KR101259589B1 - 피부노화 억제를 위한 발효쌀 추출물의 제조방법, 그로부터 수득된 발효쌀 추출물 및 상기 추출물을 함유하는 피부노화 억제용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 손상된 섬유아세포 콜라겐 생합성능을 촉진함으로써 피부노화 억제 효능을 갖는 발효쌀 추출물, 그의 제조방법 및 상기 추출물을 함유하는 피부노화 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발효쌀 추출물은 증자한 현미에 Bacillus licheniformis를 접종하여 고체발효하여 제조한 발효쌀을 열처리하고 물추출하여 건조한 것으로, Bacillus licheniformis가 분비하는 다양한 효소에 의해 단백질 분해산물인 올리고펩타이드의 생성 및 용출이 용이하게 되는 특징이 있다. 이러한 발효쌀 추출물을 함유함으로써 손상된 섬유아세포에 적용시 그의 콜라겐 생합성량을 증가시킴으로 인하여 피부노화를 억제하는 조성물에 대한 것이다.

Description

피부노화 억제를 위한 발효쌀 추출물의 제조방법, 그로부터 수득된 발효쌀 추출물 및 상기 추출물을 함유하는 피부노화 억제용 화장료 조성물 {A method of making fermented rice extract for inhibiting skin aging, fermented rice extract obtained therefrom and a skin-aging inhibiting cosmetic composition containing the extract}

본 발명은 피부노화 억제를 위한 발효쌀 추출물의 제조방법, 그로부터 수득된 발효쌀 추출물 및 상기 추출물을 함유하는 피부노화 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 증자한 현미에 Bacillus licheniformis를 접종하여 고체발효시킨 발효쌀을 열처리하고 물추출하여 건조하는 과정을 통해, 콜라겐 생합성량을 증가시키는 것으로 알려진 올리고펩타이드의 함량을 증가시키는 발효쌀 추출물의 제조방법, 그로부터 수득된 발효쌀 추출물 및 상기 추출물을 함유하는 피부노화 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어가면서 양적인 면에서나 질적인 면에서 상당히 많은 변화가 일어나게 된다. 이러한 자연노화 외에도 여러 가지의 외부 환경에 의해서 자극을 받는다. 즉, 분자생물학적인 변화나 외부의 물리, 화학적 인자에 의하여 일련의 변화가 일어난다. 이러한 피부노화는 섬유아세포에서 분비하는 콜라겐 단백질의 양이 감소하게 되어 피부에 주름이 생기는 현상이 발생한다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 콜라겐은 피부노화의 외적인 원인이 되는 자외선 노출에 의해서도 파괴되며, 자외선에 의한 변화는 자외선에 노출된 시간의 축적에 비례하는 것으로 알려져 있다. 자외선은 피부 진피층에서 탄력섬유성 물질을 축적시키고 교원섬유를 변성시켜 피부에 주름이 생기게 만들고 탄력성을 저하시킨다.

주름의 예방 및 치료를 위한 연구가 발전되면서 피부에서 콜라겐의 중요한 기능들이 밝혀지고 있으며, 이러한 연구들로부터 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 메트릭스의 성분이 증가되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화 등의 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다.

콜라겐 합성을 촉진하기 위해 종래에 사용한 물질로서, 레티노이드 (RE36068), TGF-β (trans-forming growth factor), 동물태반유래의 단백질 (JP평08-2312709(A)), 베툴린산 (JP평08-208424(A)), 클로렐라 추출물 (JP평09-0405239, JP평10-0362839(A)) 등이 알려져 있으나, 레티노인산의 경우 불안정하고 피부적용 시 자극, 발적 등의 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성 촉진으로 인한 피부기능 개선효과를 기대할 수 없다. 최근 새롭게 등장한 주름치료법으로 초음파 치료 및 피부 스케일링, 레이저 박피술, 보툴리눔톡신 주사, 레스틸렌 주사 등이 있으나 시술 비용 및 지속성 면에서 큰 효과를 발휘하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 생체에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 매우 우수한 촉진제의 개발 및 발굴이 절실히 요망되고 있다.

