KR20120117116A - 발효홍삼 추출물을 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효홍삼 추출물을 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍삼 추출물에 유산균을 접종하여 발효시킨 후 아스페르길루스 니가 및 트리코더마 리세이를 접종, 배양하여 수득된 발효홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 발효홍삼 추출물은 장수 유전자로 알려져 있는 SIRT3의 발현을 증가시키고 세포의 DNA 손상과 세포막 산화작용을 저해함으로써 피부에서 세포사멸을 방지하는 효과를 나타내므로 피부상태를 개선시켜주는 화장료 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

발효홍삼 추출물을 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물 {Cosmetic compositions for preventing skin cell death comprising extracts of fermented red ginseng}

본 발명은 발효홍삼 추출물을 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍삼 추출물에 유산균을 접종하여 발효시킨 후 아스페르길루스 니가 및 트리코더마 리세이를 접종, 배양하여 수득된 발효홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

평균 수명이 증가하고 사회의 고령화가 진행되면서 노화, 노화와 관련된 질병 및 피부 노화에 관한 관심이 증대되고 있다. 노화와 관련하여 다양한 정의가 있으며, 세포 복제와 관련하여 사람의 정상 체세포가 한정된 세포 분열 후에 더 이상 세포 분열을 할 수 없는 성장의 멈춤 단계를 노화로 정의한다 [Mech. Ageing Dev., 123, 927-936, 2002]. 노화는 신경퇴화 질환, 암 또는 당뇨병 등의 대사 증후군 등의 질병과 관련이 있으며, 이러한 노화와 관련된 원인으로 유전학적 원인, DNA 손상의 축적, 산화적 스트레스에 대한 반응, 텔로미어의 손상 등이 알려져 있다. 생물체에는 개체의 노화와 수명에 영향을 미치는 진화적으로 보존된 유전자 경로가 존재하는 것으로 보고되어 있고, 몇몇 실험동물의 경우 개체의 수명을 결정할 수 있는 유전자, 예를 들어 초파리의 methuselah, Indy, Sirt2 등이 보고되어 있다 [Aging cell, 2, 123-130, 2003].

한편, 대부분의 생물은 병균, 해충 또는 바이러스 등의 생물학적 스트레스뿐만 아니라 지구 환경 악화에 따라 생기는 각종 환경 스트레스를 받으면 생명 유지에 필요한 필수 원소인 산소는 반응성이 높아 심각한 생리적 장애 등을 유발하는 활성산소종 (Reactive Oxygen Species)으로 변하게 된다. 따라서 생체 내에는 이러한 활성산소종을 제거하는 시스템으로 슈퍼 옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD), 퍼옥시다제 (Peroxidase, POD), 카탈라제 (Catalase, CAT) 등의 고분자 항산화 효소와 비타민 C, 비타민 E 또는 글루타치온 (Glutathion) 등의 항산화 물질 등이 많이 존재하게 된다. 이 중, SOD는 거의 모든 생물에 존재하고, 활성 산소종을 제거하는 생체 방어 기구에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다 [Annals of Botany, 91, 174-194, 2003].

사람 개체의 노화를 방지할 수 있는 물질이나 체내에서 활성 산소종을 제거하거나 활성 산소종의 활성을 약화시키는 물질을 검색하는 방법을 수립하기는 어렵다. 그러나 최근에는 특정 질병 또는 노화와 관련이 있는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 개발함으로써 상기 질병을 예방 또는 개선하는 물질 또는 노화 방지 물질을 개발하는 방법이 제시되고 있다. 식물이 환경 스트레스에 반응하여 생산하는 레스베라트롤 등의 폴리페놀 물질이 SIRT2의 활성을 촉진시킴으로써 효모의 복제 수명과 꼬마 선충 또는 초파리 등의 수명을 증가시키고 사람 세포의 생존 능력을 향상시키는 현상이 보고됨으로써 상기 방법의 타당성이 입증되었다 [Nature, 430, 686.689, 2004].

상기와 같은 타당성이 입증됨에 따라, SIRT3 유전자 등과 같이 특정 질환 또는 사람 개체의 수명과 밀접한 상관관계가 있는 유전자에 대해서도 이들 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질을 부작용의 위험성이 최소화된 천연물로부터 개발하려는 요구가 증대되고 있다.

포유동물의 Sir2 단백질인 SIRT (Slient Information Regulator 2 related protein, surtuin)는 SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 및 SIRT7의 7종류가 있는 것으로 보고되어 있다. 이 단백질들은 모두 잘 보존된 NAD-dependent sirtuin core domain을 갖고 있으며 수명 조절 역할을 할 수 있는 것으로 보고되고 있다 [Annu. Rev. Biochem., 75, 432-465, 2006].

