KR102447998B1

KR102447998B1 - 탱자나무 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102447998B1
Application number: KR1020200118902A
Authority: KR
Inventors: 김태양; 황성진; 이춘몽; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-09-28
Also published as: KR20220036552A

Abstract

본 발명은 탱자나무(Poncirus trifoliata) 열매 추출물 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 섬유아 세포의 증식 효과, 사이토크롬 C 옥시다제(cyhtochrome C oxidase) 활성 증가 및 ATP 생합성 촉진 효과를 통하여 주름개선에 우수한 효과가 있는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

탱자나무 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN WRINKLE COMPRISING EXTRACT OF PONCIRUS TRIFOLIATA FRUIT AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 탱자나무(Poncirus trifoliata) 열매 추출물 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로서는 본 발명은 탱자나무 열매 추출물 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 포함하여, 섬유아 세포의 증식 효과, 사이토크롬 C 옥시다제(cyhtochrome C oxidase) 활성 증가 및 ATP 생합성 촉진 효과를 통하여 주름개선에 우수한 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어난다. 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화 (photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병 상태, 환경 인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 자유라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로는 피부의 주요 구성 물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화 현상이 생겨나는 것이다.

사람의 피부색은 멜라닌, 헤모글로빈, 카로틴 등에 의해 결정되는데 이 중에서도 멜라닌이 가장 중요한 역할을 한다. 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 것 이외에도 자외선 흡수 작용, 자유 라디칼 소거제(free radical scavenger) 등과 같은 피부 보호작용을 수행한다. 그러나, 자외선의 과다 노출, 대기 오염, 스트레스 등과 같은 외부의 환경 변화에 의하여 멜라닌이 과다하게 생성되면 피부 내에서 색소 침착 현상을 일으켜 피부의 흑화 또 는 기미, 주근깨 등의 원인이 된다. 피부의 흑화는 내적 및 외적 요인에 대한 피부 세포의 반응에 의하여 발생 하는 것으로, 대표적인 요인은 자외선 노출로 인한 것이다. 즉, 피부가 자외선에 노출되면 타이로시나아제(Tyrosinase)가 활성화되는데, 상기 타이로시나아제가 피부조직에 존재하는 티로신에 작용하여 도파(DOPA) 및 도파퀴논을 생성시키는 산화 과정에 의하여, 피부 색소 세포인 멜라노사이트 내의 멜라노좀에서 멜라닌이라는 중합체가 합성되며, 이러한 멜라닌이 피부의 각질 형성 세포인 케라티노사이트로 전달되고 각질화 과정에 의해 피부 표면에 도달하여 자외선으로부터 피부를 보호하게 된다. 따라서, 멜라닌은 우리 인체에 없어서는 안 되는 자외선 방어제이며, 또한 단백질, 지질, 핵산 등과 같은 생체성분을 변형시키는 다양한 라디칼을 제거하는 효과적인 자유 라디칼 소거제의 역할을 담당하고 있다.

특히, 단백질의 산화는 피부의 결합 조직인 콜라겐 (collagen), 히아루론산 (hyaluronic acid), 엘라스틴 (elastin), 프로테오글리칸 (proteoglycan), 피브로넥틴 (fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증 반응과 피부의 탄력에 지장을 주고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역 기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로, 신체의 대사 과정 중 발생하는 자유 라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되어 발생하는 자유 라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진 대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 자유 라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

