豆粥及綠豆芽。
在本說明書中，所謂綠豆〔Phaseolus radiatus〕是指綠豆樹的所有器官，包括種子〔果實、葉子、花朵、莖和根〕，特別是指種子〔果實〕。
在本說明書中，“經發酵及酵素作用之綠豆萃取液”一詞是指使用發酵微生物，使綠豆進行初步發酵所得發酵的綠豆萃取液，再經過蛋白脢的二次處理所得的萃取液；依據發酵微生物的不同，萃取液可分為經酵母發酵及酵素作用之綠豆萃取液，以及經乳酸發酵及酵素作用之綠豆萃取液。由此看來，最好是使用酵母或乳酸菌作為發酵微生物，當發酵微生物為酵母時，該萃取液為經酵母發酵及酵素作用之綠豆萃取液，如果是用乳酸菌作為發酵微生物，則該萃取液被視為經乳酸發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
另一方面，“經酵素作用及發酵之綠豆萃取液”一詞是指藉由和上述發酵及酵素作用之綠豆萃取液製造過程相反程序所得的萃取液，也就是將發酵步驟及酵素作用步驟順序對調，所以先將綠豆萃取液和酵素作用，接著才用發酵微生物引起發酵作用。
此處用於發酵綠豆的酵母是一種真核微生物〔指細胞核和細胞質由核膜分隔開來的生物〕，具有像細胞壁、細胞膜、細胞核、粒線體，及顆粒等胞器；這種無性別生物是藉出芽進行增殖，有各式各樣的酵母菌，有些分裂的酵母不具發酵
能力，有些是靠分裂或出芽分裂來繁殖，有些會形成超孢子〔ballistospores〕，取代子囊孢子〔ascospores〕，而有些則不會形成胞子。酵母平均大小為5-10μm×5-12μm，大概是細菌的5到10倍大，酵母的理想酸鹼度為4．5-5．5，但是在酸鹼度1-10範圍內都可存活。相較於細菌，酵母比較強韌，可以在酸鹼度1的酸性環境下，存活12個小時。因此，如果將培養液酸鹼度調整為3．5-3．8，即可預防細菌污染。
即使不同酵母菌株的理想生長溫度有所不同，一般而言酵母在攝氏20~25範圍內生長良好，眾所周知的是在攝氏50度或更高溫，酵母會被殺死。然而此狀況可被克服，只要在培養液中，直接加入在此溫度或更高溫時，無法合成之生長因子即可。釀酒酵母〔Saccharomyces cerevisiae〕在攝氏四十度或以上溫度，就會被殺死，但當培養液中加入麥角脂醇〔ergosterol〕及油酸〔oleic acid〕時，他們就能存活，酵母細胞本身是種單細胞植物，含有豐富的蛋白質和礦物質。在此發明中，較適合應用於綠豆發酵的酵母，是釀酒酵母〔Saccharomyces cerevisiae〕。
此處用於發酵綠豆的乳酸菌是一種有益的微生物，可以分解像葡萄糖或乳糖等碳水化合物，以製造有機酸，如乳酸或醋酸；一般而言，當乳酸菌從乳糖製造乳酸時，稱之為發酵，發酵食品藉由此種發酵程序來製造。在本發明中所使用的乳酸菌有乳酸桿菌屬〔Lactobacillus〕、鏈球菌屬〔Streptococcus〕、雙岐桿菌屬〔Bifidobacterium〕、明串球菌屬〔Leu
conostoc〕、足球菌屬〔Pediococcus〕、乳酸球菌屬〔Lactococcus〕等等，其中以乳酸桿菌〔Lactobacillus〕較佳。
本發明中的經發酵及酵素作用之綠豆萃取液是由以下步驟製備：a)將綠豆磨成粉；b)將步驟a中所得的綠豆粉以純水加以稀釋，接著使用酵母或乳酸菌使稀釋液產生發酵；c)過濾步驟b中發酵所得的綠豆發酵液，然後將濾液和蛋白脢一起作用；以及，d)藉由低溫陳化(cold-aging)及過濾步驟c中所得的酵素作用溶液，製備經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。
在製備經發酵及酵素作用之綠豆萃取液的方法，步驟a中，綠豆被研磨成100-500mesh大小或更細粉狀物，但並不限於此。
在步驟b中，發酵作用詳述如下：將綠豆粉和純水以1：10的比例混合，以攝氏121度加以消毒殺菌，接著注入乳酸桿菌屬或酵母菌屬，並加以培養。