자외선에 의한 피부 손상 원인 중 하나는 자외선에 의해 형성된 활성 산소종이 세포 신호체계에 신호를 보내어 결국 피부의 세포간물질 (extracellular matrix, ECM)의 성분인 콜라겐이나 젤라틴 등을 분해하는 효소인 메트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase, MMP)를 생성하여 콜라겐이나 젤라틴을 파괴함으로서 피부에 주름을 형성시키는 것이다. 만성적인 자외선의 영향을 상징적으로 나타내는 것으로 농부 혹은 어부의 피부를 들 수 있는데, 그 특징은 외형적으로는 피부의 색이 검고 촉감이 뻣뻣하며 깊은 주름이 생긴다. 이 상태가 더욱 심해지면 피부암을 유발하는데 이러한 피부의 변화를 자연노화와 구분하여 광노화라고 한다. 이러한 광노화를 억제할 목적으로 지금까지 많은 기능성 화장품들이 개발되었으며 이들 중에는 비타민 A 계통의 레티놀을 사용하는 것과 비타민 C 계통의 아스코빅산을 사용하는 것이 대부분이다. 그러나 이들 두 가지 성분은 실온에서 불안정하여 화장품을 장기 보존할 경우 쉽게 분해되어 그 효능을 잃게 된다. 현재 이들 두 성분의 실활을 막기 위하여 이들 물질에 지방산을 결합시켜 변형하거나 리포좀으로 포집하는 등 다양한 방법이 동원되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-0446341호에는 쌀을 단백질분해효소로 처리하여 수득한 저알러겐성 쌀의 알칼리 추출물에 1종 이상의 효소(엑티나아제, 펩신, 트린신, 파파인, 펩티다제, 브로멜린)로 처리하여 수득한 효소처리 물질과 자외선 차단제가 함유된 노화방지용 화장품 조성물에 대하여 기재되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0135251호에는 다가알콜, 에틸렌디아민테트라아세트산, 이나트륨과 젖산 및 젖산나트륨의 추출용매로 쌀 추출물을 제조하여 미백효과를 나타내는 제조방법에 대하여 기재되어 있다.

그러나, 상기 대한민국 등록특허 제10-0446341호에 기재된 바와 같은 쌀을 단백질 분해효소로 처리하여 제조한 노화방지용 화장품 조성물의 경우, 쌀을 처리하여 생성되는 올리고펩타이드 함량이 낮을 뿐만 아니라, 두 번의 단백질 분해효소처리를 통하여 생성함으로서 효소 최적조건 변경과정으로 인한 제조공정이 복잡하고 피부세포에 독성을 유발할 수 있는 단백질 분해효소의 실활 과정이 없는 문제점이 있다.

본 발명의 목적은 발효쌀 추출물에 함유된 올리고펩타이드의 함량을 증가시키고, 피부세포 독성 유발물질인 단백질 분해효소를 실활시킴으로써 피부노화 방지 효과를 더욱 향상시킬 뿐만 아니라 피부 안정성을 보다 확보하고자 하는데 있다.

본 발명에 따르면, 증자한 현미에 Bacillus licheniformis를 접종함으로써 올리고펩타이드의 생성량을 증가시킬 뿐만 아니라 발효쌀 추출물의 추출효율을 증가시키고, 발효쌀을 100℃에서 10분 내지 20분동안 열처리함으로서 Bacillus licheniformis 유래 효소를 모두 실활시킴으로 인하여 효소에 의한 세포독성이 없는 인체에 매우 안전한 발효쌀 추출물을 제공한다.

이와 같이 수득된 발효쌀 추출물은 콜라겐 분해의 원인이 되는 손상된 섬유아세포를 대상으로 콜라겐 생합성능을 증대시켜 피부노화를 예방하고 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 발효쌀 추출물을 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 방법에 의해 현미로부터 추출되는 올리고펩타이드의 생성량 및 추출 효율을 향상시킬 수 있고, 이와 같이 수득된 발효쌀 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물을 피부에 적용하면, 피부의 자연노화 및 일광에 노출되어 분해되는 피부 콜라겐의 합성량을 증가시켜 피부의 탄력 유지 및 주름 개선 또는 억제에 기여하여, 결과적으로 피부노화 억제에 기여할 수 있다.