산소는 물과 더불어 우리가 살아가는데 없어서는 안 되는 물질이나, 그 산소가 일단 우리의 체내에 들어가면 여러 원인들에 의해 굉장히 활성이 강한 산소로 변하여 혈관 세포를 산화시킨다. 오늘날 질병의 원인의 약 90% 정도가 이 활성산소에 의한 것으로 규명되고 있다. 사람의 몸은 약 60조의 세포로 구성되어 있으며, 세포막은 임피질로 형성되어 있어 활성산소가 연결되기 쉽다. 산화반응이 발생하면 불포화 지방산은 과산화지질로 변화한다. 이 과산화지질이 유전자 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포 구조 등에 손상을 주어 암이 되거나 여러 성인병의 원인이 되며, 궁극적으로 노화의 원인이 된다. 바로 이러한 활성산소를 없애거나 중화시켜 세포가 산화하는 것을 막는 역할을 하는 물질을 항산화 물질이라고 한다. 일반적으로 피부세포의 구성성분인 지질의 활성산소로 인해 과산화가 일어나면 세포막의 구조가 변형되어 세포 투과성, 유동성, 막 효소와 운반 단백질의 불활성화, 단백질 사슬의 절단, DNA, RNA 손상 등이 발생하여 피부세포가 노화가 일어난다고 알려져 있다. 이러한 이유 때문에 활성산소를 제거하려고 하는 노력이 지속되었으며, 이러한 결과로 인해 많은 황산화 물질이 개발되었다. 지금까지 항산화 작용을 갖는 것으로 알려진 물질로는, 아스코르브산(ascorbic acid), 베타카로틴(β-carotene), 디부틸히드록실톨루엔(BHT), 디엘-알파 토코페롤(DL-α-tocopherol) 등이 있다.

현재까지 피부노화를 억제하기 위해서 상기와 같은 다양한 물질들이 개발되었으며 최근에는 고주파기기, 초음파기기, 갈바닉 전류기, 리프팅기 등의 피부 미용기기들이 개발되어 피부 노화에 도움을 주고 있다. 이러한 기기들은 미세전류의 전기에너지를 세포에 공급함으로써 아데노신삼인산(adenosine triphosphate, ATP)의 생성을 증가시켜 세포의 복원과 치유를 유도하는 것으로 많이 알려져 있으며, 본 연구자는 천연물 유래의 ATP 생성 촉진 소재의 연구를 통하여 본 발명을 완성하였다.

식물 추출물을 포함하여 피부 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 대한 특허들이 다수 공개되어 있다. 한국등록특허 제10-1574248호에서는 왕호장(Reynoutria sachalinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 개시한다. 또한, 한국 등록특허 제10-1693931호에서는 고리매 (Scytosiphon lomentaria) 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 개시한다.

본 발명자는 천연 식물 및 이의 분리 화합물에 대한 다양한 피부 생리활성을 검색한 결과, 천연 식물 추출물 중에서 탱자나무 열매 추출물로부터 사이토크롬 C 옥시다제 활성 증가 및 ATP 생성 효능을 확인하고, 이의 유효 성분인 나린긴(naringin)과 움벨리페론(umbelliferone)을 확인함으로써 본 발명을 완성 하였다.

상기한 과제는, 탱자나무 열매 추출물 또는 이의 분리화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 분리화합물은 나린긴 또는 움벨리페론인 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 ATP 생합성 촉진 효과 또는 사이토크롬 C 옥시다제 활성 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 나린긴은 0.0001 ~ 0.01% 함유되고, 상기 움벨리페론은 0.0001 ~ 0.01% 함유되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 나린긴과 움벨리페론을 1~10:1~10의 중량비로 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 탱자나무 열매 추출물 또는 이의 분리화합물인 나린긴(naringin), 움벨리페론(umbelliferone)을 포함하여 ATP 생성 촉진 효과를 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함된 유효성분인 탱자나무 열매 추출물은 섬유아 세포의 증식효과, 사이토크롬 C 옥시다제 활성 증가 및 ATP 생성 효과를 가짐으로써 피부 주름 개선 효과를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 탱자나무(Poncirus trifoliata) 열매 추출물 또는 이의 분리화?d물인 나린긴(naringin) 또는 움벨리페론(umbelliferone)을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로써, 본 발명에 사용된 탱자나무는, 운향과의 과일 나무로서, 원산지는 중국 및 한국이다. 탱자나무의 어린 열매는 한방에서는 지실이라 하여 몸속에 뭉친 기를 없애 주고 가래를 삭이며 가슴이 답답한 증상을 치료하는 효과가 있다고 알려져 있다.

본 발명의 탱자나무 열매 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) , 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다. 본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용하였다.