상기 SIRT는 다양한 종류의 조직에서 두루 발현이 되며, 4종류 즉, SIRT1 내지 SIRT3로 구성되는 class Ⅰ, SIRT4로 구성되는 class Ⅱ, SIRT5로 구성되는 class Ⅲ, 및 SIRT6와 SIRT7으로 구성되는 class Ⅳ로 분류된다 [Biochem. Biophys. Res. Commun. 273, 793-798, 2000].

이 중, class Ⅰ에 속하는 포유동물의 SIRT1 (Silent Information Regulator 2-related protein type 1)과 SIRT3 (Silent Information Regulator 2-related protein type 3)는 핵 (SIRT1)과 미토콘드리아의 매트릭스 (SIRT3)에 존재한다는 점에서 차이가 있으나, 칼로리 제한 (calorie restriction)에 의하여 발현이 증가되고 [Science, 305, 390-392, 2004; J. Biol Chem., 280(14), 13560-13657, 2005], 공통적으로 대사 조절에서 중추적인 역할을 하는 PGC-1 알파 (PPAR gamma coactivator 1 alpha)를 활성화한다는 공통점이 있다.

한편, 미토콘드리아는 세포에 에너지를 공급할 뿐 아니라 DNA 손상이나 산화 스트레스에 반응하여 세포사를 유도하는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 보다 상세하게는 특히 포유동물의 노화의 한 원인으로 보고되고 있는 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)를 생산하는 미토콘드리아의 비정상적인 활성이 포유동물의 노화와 대사질환 및 퇴행성 신경질환 등의 다양한 질환과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보고되어 있다 [GENES & DEVELOPMENT, 23, 1714-1736].

따라서 최근에는 포유동물의 Sir2 단백질인 SIRT에 대한 연구 특히, class Ⅰ 중에서 SIRT1과 미토콘드리아에 존재하는 SIRT3에 대한 연구가 진행 중이다.

SIRT1 유전자의 발현과 노화와 관련된 연구 결과에 의하면, SIRT1의 활성을 촉진시키는 것으로 알려진 레스베라트롤 (resveratrol)은 모델동물의 수명을 증가시키는 것으로 보고되어 있다 [Cell, 127, 1109-1122, 2006].

또한, SIRT3 유전자의 발현과 수명과의 상관관계에 대한 연구 결과에 의하면, 단백질 1차 구조에 변화를 유발하지 않는 G447T 트랜스버젼 돌연변이가 남성 노인의 생존과 관련이 있음이 발견되었으며 [Exp Gerontol., 38(10), 1065-1070, 2003], 945명 (20-106세)의 사람에서 SIRT3 대립 유전자의 분포를 분석한 결과, 90세 이상의 남성에서 5번 인트론의 인핸서 활성이 없는 대립 유전자는 사실상 발견되지 않았으므로 사람 SIRT3 유전자의 발현정도와 수명 사이에서 상관관계가 있는 것으로 입증되었다 [Genomics, 85(2), 258-264, 2005]. SIRT3는 원핵 생물 및 진핵 생물에 보존되어 있는 SIRT1의 동종이다. SIRT3 단백질은 N-말단에 위치하는 독특한 도메인에 의해 미토콘드리아 크리스타 (crystae)에 표적화되어 있다. SIRT3는 NAD⁺-의존성 단백질 데아세틸라제 활성을 가지며, 특히 대사적으로 활성인 조직에서는 어디에서나 발현된다.

최근의 연구 자료에 의하면 SIRT3 유전자가 결여된 쥐의 배아 섬유아세포는 비정상적인 미토콘드리아 기능을 보이며, 스트레스에 의해 유도된 슈퍼옥사이드의 농도가 증가하고 유전체의 불안정화를 가져오는 것으로 밝혀졌다. 그리고 암유발 유전자인 Myc 또는 Ras의 발현이 증가하여 세포의 형질전환을 일으키고 세포내 메커니즘을 변화시키는 것으로 알려졌다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 이들 세포에 처리하면 스트레스에 의해 유도된 유전체 불안정화와 암 세포의 성질이 줄어드는 것으로 보아 SIRT3는 세포내 항산화 작용뿐만 아니라 암 발생 저해 인자로써의 기능을 가지는 것으로 알 수 있다 [Cancer Cell. Jan 19;17(1), 41-52, 2010].