도 1은 현미에 Bacillus licheniformis를 접종하였을 때 생성된 올리고펩타이드 함량을 배양일수별로 나타낸 도이다.
도 2는 올리고펩타이드 함량이 높은 7종류 쌀 샘플의 올리고펩타이드 함량을 나타낸 도이다.
도 3은 동결건조/분무건조에 따른 고체발효쌀 추출건조물의 무게를 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 동결건조/분무건조된 고체발효쌀 추출건조물의 올리고펩타이드 함량을 비교하여 나타낸 도이다.
도 5는 SDS-PAGE 상에서 고체발효쌀 추출물의 올리고펩타이드 분포를 나타낸 도이다.
도 6은 동결건조/분무건조된 고체발효쌀 추출건조물의 총 페놀함량을 나타낸 도이다.
도 7은 동결건조/분무건조된 고체발효쌀 추출건조물의 항산화활성을 나타낸 도이다.
도 8은 UV-손상 세포에 대한 비열처리 고체발효쌀 추출건조물, 레티노산 및 무발효쌀의 세포독성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 9은 UV-손상 세포에 대한 100℃ 열처리 고체발효쌀 추출건조물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 10은 정상 세포에 대한 비열처리 고체발효쌀 추출건조물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 11는 정상 세포에 대한 100℃ 열처리 고체발효쌀 추출건조물의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 12은 고체발효쌀 추출건조물의 열처리 온도에 따른 Proteinase 실활정도를 나타낸 도이다.
도 13는 UV-손상 세포에 대한 100℃ 열처리 고체발효쌀 추출건조물의 콜라겐 생합성 촉진 효능을 나타낸 도이다.

본 발명은 발효쌀 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화방지 억제용 조성물을 제공한다.

보다 상세하게, 발효쌀 추출물은 증자한 현미에 Bacillus licheniformis를 접종하여 35℃에서 6 ~ 7일간 고체발효시킨다.

고체발효된 발효쌀을 100℃에서 10분 내지 20분동안 열처리하고 물추출하여 건조한다. 바람직하게, 상기 건조는 동결건조 및 분무건조에 의해 이루어질 수 있고, 더욱 바람직하게는 분무 건조에 의해 이루어진다.

발효쌀에 함유된 고분자의 단백질, 지질, 전분 등은 Bacillus licheniformis가 분비하는 다양한 효소에 의해 분해되고, 이러한 과정에서 단백질 분해산물인 올리고펩타이드의 생성 및 용출이 용이하게 된다. 올리고펩타이드는 세포막 수용체에 결합하여 신호물질로 작용하여서 세포활성 조절인자로 작용하여 angiotensin converting enzyme의 저해 및 항산화, 항혈전, 콜레스테롤 강하, 항암 효과, 칼슘 흡수 촉진, 항비만 효과를 갖는다.

이러한 발효쌀 추출물 또는 이를 함유하는 화장료 조성물은 손상된 섬유아세포의 콜라겐 생합성량을 증가시킴으로 인하여 피부의 탄력성을 유지, 증진하여 피부주름 개선 또는 방지 효과를 가져서 결과적으로 피부노화를 억제하게 된다.

상기 발효쌀 추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.001~5중량%으로 함유되는 것을 특징으로 한다. 이는 0.001중량% 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 5중량% 초과에서는 안전성, 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다. 유효한 효과와 안정성, 및 제형 안정성을 고려한다면 0.01~5.0중량%가 바람직하다.

본 발명에 의한 피부노화 억제용 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로 화장수, 영양크림, 영양로션, 마사지크림, 영양에센스, 팩 등의 화장료 제형일 수 있다.

또한, 본 발명의 피부노화 억제용 조성물은 유효 성분으로서 상기 발효쌀 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르,폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명은 다음의 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.