본 발명에서 탱자나무 열매 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다. 한편, 본 발명의 탱자나무 열매 추출물은 상기한 추출 용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 탱자나무 열매 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에 따른 탱자나무 열매 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는 데 탱자나무 열매의 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 탱자나무 열매를 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모 균주 또는 유산균 등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 탱자나무 열매 발효 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량%함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 탱자나무 열매 발효 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 cytochrome c oxidase 촉진효능과 ATP 생합성 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량% 를 초과하는 경우에는 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다

본 발명에 있어서, 탱자나무 열매 추출물로부터 분리되어진 유효성분인 나린긴(naringin)은 하기의 화학식 1, 움벨리페론(umbelliferone)은 화학식 2에 나타내었다.

[화학식 1] 나린긴(naringin)

[화학식 2] 움벨리페론(umbelliferone)

본 발명에 있어서 “추출물”은 탱자나무 열매를 물, 에탄올 등의 용매를 이용하여 얻어지는 추출액으로써, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 이를 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조 정제물이나 정제물 등, 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 의미한다.

제조예 1 - 탱자나무 열매 추출물 제조

탱자나무 열매 10kg을 깨끗한 물로 씻어 건조시킨 다음 일정한(100mesh) 크기로 분쇄하여 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하여 농축기를 이용하여 탱자나무 열매 추출물 3.75kg을 제조하였다.

제조예 2 - 나린긴(naringin) 제조

상기 제조예 1을 통해서 획득한, 탱자나무 추출물 1.0kg에 10L의 3% 에탄올을 넣어 분산시킨 후 헥산 10L를 이용하여 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트로 동일하게 분획하였으며 에틸아세테이트 분획층을 감압 농축하여 194g의 분획물을 얻었다. 이를 실리카겔(60 ~ 120mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였으며, 이동상으로는 CH₂Cl₂-EtOAc 혼합액을 이용하여 분리 정제 하였다. 전체 12개의 분획물(fraction)을 회수 하였으며, 사이토크롬 C 옥시다제(cytochrome C oxidase) 촉진 효과를 가지는 1개의 분획물(fraction)로부터 19.42g을 회수 하였으며 NMR을 이용하여 분리 동정하였다. NMR 결과를 문헌자료와 비교 및 표준품(cas no: 10236-47-2, naringin)과 비교하여 분리 동정된 성분이 나린긴임을 확인하였다. (VICTOR, Mauricio M., et al. A simple and efficient process for the extraction of naringin from grapefruit peel waste. Green Processing and Synthesis, 2018, 7.6: 524-529.) 제조예 2로부터 나린긴(naringin)을 분리하였으며, 이의 구체적인 화학식은 위의 화학식 1에 나타내었다.

제조예 3 - 움벨리페론(umbelliferone) 제조

상기 제조예 1을 통해서 획득한, 탱자나무 추출물 1.0kg에 10L의 5% 에탄올을 넣어 분산시킨 후 헥산 10L를 이용하여 비극성 성분을 제거하였으며(3회 반복), 이후 메틸렌클로라이드로, 에틸아세테이트로 동일하게 분획하였으며, 메틸렌클로라이드 분획층을 감압 농축하여 287g의 분획물을 얻었다. 이를 실리카겔(60 ~ 120mesh) 컬럼을 이용하여 유효성분 분리를 진행하였으며, 이동상으로는 CH2Cl2-EtOAc 혼합액을 이용하여 분리 정제 하였다. 전체 13개의 분획물을 회수 하였으며, 사이토크롬 C 옥시다제 촉진 효과를 가지는 1개의 분획물로부터 10.77g을 회수 하였으며 NMR을 이용하여 분리 동정하였다. NMR 결과를 문헌자료와 비교 및 표준품(cas no: 93-35-6, umbelliferone)과 비교하여 분리 동정된 성분이 움벨리페론임을 확인하였다. (Woo, Kyeong Wan, et al. Triterpenes from Perilla frutescens var. acuta and their cytotoxic activity. Natural Product Sciences 20.2 (2014): 71-75.) 제조예 3으로부터 움벨리페론(umbelliferone)을 분리하였으며, 이의 구체적인 화학식은 위의 화학식 2에 나타내었다.