이러한 연구결과의 축적에 따라 장수 및 항노화에 직접적인 영향을 줄 수 있는 SIRT3 유전자의 발현을 조절할 수 있는 천연 식물 유래의 물질을 찾으려는 노력이 진행 중에 있다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해주며, 체온 조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 외부로부터 받는 과도한 물리적?화학적 자극 및 스트레스, 영양 결핍 등은 피부의 정상 기능을 저하시켜 피부상태를 악화시키게 된다. 따라서 이러한 현상을 방지하고 보다 건강하고 탄력 있는 피부를 유지하기 위하여 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질들이 강화된 화장품을 사용함으로써 피부의 고유 기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시키기 위한 노력이 있었다. 종래의 화장료 원료가 근본적으로는 피부 상태를 개선시키지 못하는 단점으로 인하여 새로운 기능성 물질들을 찾고자 하는 연구가 시도되어 왔다. 종래부터 생약 등으로 사용되어 오던 여러 가지 자연의 천연물 등은 안정성이 뛰어날 뿐 아니라 여러 가지 유익한 약효 성분 등을 함유하고 있어 좋은 검색 대상이 되고 있다.

인삼(Panax ginseng C.A.Meyer)은 과거 수천 년 전부터 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 등에서 주로 건강 증진을 위한 목적으로 널리 사용하여 왔다. 인삼을 물과 에탄올로 추출한 인삼 추출물의 주 효능을 나타내는 사포닌 (Saponin)은 30 종류 이상의 진세노사이드 (Ginsenoside)로 구성되어 있다. 최근에는 인삼을 증기로 수차례 쪄서 가공하여 인체에 유용한 미량의 진세노사이드를 함유한 홍삼의 효능이 뛰어나다고 알려져 있다. 진세노사이드는 홍삼 추출물의 주요성분으로 면역력 강화, 항염증 작용, 항알러지 작용, 항암 효과, 발기 부전에 대한 효과, 혈압 강하 작용, 항콜레스테롤 작용, 항혈전작용, 성인병 및 노화에 대한 예방 및 치료 효과가 있음이 보고되어 있다 [Biol. Pharm. Bull, 32(9), 1552-1558, 2009]. 홍삼의 피부 미용과 관련된 연구로는 진세노사이드 F1이 인간 각질 세포에서 자외선 조사로 인한 세포 사멸을 감소시킬 뿐 아니라, 자외선에 의해 촉진되는 세포 자기사멸로부터 각질세포를 보고하는 효과가 있으며 [J. Invest. Dermatol., 121, 607-613, 2003] 진세노사이드-Rb2는 시험관내(in vitro)에서 피부 세포의 증식 효과가 있다고 보고되었다 [Arch. Pharm. Res., 25, 71-76, 2002]. 또한 compound K는 인간의 각질세포에서 피부 탄력 성분 중의 하나로 알려진 히아루론산 생합성에 관련되는 hyaluronan synthase2 (HAS2) 유전자 발현을 증진시키며 [Biochem. and Biophysical Research Communications, 316, 348-355, 2004], 최근 홍삼과 대두추출물을 Hairless mouse에 경구투여 하였을 때 주름 생성을 예방하는 효과가 있다고 보고되었다 [Korean J. Food Sci. Technol., 37, 986-996, 2005]. 체내에 섭취된 사포닌은 장내에 있는 미생물에 의해 분해되어 체내로 흡수된다 [Panta Med. 62, 453-457, 1996]. 그러나 장내 미생물 균종이 사람마다 다르기 때문에 진세노사이드의 전환율과 생체이용율은 다를 수밖에 없다 [J. Pharm. Pharmacol., 50, 1155-1160, 1998]. 따라서 최근에는 이러한 차이를 줄이기 위해서 미생물을 이용하여 홍삼으로부터 발효홍삼을 제조하고 있다.

발효 홍삼에 관하여 제조법에 관한 특허는 있으나 [KR 10-0789678, KR 10-0950978] 발효홍삼의 장수유전자와 관련된 특허는 아직 보고된 것이 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 유산균 및 곰팡이균을 이용한 발효홍삼 추출물이 피부세포의 SIRT3 유전자의 발현을 증가시켜 피부세포의 사멸 방지에 효과적임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 피부세포의 SIRT3 유전자의 발현을 증가시키고 세포의 DNA 손상 및 세포막 산화 작용을 억제함으로써 세포사멸 방지 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 피부세포 사멸방지 효과를 갖는 발효홍삼 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 발효홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 ‘발효홍삼’은 유산균, 효모, 곰팡이 등의 미생물을 이용하여 발효과정을 거친 홍삼을 말하는 것으로, 일반 홍삼과 비교하여 특정 유효성분의 함량이 달라지게 된다. 본 발명에서 발효홍삼 추출물은 홍삼 추출물에 유산균을 접종하여 발효시킨 후 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger) 및 트리코더마 리세이(Tricoderma reesei)를 접종, 배양하여 수득된다. 이렇게 수득된 발효홍삼 추출물을 기존 홍삼과는 다른 생리학적 효과를 나타내게 된다.