進行發酵作用時，酵母或乳酸菌較佳的數量為每一公升培養液中，有1×104-1×105個細胞數。依據菌株的不同，選擇使用傳統的培養狀況，好氧或兼性厭氧狀況。為了活化及培養發酵微生物，可添加額外的碳源，及/或酸鹼度調節器。較佳的培養狀況如下：攝氏30-37度，酸鹼度5-7，好氧或兼性厭氧性狀況，培養天數範圍介於1-1
5天，以1-7天為佳，最好是1-5天，又以2-4為最佳。
在步驟c中，先將步驟b所得的發酵液初步過濾，在此步驟把濾液和蛋白脢一起作用；此時，用孔徑0．25-0．45μm微孔濾膜過濾後，以除去殘留的綠豆粉顆粒和發酵微生物，使用濾膜初步過濾後之濾液，和蛋白脢作用，以使那些尚未被酵母或乳酸菌發酵作用分解或轉化的成分，再次蛋白分解或轉化。此時所用的蛋白脢是胃蛋白脢〔pepsin〕、胰蛋白脢〔trypsin〕、羧肽酶〔carboxypeptidase〕、氨基肽酶〔aminopeptidase〕、雙胜肽酶〔dipeptidase〕等，其中以胃蛋白脢、胰蛋白脢、羧胜肽脢等較佳，以胃蛋白脢為最佳。在步驟d中經使用蛋白脢進行生物轉化〔bio-transformation〕所得的萃取物在低溫陳化〔cold-aged〕，使其穩定。使用孔徑更細的濾膜再次過濾，接著加以濃縮及儲存。濃縮液經適當稀釋，可供使用。酵素作用-過濾-濃縮等這些程序，是為了製備更有效的經發酵及酵素作用綠豆萃取液。此時，低溫陳化最好介於5-10日，而此處所用濾膜孔徑最好不大於0．25μm。
在本發明之一較佳實施例中，綠豆被研磨成300mesh大小或更小顆粒後，加入培養液中〔每公升十克10g/1〕。並將每公升50，000菌落數的酵母或乳酸菌加入溶液中。酵母或乳酸菌在發酵槽內，以攝氏30度〔酵母〕或37度〔乳酸菌〕度，酸鹼值5-7，最好是5．5，好氧或兼性厭氧狀況下，培養1-7天。培養完成後，先以
0．45μm微孔濾膜初步過濾發酵液。接著和蛋白脢作用。蛋白脢作用處理之溶液經低溫陳化〔cold-aged〕十天，接著使用0．25μm微孔濾膜再次過濾。將濾液濃縮就得到本發明中，該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。使用之前，最終固體粉末濃度維持在每公升10克〔10g/L〕。
經上述步驟製備所得之經發酵及酵素作用之綠豆萃取液經證實具有較多異黃酮成分〔實驗範例1〕，促進膠原蛋白合成〔實驗範例2〕，改善細胞活性〔實驗範例3〕，及減緩皮膚細胞的刺激性〔實驗範例4〕。因此含有萃取物的細胞成分具有改善細紋〔實驗範例5〕，及潤澤皮膚〔實驗範例6〕的效能。所以可以預期的是，該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液可以發展成為一種有預防皮膚老化效能的化妝品成份。
在本發明中，該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液占化妝品總成分的0．0001-30．0%〔體積比v/v〕，最好是介於0．001-20%之間〔體積比〕，如果該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液成分少於0．0001%〔體積比〕，無法保證會有改善細紋及保護皮膚的效能。如果該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液成分高於30．0%〔體積比〕，即使增加萃取物成份，效果也不顯著，而且可能會對皮膚有刺激性，或是造成化妝品配方穩定性的疑慮。
本發明之經發酵及酵素作用之綠豆萃取液可局部塗抹或噴灑在皮膚上，即可達到效用。在本發明之一較佳實施例中，將本發明之混合物作為化妝品成份使用時，可以製成乳液、化妝水、乳劑或做為一種藥物成分，例如噴劑或軟膏。
除了經發酵及酵素作用之綠豆萃取液外，本發明的活性化妝品成份還包括一種在皮膚科常用的補充劑，例如抗氧化劑、安定劑、溶解劑、維它命、染液、色素或香料，及載體。