실험예 1 - 세포 증식(cell proliferation)

인간 유래 섬유아 세포를 10% FBS 및 1% antibiotics (100 units/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한다. 3-4번째 passage의 섬유아세포를 실험에 사용하여 MTT assay로 섬유아세포의 성장 증식 효능을 확인하였다. 96-Well microplate에 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 섬유아세포 (1×10⁴ cells/㎖)를 넣고 24 시간 전배양하고, 제조예 1 및 2의 시료를 여러 농도로 처리한 다음 4일간 배양하였다.

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 50 ㎕ 첨가하고 4시간 더 배양한 다음, 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 가하여 침전물을 용해시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하여, MTT의 환원에 따른 포르마잔(formazan) 침전물의 생성 정도로 인간유래 섬유아 세포의 증식 효과를 확인하였다. 그 결과를 표 1 및 표 2에 나타냈다.

시료명	농도(ppm)	세포 증식 효과(%)(control 대비)
제조예 1	50	109.51 % ± 2.53
	10	99.42 % ± 0.97
	1	99.79 % ± 1.01
제조예 2	50	113.23 % ± 0.97
	10	105.11 % ± 0.99
	1	100.64 % ± 1.05
제조예 3	50	110.05 % ± 1.23
	10	99.94 % ± 1.08
	1	100.09 % ± 1.12

시료명 및 농도(ppm)		세포 증식 효과(%)(control 대비)
제조예 2 (1ppm)	제조예 3 (10ppm)	137.12 % ± 1.10
제조예 2 (1ppm)	제조예 3 (1ppm)	120.78 % ± 1.98

실험예 2 - 사이토크롬 C 옥시다제

인간 유래 섬유아 세포를 10% FBS 및 1% antibiotics (100 units/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한다. 3-4번째 passage의 섬유아세포를 실험에 사용하였다. 96-웰 마이크로플레이트에 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 섬유아세포(1×10⁴ cells/㎖)를 넣고 24 시간 전배양하고 제조예로부터 획득한 시료를 여러 농도로 처리한 다음 4일간 배양하였다. 세포를 수확하여 PBS로 2~3회 세척하고, 500㎕의 lysis buffer를 첨가한 다음, 1시간 동안 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었으며, 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 Protein Assay Kit(BIO-RAD, HC, USA)를 사용하여 정량 하였다. Cytochrome c oxidase의 활성은 Cytochrome C Oxidase Assay Kit(ab239711)을 사용하여 측정하였다. 사이토크롬 C 옥시다제의 활성의 정도는 무처리구 대비로 하여 아래의 표 3 및 표 4에 나타내었다.

구분	농도(ppm)	Cytochrome C 활성 증가율(%) (무처리구 대비)
제조예1	100	11.09 % ± 1.12
	50	5.18 % ± 1.04
	10	-
	1	-
제조예2	50	13.70 % ± 1.52
	10	8.52 % ± 1.07
	1	-
제조예2	50	11.21 % ± 1.20
	10	7.27 % ± 1.19
	1	-

시료명 및 농도(ppm)		Cytochrome C 활성 증가율(%) (무처리구 대비)
제조예 2 (10ppm)	제조예 3 (10ppm)	21.01 % ± 0.89
제조예 2 (10ppm)	제조예 3 (1ppm)	13.47 % ± 1.54

실험예 3 - ATP 생합성량

인간 유래 섬유아 세포를 10% FBS 및 1% antibiotics (100 units/ml penicillin 및 100 ug/ml streptomycin)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양한다. 3-4번째 passage의 섬유아세포를 실험에 사용하였다. 96-웰 마이크로플레이트에 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 섬유아세포 (1×10⁴ cells/㎖)를 넣고 24 시간 전배양하고 제조예로부터 획득한 시료를 여러 농도로 처리한 다음 4일간 배양하였다. 세포를 수확하여 PBS로 2~3회 세척하고, 500㎕의 lysis buffer를 첨가한 다음, 1시간 동안 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었으며, 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 Protein Assay Kit (BIO-RAD, HC, USA)를 사용하여 정량 하였다. ATP 생합성량의 측정은 ViaLight Plus Cell Proliferation and Cytotoxicity BioAssay Kit를 사용하여 측정하였다. 생성된 ATP의 양은 무처리구 대비로 하여 아래의 표 5 및 표 6에 나타내었다.