상기 유산균은 식품의 발효공정에 주로 사용되고 있는 Lactobacillus casei , Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus reuteri , Lactobacillus confusus , Lactobacillus fermentum , Lactobacillus brevis 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 발효홍삼 추출물은 피부세포에서 SIRT3 (Silent Information Regulator 2-related protein type 3) 발현을 증가시킴으로써 세포사멸 방지 효과를 나타낼 수 있다.

상기 SIRT3는 유전자의 발현 정도와 수명 사이에서 상관관계가 있는 것으로 알려져 있으며 (Genomics, 85(2), 258-264, 2005), 최근의 연구결과에서 세포내 항산화 작용, 및 암 발생 저해인자로서의 기능을 가지는 것으로 알려져 있다 (Cancer Cell. Jan 19;17(1), 41-52, 2010). 이러한 연구결과에 따라, 본 발명자들은 피부세포의 사멸 방지에 영향을 줄 수 있는 SIRT3 유전자의 발현을 조절할 수 있는 천연 식물 유래의 물질로서 발효홍삼의 가능성을 처음으로 확인하였다.

본 발명의 실시예에서는, 발효홍삼 추출물을 이용하여 피부세포의 SIRT3 유전자의 발현정도를 측정하였으며, 그 결과 발효홍삼 추출물이 SIRT3 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. 그러나 발효공정을 거치지 않은 일반 홍삼의 경우 SIRT3 유전자의 발현에는 아무런 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되었다 (도 2 참조). 따라서 본 발명에 따른 미생물 균주를 이용한 발효공정이 기존 홍삼의 유효성분을 변화시켜 최종적으로 SIRT3 유전자의 발현에 영향을 미친 것으로 판단된다.

또한 본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 발효홍삼 추출물은 피부세포에서 자외선에 의해 유발되는 DNA 손상 억제 및 활성산소에 의한 세포막 산화작용 억제를 통해 세포사멸 방지 효과를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 발효홍삼 추출물이 자외선 처리에 의한 피부세포의 DNA 손상 회복 및 활성산소에 의한 세포사멸에 직접적으로 효과가 있는지를 확인하였으며, 그 결과 자외선에 의한 DNA 손상 및 과산화수소에 의한 세포사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다 (표 4 및 5 참조).

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 발효홍삼 추출물은 화장료 조성물에 0.0001 내지 10 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우에는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과할 경우에는 함유량의 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않을 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림 및 영양 에센스로 구성된 군에서 선택된 제형을 가질 수 있다.

상기 화장료로 사용 시 본 발명에 따른 조성물에는, 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 맞게 임의로 선정한 물질을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 유분, 계면활성제, 보습제, 고급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 지방산, 산화방지제, 방부제, 왁스, pH 조절제, 향료 등이 첨가될 수 있다.

상기 유분으로는 미네랄오일, 사이클로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브오일, 마카다미아 너트오일,　글리세릴옥타노에이트, 캐스터오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산, 선플라워씨드오일 등이 사용될 수 있다.

상기 계면활성제로는 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레

이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드. 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등이 사용될 수 있다.　

상기 보습제로는 글리세린, 솔비톨, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메칠글루세스-20 등이 사용될 수 있다.

상기 고급 알코올로는 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등이 사용될 수 있다.

상기 증점제로는 산탄검, 카보머, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등이 사용될 수 있다.　

상기 킬레이트제로는 디소듐이디티에이, 테트라소듐이디티에이 등이 사용될 수 있다.

상기 색소로는 청색1호, 적색40호, 황색4호, 황색 <41> 5호 등이 사용될 수 있다.　

상기 지방산으로는 스테아릭애씨드, 미리스틱애씨드, 팔미틱애씨드, 이소스테아릭애씨드, 라우릭애씨드 등이 사용될 수 있다.

상기 산화방지제로는 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등이 사용될 수 있다.

상기 방부제로는 메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등이 사용될 수 있다.　