本發明的化妝品成份可製成任何本領域常用型態，例如溶液、懸浮液、乳劑、糊狀物、膠體、乳液、化妝水、粉狀、皂體，含有清潔成分的表面活性劑，油狀物，粉狀基底，乳狀液基底，蠟狀基底，及噴劑，但不限於此。特別是該成份可被製成柔膚化妝水，營養潤膚露〔營養乳液〕，營養霜〔nutrition cream〕，按摩乳、香精、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、清潔水、美容塗敷劑、噴劑，或細粉。
如果該化妝品成份被調配成糊狀物或膠體，合適的載體是下列物質其中之一，動物油、植物油、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽膠、皂土、二氧化矽、滑石及氧化鋅。
如果該化妝品成份被調配成細粉或噴劑，合適的載體是下列物質其中之一：乳糖、滑石粉、氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣、及聚醯胺粉末。特別是當本發明的化妝品成份被製成噴劑時，可再加入一種推進劑，例如：氟氯碳氫化物、丙烷/丁烷，或二甲基醚。
如果該化妝品成份被製成化妝水或乳劑，合適的載體是下列物質其中之一：溶劑、溶解液及乳化劑，例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯〔ethyl carbonate〕、乙酸乙酯〔ethyl acetate〕、苯甲醇〔benzyl alcohol〕、苯甲酸苄酯〔benzylbenzoate〕、丙二醇〔propylene glycol〕、1，3丁二醇油〔1，3-butyl gl
ycol oil〕、丙三醇脂肪酸酯〔glycerolaliphatic ester〕、聚乙二醇〔polyethylene glycol〕及山梨聚糖〔sorbitan〕之脂肪酸酯〔fatty acid ester〕。
如果該化妝品成份被製成懸浮液，合適的載體選用液狀稀釋液，例如水、乙醇、或丙二醇。懸浮劑包括乙氧基化異十八醇〔ethoxylated isostearylalcohol〕、聚氧乙烯山梨醇酯〔polyoxyethylene sorbitol ester〕、聚氧乙烯山梨糖醇酯〔polyoxyethylene sorbitan ester〕、微晶纖維素〔microcrystalline cellulose〕、氫氧化甲基鋁〔aluminum methahydroxide〕、皂土〔bentonite〕、瓊脂〔agar〕、以及黃蓍膠〔tragacanth〕。
如果該化妝品成份被製成具有清潔成分的表面活性劑，合適的載體可選用脂肪族醇硫酸〔aliphatic alcohol sulfate〕、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉〔aliphatic alcohol ethersulfate〕、磺酸化丁二酸單酯〔sulfosuccinic monoester〕、羥乙基磺酸鹽〔isethionate〕、咪唑啉衍生物〔imidazolinum derivative〕、甲基牛磺酸鹽〔methyltaurate〕、肌氨酸鹽〔sarcosinate〕、脂肪酸醯胺醚硫酸鹽〔fatty acid amide ether
sulfate〕、、烷基胺基甜菜鹼〔alkyl amidobetain〕、脂肪醇〔aliphatic alcohol〕、脂肪酸甘油酯〔fatty acid glyceride〕、脂肪酸二乙醇醯胺〔fatty acid diethanolamide〕、植物油〔vegetable oil〕、羊毛脂衍生物〔lanolin derivative〕、及乙氧基化甘油脂肪酸酯〔ethoxylated glycerol fatty acid ester〕。
本發明也提供一種化妝品成份的化妝運用方法，其特徵在將含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液的化妝品成份塗抹到皮膚表面，以改善各種老化所引起的皮膚問題〔例如增加細胞活性及膠原蛋白合成，減緩對皮膚細胞刺激，皮膚保濕等等。