실시예 1: 현미 고체발효

현미와 동일량의 물을 넣고 증자하여 제조한 현미쌀에 Bacillus licheniformis(안동대학교 식품생명공학과에서 분양)를 2% 접종한 후 35℃를 유지하면서 6 ~ 7일 동안 고체발효를 진행하였다.

고체발효에 사용된 쌀샘플은 하기 표 1과 같으며 이후 샘플번호로 쌀 종류를 구분하였다.

고체발효중 생성되는 올리고펩타이드 함량 분석은 1 g 발효밥에 10 ㎖ 물을 첨가하고 1시간 동안 교반추출한 후 여과한 여액 50 ㎕을 채취하여 1 ㎖ OPA(Sigma P0532) 용액과 혼합하고 상온에서 20분 유지시킨 후 340 nm에서 흡광도를 측정하였고 표준물질로 Oxidised glutathione을 사용하여 검량선을 작성하여 올리고펩타이드 함량을 표시하였다.

쌀 샘플의 품종 및 계통 명

샘플번호	벼 품종 및 계통명	샘플번호	벼 품종 및 계통명
1	동진1호	14	다산벼
2	조생흑찰	15	익산525
3	다미	16	밀양232
4	조아미	17	익산514
5	보석벼	18	진수미
6	해오름미	19	주남벼
7	삼광벼	20	새추청벼
8	운광벼	21	일품벼
9	밀양240	22	호품벼
10	익산524	23	칠보벼
11	한마음벼	24	삼덕벼
12	밀양248	25	조광벼
13	수원518

본 발명에 사용한 쌀 샘플 품종 및 계통은 경상북도지역에 추천하는 장려품종(동진 1호, 조생흑찰, 다미, 조아미, 보석벼, 해오름미, 삼광벼, 운광벼, 한마음벼, 다산벼, 진수미, 주남벼, 새추청벼, 일품벼, 호품벼, 칠보벼, 삼덕벼, 조광벼) 및 육성계통(밀양240, 익산524, 밀양248, 수원518, 익산525, 밀양232, 익산514)으로 농촌진흥청에서 지역적응 및 용도개발 등으로 보급확대 및 품종화할 쌀로써 필요에 따른 종자의 보급이 가능하다.

도 1은 현미밥을 고체발효를 진행하면서 생성되는 올리고펩타이드 함량을 분석한 결과로 8번 운광벼, 12번 밀양248, 13번 수원518, 14번 다산벼, 21번 일품벼, 23번 칠보벼, 24번 삼덕벼에서 우수한 올리고펩타이드 생성을 보였다. 위에서 선발된 7종류의 쌀에 대하여 반복실험을 수행하여 올리고펩타이드 생성량이 1,000 ㎍/㎖ 이상임을 확인하였다(도 2).

실시예 2: 고체 발효쌀 추출건조물 조제

고체 발효쌀에 3배 이상의 물을 첨가하고 10분간 끓여 열처리를 한 후 1시간 방냉하고 여과하여 고체 발효쌀 추출물을 조제하였다. 열처리 온도는 도 12에서와 같이 Proteinase와 같은 효소가 완전히 실활되어 세포독성을 나타내지 않는 온도인 100℃이다(도 8, 도 9, 도 10, 도 11).

고체 발효쌀 추출물은 동결건조기 또는 분무건조기를 각각 이용하여 건조하였고, 고체 발효쌀 추출건조물의 수율은 3.6 ~ 5.6%였고 분무건조의 경우 1.6 ~ 4.0%였다(도 3). 또한 12번 밀양248 무발효물의 분무건조 수율 0.4%에서 발효물 분무건조 수율 3.4%로 발효과정을 통해 수율이 약 8배 높아져 Bacillus licheniformis에서 생성되는 다양한 분해효소에 의해 수용성 물질이 증가하였다.