상기 왁스로는 카나우바왁스, 칸데닐라왁스, 밀납, 경납 등이 사용될 수 있다.

상기 pH 조절제로는 트리에탄올아민, 씨트릭애씨드 등이 사용될 수 있다.

상기 향료로는 천연향료, 조합향료 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 발효홍삼 추출물의 제조방법을 제공한다:

a) 홍삼으로부터 추출용매를 이용하여 홍삼 추출물을 얻는 단계;

b) 상기 홍삼 추출물에 락토바실러스 퍼멘텀을 접종하여 30 내지 37 ℃에서 3 내지 4일간 발효하는 단계;

c) 상기 발효액에 아스페르길루스 니가 및 트리코더마 리세이를 각각 접종하여 25 내지 30℃에서 3 내지 4일간 배양하는 단계; 및

d) 상기 배양액을 숙성, 열처리 및 여과하여 발효홍삼 추출물을 얻는 단계.

본 발명의 제조방법에서, 상기 추출용매는 물, 에탄올, 메탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 에틸아세테이트로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 사용할 수 있다.

상기 추출용매를 이용한 홍삼 추출물을 얻는 방법은, 통상적인 식물 추출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 홍삼 또는 홍삼 분쇄물의 총 중량에 대하여 5 내지 20 부피의 추출용매로 50-100℃로 4-20시간 동안 가열하여 추출하거나, 5-37℃에서 1-15일간 침적시켜 추출할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 발효홍삼 추출물은 장수 유전자로 알려져 있는 SIRT3의 발현을 증가시키고 세포의 DNA 손상과 세포막 산화작용을 저해하는 효과가 있으므로, 피부에서 세포사멸을 방지하여 피부상태를 개선시켜주는 화장료 개발에 적용할 경우 시장 경쟁력이 매우 우수할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 발효홍삼 추출물의 섬유아세포에 대한 독성을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 발효홍삼 추출물의 처리에 의한 SIRT3 유전자의 발현양을 측정한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 발효홍삼 추출물의 제조 및 정제

6년근 홍삼 30 kg을 90 ~ 100℃에서 3 ~ 5시간 동안 열처리 한 후, 상기 열처리한 홍삼을 열풍 건조기에서 50 ~ 60℃에서 3일간 건조하였다. 홍삼 건조물 8.5 kg을 회수하여 4 ~ 5배 분량의 이온수를 넣고, 80 ~ 90℃에서 8시간씩 3회 추출하였다. 추출한 액을 농축하여 고형분 60%의 홍삼 추출물 엑기스를 제조한 후, 제조된 농축액 5.0 kg을 발효조에 넣고 3배 분량의 이온수 15 L를 첨가하였다. 상기 액을 100℃에서 30분간 살균처리한 후, 37℃까지 온도를 낮추었다.

이후, MRS 배지에서 37℃, 2일간 정치 배양한 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum; KCCM10912P) 200 mL (1×10⁸ cell/mL)를 접종한 후, 0.5 bar, 37℃, 100 rpm의 발효조 조건으로 2일간 발효하였다. 상기 발효액을 100℃에서 30분간 살균하고, 냉각하여 유산균발효 홍삼추출액을 제조하였다.

이후 3% 맥아즙에서 25℃, 160 rpm 조건으로 2일 배양한 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger) 전배양액 400 mL(1×10⁸ cell/mL)와 PDB(potato dextrose broth)에서 28℃, 160 rpm의 조건으로 2일 배양한 트리코더마 리세이(Tricoderma reesei) 전배양액 400 mL(1×10⁸ cell/mL)를 각각 상기 10 L의 유산균발효 홍삼추출액에 접종하여 200 rpm, 0.5 vvm 조건으로 각각 25℃에서 3일간, 28℃에서 3일간 배양하였다. 상기 배양액들을 1,500 bar, 3회 조건으로 고압유화기(Microfludizer(110Y), Microfluidics Corperation)를 통과시킨 후, 1일간 40℃에서 숙성하였다. 상기 숙성액을 110 ~ 125℃에서 30분간 열처리한 후, 400 g의 여과보조제를 첨가한 후 필터프레스로 여과하였다. 상기 여과액을 고형분 60 ~ 65%로 농축하여 발효홍삼 추출물을 제조하였다.

실험예 1. Fibroblast 세포의 독성 측정

Fibroblast 세포주 (ATCC No. CRL-2076)의 배양은 IMDM (Gibco BRL, USA)에 Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco BRL USA)을 10% 되게 첨가한 배양액에 배양하여 수행하였다. 구체적으로는 상기 Fibroblast 세포주를 100 mm 배양접시 (Nunc, Denmark)에 10 mL로 유지하였고, 주기적으로 계대배양하였다.