本發明之化妝品成份的化妝運用方法是指包含將一種化妝品塗抹在人類皮膚上的步驟的所有上妝方法。也就是說，各種為化妝相關行業人員所熟知，將化妝美容成分塗抹在皮膚上的方法，都包括在本發明之範圍內。
本發明的化妝品成份可以施用一或多次，或和其他美容成分一起使用。這個對皮膚有絕佳保護效果的化妝品成份可依傳統方法使用，而使用頻率則因個人皮膚狀況或偏好而異。
如果本發明的化妝品成份被調配成皂體，含有清潔成分，或不含清潔成分的表面活性劑，在塗抹於皮膚後，要擦拭乾淨，或用清水洗淨。此時，該皂體可以是液體皂、肥皂粉、固體肥皂，或油型皂。而含有清潔成分的表面活性劑可以是潔膚慕斯、潔膚水、潔膚巾，及潔膚敷料。不含清潔成
分的表面活性劑有潔膚霜、潔膚乳、潔膚水及潔膚凝膠，但不僅限於此。
本發明之化妝品成份的化妝運用方法，在將含有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液化妝品成份，塗抹在皮膚上後，會產生抗老化，改善細紋及潤澤皮膚的效果。
為了更加了解本發明之優點、特色，使本發明之敘述更加詳盡與完備，請配合參照下列實施例之詳細說明；然而這些實施例僅用於說明，並非用來限制本發明之範疇。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀。將100克的綠豆粉，加入濃度70%的酒精水溶液0．6公升，接著使用配有冷卻冷凝器的迴流萃取裝置，進行熱萃取4小時。然後將所得萃取液，以300mesh濾布過濾，再用Whatman 5號濾紙過濾一次。以真空迴轉濃縮機(rotary vacuum evaporator)移除溶劑，將濾液濃縮後，冷凍乾燥。結果可得到5．5g(乾燥後重量)的萃取物。此萃取物被命名為”綠豆萃取物”，同時萃取物最終被調配成濃度1g/100ml的溶液備用。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀。以300mesh濾布過濾得到微細粉末，將綠豆粉和純水以1：10比例混合，以攝氏121度消毒殺菌，將酵母菌殖入混合液內。此處所用之酵母菌為釀酒酵母(Saccharo
myces cerevisiae)，其濃度為每公升50，000菌落數(菌落形成單位)。混合液在容量5公升之發酵槽內，攝氏30度，酸鹼值5．5狀況下培養3天。培養結束後，先將培養液離心以移除酵母，再用0．25μm微孔濾膜過濾後，將濾液濃縮。接著濃縮液以合適之溶劑稀釋。此製備之發酵液稱之為綠豆之酵母發酵液，發酵液最終被調配成濃度1g/100ml的溶液備用。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀，以300mesh濾布過濾得到微細粉末。將綠豆粉和純水以1：10比例混合，以攝氏121度消毒殺菌。將乳酸菌(lactic acid bacterium)殖入混合液內。此處所用之乳酸菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp)，其濃度為每公升50，000菌落數。混合液在容量5公升之發酵槽內，攝氏37度，酸鹼值5．5狀況下培養3天。培養結束後，先將培養液離心以移除乳酸菌。再用0．25μm微孔濾膜過濾後，將濾液濃縮。接著濃縮液以合適之溶劑稀釋。此製備之發酵液稱之為綠豆之乳酸菌發酵液，而發酵液最終被調配成濃度1g/100ml的溶液備用。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀，以300mesh濾布過濾得到微細粉末，將綠豆粉和純水以1：10比例混合，以攝氏121度消毒殺菌。將混合液和蛋白酶(美國Sigma公司製之胃蛋白脢)作用兩小時後，加