구분	농도(ppm)	ATP 증가율 (무처리구 대비)
제조예1	100	11.27 %
	50	6.44 %
	10	-
	1	-
제조예2	50	13.22 %
	10	8.45 %
	1	1.89 %
제조예3	50	10.92 %
	10	4.48 %
	1	-

시료명 및 농도(ppm)		ATP 증가율 (무처리구 대비)
제조예 2 (1ppm)	제조예 3 (10ppm)	13.80 %
제조예 2 (1ppm)	제조예 3 (1ppm)	7.37 %
제조예 2 (10ppm)	제조예 3 (10ppm)	18.09 %
제조예 2 (10ppm)	제조예 3 (1ppm)	11.76 %

처방예 1 - 크림

상기의 제조예를 통하여 만들어진 탱자나무 열매 추출물 및 이의 유효성분을 함유하는 제조예를 함유한 화장료 중 크림의 처방예는 다음 표 7과 같으며 본 처방예에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 샴푸, 트리트먼트, 두피 앰플, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다

제형예 1	제형예 2	제형예 3	제형예 4	함량 (중량%)
제조예 1	제조예 2	제조예 3	제조예 2+3 (naringin, umbelliferone 각1ppm)	1
글리세린	글리세린	글리세린	글리세린	3.0
베타인	베타인	베타인	베타인	10.0
피이지 1500	피이지 1500	피이지 1500	피이지 1500	5.0
알란토인	알란토인	알란토인	알란토인	2.0
DL-판테놀	DL-판테놀	DL-판테놀	DL-판테놀	0.1
이.디.티.에이-2Na	이.디.티.에이-2Na	이.디.티.에이-2Na	이.디.티.에이-2Na	0.3
벤조페논 - 9	벤조페논 - 9	벤조페논 - 9	벤조페논 - 9	0.02
히드록시에칠 셀룰로오스	히드록시에칠 셀룰로오스	히드록시에칠 셀룰로오스	히드록시에칠 셀룰로오스	0.04
소듐히아루로네이트	소듐히아루로네이트	소듐히아루로네이트	소듐히아루로네이트	0.1
카르복시비닐폴리머	카르복시비닐폴리머	카르복시비닐폴리머	카르복시비닐폴리머	8.0
트리에탄올아민	트리에탄올아민	트리에탄올아민	트리에탄올아민	0.2
옥틸도데칸올	옥틸도데칸올	옥틸도데칸올	옥틸도데칸올	0.18
옥틸도데세스 -16	옥틸도데세스 -16	옥틸도데세스 -16	옥틸도데세스 -16	6.0
방부제, 향, 색소	방부제, 향, 색소	방부제, 향, 색소	방부제, 향, 색소	미량
증류수	증류수	증류수	증류수	잔량
합계				100

실시예 1: 탱자나무 열매 추출물 및 이의 유효성분을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과

탱자나무 열매 추출물과 이의 유효성분을 함유하는 제형예 1 ~ 4와 활성성분을 정제수로 대체한 비교제형예 1을 사용해 평가하였다. 100명의 30-40세 여성을 무작위로 5개군으로 나누어 제형예 1 ~ 4, 비교예의 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 양볼을 중심으로 1개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 피부 탄력 개선 효과를 Cutometer(C+K, 독일)를 이용하여 탄력 증진 유무를 평가하였다. 실험 결과는 하기의 표 8에 나타낸 바와 같다

구분	사용전	사용 2주	사용 4주 후
제형예 1	22.19	24.33	26.13
제형예 2	21.72	23.12	25.09
제형예 3	22.37	24.07	26.57
제형예 4	23.01	28.47	32.33
비교제형예 1	22.05	24.07	25.04

Claims

탱자나무(Poncirus trifoliata) 열매 추출물의 분리화합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 분리화합물은 나린긴과 움벨리페론을 1~10:1~10의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 ATP 생합성 촉진 효과 또는 사이토크롬 C 옥시다제 활성 촉진 효과를 갖는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 나린긴은 0.0001 ~ 0.01% 함유되고, 상기 움벨리페론은 0.0001 ~ 0.01% 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
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