세포밀도가 약 85?90% 가량 될 때 발효홍삼 추출물을 처리하여 24시간 후 세포활성 정도를 측정하여 표 1과 도 1에 나타내었다. 하기 표 1과 도 1에서 보듯이, 발효홍삼 추출물을 Fibroblast 세포주에 처리하였을 때, 세포독성이 없음을 관찰할 수 있었다.

	대조군	발효홍삼 10 μg/ml	발효홍삼 50 μg/ml	발효홍삼 100 μg/ml
세포 생존율 (%)	100±1.34	104.5±1.52	102.9±2.04	104.8±2.16

실험예 2. SIRT3 유전자 발현량 측정

SIRT3 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해 RT-PCR 법을 사용하였다. Fibroblast 세포주로부터의 mRNA의 획득은 TRIzol reagent (Invitrogen, USA) 및 상기 reagent 제조사의 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 구체적으로는 60 mm 배양접시 (Nunc, Denmark)에 1×10⁶ cells/dish의 세포를 준비한 뒤, 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 상기 24시간 배양한 세포 배양액에 실시예 1의 발효홍삼 추출물을 최종농도가 10, 50, 100 ㎍/mL이 되도록 처리하고 양성 대조군으로 레스베라트롤 2.3 μg/mL이 되도록 처리한 뒤 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 세포 배양액에 아무것도 처리하지 않은 것을 대조예로 사용하였다. 상기 24시간 동안 배양한 배양액을 제거한 뒤 TRIzol reagent 1 mL를 가하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포를 각각 1.5 mL microfuge 튜브로 옮긴 후, 클로로포름 (Chloroform) 0.2 mL를 첨가하여 실온에서 5분 방치한 후, 15,000 rpm으로 30분간 원심분리를 수행하였다. 원심분리 수행 후, 세포를 파괴시킨 혼합액의 상등액을 새 1.5 mL microfuge 튜브로 옮긴 후, Isopropanol을 0.6 mL 첨가하여 inverting 한 후, 실온에서 10분간 방치한 후, 13,000 rpm으로 20분간 원심분리를 가하여 RNA를 침전시켜 수득하였다. 상기의 튜브에서 Isopropanol을 제거한 후, 75% 에탄올 1 mL를 첨가하여 inverting한 후, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 에탄올을 제거하여 정제된 RNA를 수득하고, RNA가 완전히 건조되면 DEPC-DW를 첨가하여 RNA를 획득하였다.

상기 실험에서 사용한 DEPC-DW는 3차 정제수 1 L에 DEPC (Diethyl pyrocarbonate) 1 mL를 첨가하여 121℃에서 25분간 멸균하여 제조함으로서 RNase가 inactivation된 DW이다.

SIRT3 mRNA 농도에 미치는 영향을 Reverse trascription PCR을 수행하여 확인하였다. Reverse transcription PCR을 수행하여 얻어진 mRNA의 상대적인 농도는 Housekeeping 유전자인 β-actin 유전자의 mRNA 농도와 비교하여 구하였다.

RT-PCR은 Superscript Ⅱ 키트 (Invitrogen, USA) 및 상기 키트 제조사의 프로토콜을 이용하여 수행하였으며, GENE CYCLER (Bio-Rad, USA) PCR 기기를 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로는 상기 실험예 2에서 얻은 mRNA 1 μg, 2X reaction buffer 12.5 μL, 10 pmole primer (Bioneer, Korea) 각각 3 μL씩, RT/PlatiumTaq Mix 1 μL를 넣어 최종 부피가 25 μL가 되도록 RNase-free DW를 넣어 제조하였다. 상기 SIRT3 유전자의 발현량을 확인하기 위해 사용한 프라이머 쌍에 대하여 하기 표 2에서 각각 기재하였다. 하기 표 2의 비교예는 Housekeeping 유전자 중 하나인 β-actin을 확인할 수 있는 프라이머를 사용하였다.

구분		염기서열
SIRT3	정방향 (Forward, 19 mer)	5'-GTGGTTGATTTCCCCATGG-3'
	역방향 (Reverse, 19 mer)	5'-ACAAGGTCCCGCATCTCTT-3'
비교예 (β-actin)	정방향 (Forward, 21 mer)	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'
	역방향 (Reverse, 21 mer)	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'

상기 제조한 PCR 반응액을 하기 표 3에 기재된 조건에서 PCR 반응을 수행하였다.