入酵母菌。此處所用之酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其濃度為每公升50，000菌落數。混合液在容量5公升之發酵槽內，攝氏30度，酸鹼值5．5狀況下培養3天。培養結束後，先將培養液離心，接著初步過濾以除去酵母菌及殘渣。接著用0．25μm微孔濾膜進行二次過濾。將濾液濃縮，然後以合適之溶劑稀釋。此製備之發酵液稱之為經酵素作用及酵母發酵之綠豆萃取液。溶液濃度最終被調配為1g/100ml備用。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀，以300me sh濾布過濾得到微細粉末。將綠豆粉和純水以1：10比例混合，以攝氏121度消毒殺菌。將混合液和蛋白酶(美國Sigma公司製之胃蛋白脢)作用兩小時後，加入乳酸菌。此處所用之乳酸菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp)，其濃度為每公升50，000菌落數。混合液在容量5公升之發酵槽內，攝氏37度，酸鹼值5．5狀況下培養3天。培養結束後，先將培養液離心，接著初步過濾以除去乳酸菌及殘渣。接著用0．25μm微孔濾膜進行二次過濾。將濾液濃縮，然後以合適之溶劑稀釋。此製備之發酵液稱之為經酵素作用及乳酸菌發酵之綠豆萃取液。溶液濃度最終被調配為1g/100ml備用。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀，以300mesh濾布過濾得到微細粉末。將綠豆粉和純水以1：
10比例混合，以攝氏121度消毒殺菌。將酵母菌加入混合液內。此處所用之酵母菌為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其濃度為每公升50，000菌落數(菌落形成單位)。混合液在容量5公升之發酵槽內，攝氏30度，酸鹼值5．5狀況下培養3天。培養結束後，先將培養液離心以移除酵母，再用0．45μm微孔濾膜進行初步過濾。將濾液和蛋白酶(美國Sigma公司製之胃蛋白脢)作用兩小時後，接著用0．25μm微孔濾膜進行二次過濾。將濾液濃縮，然後以合適之溶劑稀釋。此製備之發酵酵素萃取液稱之為經酵母發酵及酵素作用之綠豆萃取液。最終被調配成濃度1g/100ml的溶液備用。
綠豆經純水清洗並加以乾燥，接著研磨成粉狀，以300mesh濾布過濾得到微細粉末。將綠豆粉和純水以1：10比例混合，以攝氏121度消毒殺菌。將乳酸菌加入混合液內。此處所用之乳酸菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus sp)，其濃度為每公升50，000菌落數。混合液在容量5公升之發酵槽內，攝氏30度，酸鹼值5．5狀況下培養3天。培養結束後，先將培養液離心以除去乳酸菌，接著用0．45μm微孔濾膜進行初步過濾。將濾液和蛋白酶(美國Sigma公司製之胃蛋白脢)作用兩小時後，接著用0．25μm微孔濾膜進行二次過濾。將濾液濃縮後，以合適之溶劑稀釋。此製備之發酵酵素萃取液稱之為經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液。溶液最終濃度被調配為1g/100ml備用。
為了測量異黃酮成分，在製造例中所製備之樣品，都經高效液相層析技術(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析，結果參見表1。
結果顯示，相較於其他樣品在製造例1及2，發酵後再經酵素作用的樣本中，異黃酮成分顯著增加。
將人類正常纖維母細胞，殖入含有DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養液的48孔微孔盤(microplate)中(1x106個細胞/每孔)，接著在溫度攝氏37度，培養24小時。對比製造例1製備的綠豆萃取液，對比製造例2的經酵母發酵綠豆溶液，對比製造例3製備的綠豆乳酸菌發酵液，對比製造例4製備的酵素作用及酵母發酵之綠豆萃取液，對比製造例5製備的經酵素作用及乳酸菌發酵之綠豆萃