올리고펩타이드 함량은 동결건조 보다 분무건조에서 높아져 단위무게당 올리고펩타이드 량이 분무건조물에서 높았다(도 4). 또한 총 페놀함량에서도 동결건조 보다 분무건조에서 높은 경향을 보였고(도 6), 항산화 활성도 분무건조물에서 높게 나타났다(도 7). 이후 세포독성 실험 및 콜라겐 생합성촉진실험의 재료로 고체발효쌀 추출물을 분무건조한 시료를 단계별로 희석하여 분석하였다. 이 때 총 polyphenol 함량은 검액 200 ㎕에 200 ㎕의 Folin-ciocalteau을 넣고 6분간 실온에 방치한 후 2 ㎖ 7% Na₂CO₃ 용액을 넣고 실온에서 1시간 30분 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. DPPH 라디컬 소거능은 1 ㎖ DPPH와 검액 4 ㎖를 실온에서 20분 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도을 측정하여 계산하였다.

도 5는 고체발효쌀 추출건조물의 올리고펩타이드 양상을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과로 대부분 10 kD 이하의 올리고펩타이드로 구성되어 있음을 확인하였다.

실시예 3: 고체발효쌀 추출물의 세포독성 검사

(3-1) UV-손상세포 세포독성 검사

본 실험에 이용한 세포는 HS68이며 ATCC로부터 구입하여 사용하였다. 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin/streptomycin (100 U/㎖)을 첨가한 Dulbeco's modified eagle‘s medium (DMEM) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대배양하였다.

HS68 세포를 1× 10⁵cells/㎖농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 HS68 세포에서 배양배지를 제거하고 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세척하였다. 인산완충액을 500 ㎕ 첨가한 다음 자외선 조사(광원으로부터 65 ㎝, 1분 40초) 후 신선한 세포배양배지로 교체하였다. 실험원료를 농도별로 처리하여 자외선 조사 후 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포생존율을 비교하여 UV-손상세포의 세포독성을 분석하였다.

비열처리 샘플의 경우 전반적으로 높은 UV-손상세포에 대하여 높은 독성을 나타내었다(도 8).

열처리 샘플은 UV-손상세포에 대하여 독성을 나타내지 않아 손상을 입은 세포의 경우에서도 안전하게 사용할 수 있는 물질임을 확인하였고 오히려 세포생존율이 증가하였다(도 9).

(3-2) 정상세포 세포독성 검사

HS68 세포를 1× 10⁵cells/㎖ 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 것에 각 샘플을 농도별로 희석하여 배양액에 첨가하여 세포생존율을 무처리와 비교하여 분석하였다.

도 10은 정상세포에 비열처리 고체발효쌀 추출건조물을 처리한 결과로 50 ㎍/㎖ 이상에서 독성이 있는 것으로 나타났다.

도 11은 정상세포에 열처리 고체발효쌀 추출건조물을 처리한 결과로 무발효쌀 추출건조물과 비교 시 100 ㎍/㎖까지 생존율의 차이가 없었다. 하지만 5~ 10 ㎍/㎖의 농도에서 세포의 생존율을 향상시키는 효과를 확인하고 0.5 ~ 10 ㎍/㎖농도에서 UV-손상 섬유아세포의 콜라겐 생합성 촉진능을 분석하였다.

도 12는 고체발효쌀 추출건조물 열처리온도에 따른 Proteinase 활성을 측정한 것으로 90℃에서도 무처리 대비 43%의 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. Proteinase 활성은 1.5% 카제인을 함유한 1 ㎖ mellvine 완충액과 1 ㎖ 1.5 mM Na₂EDTA과 검액 1 ㎖을 잘 혼합한 다음 30℃에서 10분간 방치한 후 3 ㎖ 0.4M TCA용액을 첨가하여 반응을 중단시킨 후 여과한 여액 1 ㎖과 2.5 ㎖ 0.55M Na₂CO₃과 Folin 시약 1.5 ㎖을 혼합하여 660 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였고 표준물질로 Tyrosine를 사용하여 검량선을 작성하였다.

실시예 4: 고체발효쌀 추출물 콜라겐 생합성 촉진 효과

피부 진피세포 내 주요 단백질인 collagen의 수준을 측정하기 위하여 UV-손상 섬유아세포(Hs68)에 열처리(100℃) 고체발효쌀 추출건조물을 일정 농도로 희석한 것을 처리하여 콜라겐량을 측정하여 콜라겐 생합성 촉진능을 분석하였다.