	SIRT3		비교예 (β-actin)
단계 (step)	온도	반응시간	온도	반응시간
Denaturation	94℃	35 sec	94℃	1 min
Annealing	57℃	25 sec	62℃	1 min
Extension	72℃	25 sec	72℃	1 min
Cycle	Go to denaturation step	40 cycle	Go to denaturation step	25 cycle

상기 PCR을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 SIRT3 mRNA의 발현량을 Housekeeping 유전자(Actin)의 발현량 값에 대하여 정량하여 나타낸 것이다.

실험 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이, 발효홍삼 추출물은 SIRT3 mRNA 양을 대조군에 비하여 최대 약 1.8배 증가시켰으며, 양성 대조군인 레스베라트롤을 처리한 것과 유사하게 SIRT3의 발현을 증가시켰다. 그러나 홍삼 추출물은 SIRT3 mRNA 발현량에 아무런 영향을 주지 못했다.

즉, 발효홍삼 추출물은 Fibroblast 세포주에서 SIRT3 mRNA의 발현양을 증가시키는 것으로 보아, SIRT3 발현양 증가에 따른 피부세포의 사멸방지에 효과가 있음을 예상할 수 있다.

실험예 3. 피부 세포 DNA 손상억제 평가

본 발명에 따른 발효홍삼 추출물에 대하여 배양된 사람의 정상 피부 각화 세포에서 자외선에 의해 발생되는 DNA 손상 억제 효과를 comet assay법으로 시험하였다. 배양된 사람의 정상 각화 세포(cultured normal human keratinocyte)에 발효홍삼 추출물을 농도별로 12시간 처리하여 배양 후 배지를 버리고 PBS로 세척하고 자외선 조사기로 UVB 60 mJ을 조사한 후 세포를 harvest하여 세포수준에서의 DNA 손상을 측정하였다.

핵양체 내에 DNA 가닥 절단(strand breakage)이 있는 경우 전기영동하면 양극(+극)쪽으로 이동되어 원래 구조로부터 확장된 꼬리(tail)의 형태를 보임으로써 전기영동 시 DNA의 손상을 쉽게 감지할 수 있다. 무작위로 선정된 50개 세포의 tail moment 값의 평균을 계산하여 특정 시료의 DNA 손상 정도로 하였다.

저해율 = [(자외선 조사 대조군 - 실험군)/자외선 조사 대조군]×100

상기 식으로 저해율(%)을 계산하고 결과를 하기 표 4에 정리하였다.

시 료	Tail moment	저해율(%)
Negative control	0.810	-
자외선 조사 대조군	0.9577	-
발효홍삼 10 μg/ml	0.9013	5.89
발효홍삼 50 μg/ml	0.8265	13.70
발효홍삼 100 μg/ml	0.7398	22.75

상기 표 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 발효홍삼 추출물은 10 μg/ml ~ 100 μg/ml 농도에서 5.89% 이상 22.75% 수준의 피부 세포 DNA 손상 억제효과를 보였다. 발효홍삼 추출물은 자외선에 의한 피부 세포 내 DNA의 손상도 매우 효과적으로 막아 주는 것을 알 수 있다.

실험예 4. 과산화수소를 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과

본 실시예는 H₂O₂를 처리하여 유도되는 세포 사멸에 대한 발효홍삼 추출물의 방어 효과를 평가한 것으로 활성산소종에 의한 세포내부 자극에 대한 세포 보호 및 회복효과를 평가한 것이다.

Fibroblast 세포 (ATCC No. CRL-2076)를 65 mm 배양접시에 1.2×10⁶ cell/ml의 농도로 5 ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 발효홍삼 추출물을 세포에 사멸을 일으키지 않는 농도 (10, 50, 100 μg/ml)로 처리하고, 다시 과산화수소(H₂O₂) 0, 1.25, 2.5, 5.0, 10 mM로 각각 처리한 후, 24시간 동안 정상조건 하에서 배양하면서 세포 회복을 평가하였다. 이하 세포 생존율 회복에 대한 평가는 술포로다민 B 어세이(Sulforhodamine B assay; 이하 "SRB 어세이")를 변형하여 평가하였다.