取液，製造例1製備的經酵母發酵及酵素作用之綠豆萃取液製備，以及製造例2製備的經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液製備，皆被視為實驗組，個別萃取液或溶液的最終濃度為1．0%，同時將培養液替換成不含血清之DMEM培養液，接著再培養24小時，而不含萃取液或溶液當作對照組，其中所含的培養液替換成不含血清之DMEM培養液，接著也再培養24小時。培養過後，收集每一小孔的上清液(supernatant)，同時使用測試劑組(日本Takara公司)測量其中第一型膠原蛋白原碳基端胜肽(procollagen type I C-peptide，PICP)的濃度，以計算新合成膠原蛋白的量。PICP濃度的計算單位為ng/ml。使用濃度250μm的維他命C作為陽性對照組。膠原蛋白合成率的增加，是依據下列數學公式一計算所得，而結果參見表2。
【數學公式1】膠原蛋白合成比率的增加(%)={(實驗組膠原蛋白的量/對照組膠原蛋白的量)-1}×100
從實驗範例2的結果可確知，本發明之製造例1及製造例2中的經發酵及酵素作用之綠豆萃取液，比起對比製造例1的綠豆萃取液，及簡單發酵液(對比製造例2的酵母發酵綠豆溶液，及對比製造例3的乳酸發酵綠豆溶液)，及那些使用酵素作用後再發酵所得的經酵素作用及發酵處理的綠豆萃取液(對比製造例4及5)，更能促進膠原蛋白合成作用。此外，本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液，和陽性維他命C對照組作比較，能顯著增加膠原蛋白合成作用。
將人類正常纖維母細胞，殖入含有DMEM培養液的96孔微孔盤中(1×104個細胞/每孔)，接著在溫度攝氏37度，培養24小時。對比製造例1製備的綠豆萃取液，對比製造例2的經酵母發酵綠豆溶液，對比製造例3製備的綠豆乳酸菌發酵液，對比製造例4製備的酵素作用及酵母發酵之綠豆萃取液，對比製造例5製備的經酵素作用及乳酸菌發酵之綠豆萃取液，製造例1製備的經酵母發酵及酵素作用之綠豆萃取液製備，以及製造例2製備的經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液製備，皆被視為實驗組，個別萃取液或溶液的最終濃度為1．0%，同時將培養液替換成不含血清之培養液，接著再培養24小時，而不含萃取液或溶液者當作對照組，其中所含的培養液替換成不含血清之DMEM培
養液，接著也再培養24小時。培養過後，比較細胞存活率，特別是要將MTT溶液(美國Sigma公司製)(3mg/ml)加入微孔，接著使用酵素免疫微盤分析儀(ELISA reader)(美國Molecular Devices公司)量測波長570nm吸光值。纖維母細胞增生率，是依據下列數學公式二計算所得，而結果參見表3。使用貝他型變形生長因子(TGF-β)作為陽性對照組。
【數學公式2】纖維母細胞增生率(%)={(實驗組的吸光值-對照組的吸光值)/對照組的吸光值}×100
如表3所示，本發明之製造例1及製造例2中的經發酵及酵素作用之綠豆萃取液，比起對比製造例1的綠豆萃取液，及簡單發酵液(對比製造例2的酵母發酵綠豆溶液，及對比製造例3的乳酸發酵綠豆溶液)，及那些使用酵素作用
後再發酵所得的經酵素作用及發酵處理的綠豆萃取液(對比製造例4及5)，有更好的促進細胞增生作用。而且本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液，促進細胞增生的效用，和陽性貝他型變形生長因子對照組一樣高。
將人類皮膚細胞之纖維母細胞(韓國細胞品種保存機構KCTC，Korean Collection for Type Culture，Korea)培養在T-75燒瓶中，直到細胞聚滿度達到80%。將細胞移到96孔盤(美國Falcon公司製)，細胞密度為3×104個細胞/每孔，接著培養24小時。培養後，在顯微鏡下觀察細胞，看他們是否完全附著，同時生長良好。使用乳酸(0．2%)，作為皮膚的刺激物。特別是將每200μl添加0．2%乳酸的DMEM培養液及不含乳酸的DMEM培養液加入每一微孔中。而濃度為1．