콜라겐 생합성 정도는 Marcello 등(18)의 방법을 변형하여 실험 하였다. 즉, HS68 세포를 1× 10⁵cells/㎖ 농도로 12 well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양 후 배양배지를 제거하고 인산완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세척하였다. 인산완충액을 1,000 ㎕ 첨가한 다음 자외선 조사(광원으로부터 65 cm, 1분 40초) 후 신선한 세포배양배지를 사용하여 시료를 농도별로 처리 하였다. 시료 처리 후 48시간 동안 배양기에서 배양한 다음 배지를 제거하고 인산완충용액으로 세척하였다. 각 well에 lysis 용액(100 mM Tris HCl, 0.5 mM MgCl₂,0.1% TritonX-100)을 넣은 후 용해시켰다. 용해된 세포를 모은 후 원심분리(2,000 rpm, 4℃, 5 min)를 수행하여 얻은 상등액 50 ㎕를 96 well에 넣었다. 그리고 37℃에서 16시간 동안 방치한 후 dry oven에서 24시간 방치했다. 다음으로 증류수 200 ㎕를 이용하여 3번 헹구고 0.1% Sirius Red F3BA를 포함하는 saturated picric acid 용액을 만들어 각 well에 100 ㎕씩 넣고, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이후에 10 mM HCl solution을 각 well에 200 ㎕씩 넣어 5회 세척하였다. 그리고 각 well에 0.1 N NaOH 200 ㎕를 넣고 5분간 방치한 후 new plate에 옮긴 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 총단백질로 보정하였다.

피부의 주요한 구성 성분은 콜라겐이다. 콜라겐은 진피 건조중량의 70 ~ 80%를 차지한다. type I, typeⅢ 콜라겐이 주요한 성분이며 type I은 총 콜라겐의 80%를, typeⅢ는 15%를 차지한다. 피부의 주름은 콜라겐의 합성과 분해의 불균형에 기인한다. 피부 섬유아세포를 이용하여 발효쌀 추출물의 UV조사에 따른 콜라겐 생합성 촉진능을 분석한 결과는 도 13과 같다. UV 조사 후 발효쌀 추출물을 농도별로 처리한 다음 HS68 세포를 48시간 배양하여 콜라겐 생합성 정도를 측정한 결과 0.5 ~ 10 ㎍/㎖ 농도범위에서 13, 14, 21, 23, 24번 샘플이 콜라겐 생합성량을 증가시키는 것으로 나타났으며 13번의 경우 5 ㎍/㎖에서 37.6% 이상 콜라겐 생합성량이 증가하였다. 이러한 결과는 도 8에서와 같이 레티놀릭산이 독성이 없는 농도인 1.5 ㎍/㎖에서 처리하였을 때 10.8%의 콜라겐량을 증대시키는 것(도 13)과 비교되는 높은 수준의 생합성 촉진능을 나타내었다.

Claims (6)

1. 현미에 동량의 물을 가수하여 10분간 증자한 현미에 Bacillus licheniformis 균주를 접종하여 고체 발효시키는 단계와; 상기에서 얻은 현미 고체 발효물에 3배의 물을 가한 후, 100℃에서 10 내지 20분간 열처리하여 세포독성을 나타내는 효소를 실활시키는 단계와; 상기 효소를 실활시킨 현미 발효물을 분무 건조시키는 단계를 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 발효현미 추출 건조물의 제조방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 현미는 운광벼, 밀양248, 수원518, 다산벼, 일품벼, 칠보벼 또는 삼덕벼 품종 중 어느 하나를 선택하는 것이 특징인 발효현미 추출 건조물의 제조방법.
   
4. 청구항 제1항 또는 제3항에 따라 수득되어 10KD 이하의 올리고펩타이드로 구성된 것이 특징인 발효현미 추출 건조물.
   
5. 청구항 제4항의 발효현미 추출 건조물을 유효성분으로 함유하는 콜라겐 생합성 증진용 화장료 조성물.
6. 청구항 제4항의 발효현미 추출 건조물을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 및 주름 개선용 화장료 조성물.

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