0%體積比，對比製造例1到5中製備的綠豆萃取液，經酵母發酵綠豆溶液，綠豆乳酸菌發酵液，酵素作用及酵母發酵之綠豆萃取液，經酵素作用及乳酸菌發酵之綠豆萃取液，以及製造例1、2中的經發酵及酵素作用之綠豆萃取液，皆已先行加入微孔中。此時，對照組不加入乳酸，綠豆萃取物，綠豆發酵溶液，經酵素作用及發酵之綠豆萃取液，還有經發酵及酵素作用之綠豆萃取液。而對比對照組只以乳酸處理。在加入測試樣品12小時之後，比較細胞存活率。特別是要加入MTT溶液(美國Sigma公司製)(3mg/ml)到微孔內，接著使用酵素免疫微盤分析儀(ELISA reader)(美國Mo
lecular Devices公司)量測波長570nm吸光值。細胞存活率，是依據下列數學公式3計算所得，而結果參見表4。
【數學公式3】細胞存活率(%)={(對照組的吸光值-測試樣本的吸光值)/對照組的吸光值}×100
如表4所示，本發明之製造例1及製造例2中的經發酵及酵素作用之綠豆萃取液，比起對比製造例1的綠豆萃取液，更能增加細胞存活率，這表示他們可減緩加入乳酸所引起的細胞毒性，同時也比簡單綠豆發酵液(對比製造例2的酵母發酵綠豆溶液，及對比製造例3的乳酸發酵綠豆溶液)，及那些使用酵素作用後再發酵所得的經酵素作用及發酵處理的綠豆萃取液(對比製造例4及5)，更能增加細胞存活率，這表示他們對細胞刺激性有絕佳的緩解作用。
基於上述結果，含有本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的化妝品成分，以下列方式提供。然而本發明之組成並不僅限於下列範例。在組成物中所含該經發酵及酵素作用綠豆萃取液，可以是經酵母發酵，及酵素作用之綠豆萃取液，或是經乳酸菌發酵，及酵素作用之綠豆萃取液。
配方1：柔膚化妝水含有經發酵及酵素作用綠豆萃取液的柔膚化妝水，是基於表5組成製備。
配方2：營養潤膚露含有經發酵及酵素作用綠豆萃取液的營養潤膚露，是基於表6組成製備。
配方3：營養霜含有經發酵及酵素作用綠豆萃取液的營養霜，是基於表7組成製備。
進行臨床測試以了解本發明中的化妝品成分，其改善細紋之效用。配方三中的營養霜，含有3%體積比，製造例2中的經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液，而對比營養霜是以配方三相同製造方法製造，除了以對比製造例5之經酵素作用及乳酸菌發酵處理的綠豆萃取液，取代製造例2之經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液(對比配方)。同時對照營養霜是以配方三相同製造方法製造，但使用純水替代製造例2之經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液(對照配方)，對比營養霜和對照營養霜都是為了本測試而製造。將測試樣本塗抹於九十名婦女臉上雙頰(both cheeks)，為期六星期。六週後，以肉眼觀察細紋，以評估細紋改善功效。結果參見表8。
【表8】含有經發酵及酵素作用綠豆萃取液營養霜改
如表8所示，含有本發明配方3之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的乳霜，相較於利用對比製造例5經酵素作用及乳酸菌發酵的綠豆萃取液，取代本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的對比配方乳霜，及利用純水，取代本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的對照配方乳霜兩者，具有顯著改善細紋的效果。在多數施用本發明所含化妝品成分的實驗對象，並未觀察到對皮膚的刺激性。
進行臨床測試以了解本發明中的化妝品成分，其保濕潤澤效用。配方三中的營養霜，含有3%體積比，製造例2中的經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液，而對比營養霜是以配方三相同製造方法製造，除了以對比製造例5之經酵素作用及乳酸菌發酵處理的綠豆萃取液，取代製造例2之經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液(對比配方)。同時對照營養霜是以配方三相同製造方法製造，但使用純水替代製造例2之經乳酸菌發酵及酵素作用之綠豆萃取液(對照配方)，對比營養霜和對照營養霜都是為了本測試而製造。十名婦女參與本測試。在上臂位置某處，選取一方形區域，以塗抹該
化妝品，在該處塗抹化妝品成分兩週，期間使用皮膚含水測定儀(skin corneometer)(德國公司C+K courage，Germany)測量皮膚濕潤程度。數字顯示至少有10%的改善程度，而皮膚溼度的改善程度計算結果參見表9。
如表9所示，含有本發明配方3之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的乳霜，相較於利用對比製造例5經酵素作用及乳酸菌發酵的綠豆萃取液，取代本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的對比配方乳霜，及利用純水，取代本發明之經發酵及酵素作用綠豆萃取液的對照配方乳霜兩者，具有顯著的皮膚潤澤效果。
本發明是關於一種含有經發酵及酵素處理之綠豆萃取液，可預防皮膚老化的化妝品成分，先使用酵母或乳酸菌進行綠豆的發酵程序，接著將發酵溶液和蛋白脢作用，即可得到本發明所含該經發酵及酵素處理之綠豆萃取液活性成分。本發明的萃取物可促進細胞活性，膠原蛋白合成，及減緩皮膚刺激性。因此，含有這類萃取物的化妝品成分，具有改善
細紋和潤澤皮膚的效果。這表示該成分對具有絕佳抗老化效果的化妝品而言，是最好的一種選擇。
以上所舉者僅係本發明之部份實施例，並非用以限制本發明，致依本發明之創意精神及特徵，稍加變化修飾而成者，亦應包括在本專利範圍之內。
綜上所述，本發明實施例確能達到所預期之使用功效，又其所揭露之具體構造，不僅未曾見於同類產品中，亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求，爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
Claims (7)
- 一種化妝品成分，包括經發酵及酵素作用之綠豆萃取液活性成分，可預防皮膚老化、改善皮膚細紋或潤澤皮膚者，其中該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液是經過使用酵母或乳酸菌(lactic acid bacterium)使綠豆發酵，製備發酵液，接著以蛋白脢酵素和發酵液作用以產生活性成分，這些程序取得的。
- 如申請專利範圍第1項所述之化妝品成分，其中該酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
- 如申請專利範圍第1項所述之化妝品成分，該蛋白脢是選自下列族群之一，胃蛋白脢(pepsin)、胰蛋白脢(trypsin)、羧肽酶(carboxypeptidase)、氨基肽酶(aminopeptidase)、及雙胜肽酶(dipeptidase)。
- 如申請專利範圍第1項所述之化妝品成分，其中該乳酸菌(lactic acid bacterium)為乳酸桿菌(Lactobacillus)。
- 如申請專利範圍第1項所述之化妝品成分，其中該經發酵及酵素作用之綠豆萃取液在化妝品中的濃度範圍為0.0001-30.0%重量比(w/w)。
- 如申請專利範圍第1項所述之化妝品成分，其中該化妝品成分被調配成下列族群所述形式之一，溶液、懸浮液、乳劑、糊狀物、膠體、乳液、化妝水、粉狀、皂體、含有清潔成分的表面活性劑、油狀物、粉狀基底、乳狀液基底、蠟狀基底、及噴劑。
- 一種化妝法，其特徵在於將申請專利範圍第1項所述之化妝品成分施用在人類皮膚上，以改善皮膚老化狀況。
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