즉, 24시간 동안 배양된 세포를 회수하여 96웰 플레이트에 2×10⁴개의 세포를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 각 웰에 50 ml의 50% 트리클로로아세트산 (TCA)를 넣고 4℃에서 1시간 동안 단백질을 첨전시키고 세척한 다음 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 각각의 웰에 0.4% SRB (1% 아세트산 용액) 용액 200 ml을 넣고 상온에서 30분간 염색시켰다. 염색된 세포의 세척과 건조과정을 거처 각 웰에 10 mM Tris-Cl (pH 10.5)를 200 ml씩 넣고 5분간 잘 흔들어 염색된 단백질을 물에 용해시킨 후 ELISA 측정기로 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시험 결과, 발효홍삼 추출물을 처리하였을 때 과산화수소 (H₂O₂)로 처리된 세포의 사멸을 막아 세포의 생존율에 대한 회복 효과를 나타내었으며, 아스코르빅산 50 μg/ml을 처리한 세포보다 우수한 세포 회복 효과를 나타내었다. 이와 같은 결과는 발효홍삼 추출물이 피부에서 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 세포막 산화 작용을 강력하게 억제함으로써 세포사멸에 대한 방어 효과가 우수하다는 것을 증명하는 것이다.

제조예 1. 화장수의 제조

장수 유전자 SIRT3의 발현을 증가시키는 발효홍삼을 함유한 화장료 중 화장수 (스킨로션)의 제조예는 다음과 같다.

번호	원료	제형예 1	비교 제형예 1
1	발효홍삼 추출물	5.0	-
2	글리세린	3.0	3.0
3	부틸렌 글리콜	2.0	2.0
4	프로필렌 글리콜	2.0	2.0
5	폴리옥시에틸렌(60) 경화 피마자유	1.0	1.0
6	에탄올	10.0	10.0
7	트리에탄올아민	0.1	0.1
8	방부제	미량	미량
9	색소	미량	미량
10	향료	미량	미량
11	정제수	잔량	잔량

<제조방법>

제형예 1: 11번에 2, 3, 4, 8번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5번을 60℃ 정도 가열하여 용해시킨 후 10번을 투입 교반하여 11번에 투입한다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.

비교제형예 1: 11번에 2, 3, 4, 8번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5번을 60℃ 정도 가열하여 용해시킨 후 10번을 투입 교반하여 11번에 투입한다. 마지막으로 6, 7, 9번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 숙성시킨다.

제조예 2. 영양로숀의 제조

장수 유전자 SIRT3의 발현을 증가시키는 발효홍삼을 함유한 영양로숀의 제조예는 다음과 같다.

번호	원료	제형예 2	비교 제형예 2
1	발효홍삼 추출물	5.0	-
2	밀납	1.0	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
4	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
5	유동 파라핀	5.0	5.0
6	스쿠알란	5.0	5.0
7	소르비탄 스테아레이트	1.0	1.0
8	글리세릴 스테아레이트/ 피이지-400 스테아레이트	1.0	1.0
9	친유성 모노스테아린산 글리세린	0.5	0.5
10	스테아린산	1.5	1.5
11	부틸렌글리콜	5.0	5.0
12	프로필렌글리콜	5.0	5.0
13	카르복시비닐폴리머	0.1	0.1
14	트리에탄올아민	0.2	0.2
15	방부제	미량	미량
16	색소	미량	미량
17	향료	미량	미량
18	정제수	잔량	잔량

<제조방법>

제형예 2: 11, 12, 13, 15, 18번을 혼합교반하면서 80?85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14번을 80?85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 35℃에 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

비교제형예 2: 11, 12, 13, 15, 18을 혼합교반하면서 80?85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14번을 80?85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

제조예 3. 영양크림의 제조

장수 유전자 SIRT3의 발현을 증가시키는 발효홍삼을 함유한 영양크림의 제조예는 다음과 같다.

번호	원료	제형예 3	비교 제형예 3
1	발효홍삼 추출물	5.0	-
2	밀납	5.0	5.0
3	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
4	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
5	유동 파라핀	10.0	10.0
6	스쿠알란	10.0	5.0
7	소르비탄 스테아레이트	1.0	5.0
8	글리세릴 스테아레이트/ 피이지-400 스테아레이트	1.0	5.0
9	친유성 모노스테아린산 글리세린	0.5	0.5
10	스테아린산	1.5	1.5
11	부틸렌글리콜	5.0	3.0
12	프로필렌글리콜	5.0	3.0
13	트리에탄올아민	0.2	0.2
14	방부제	미량	미량
15	색소	미량	미량
16	향료	미량	미량
17	정제수	잔량	잔량

<제조방법>

제형예 3: 11, 12, 14, 17번을 혼합교반하면서 80?85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13번을 80?85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 35℃까지 냉각되면 1번을 투입한다. 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

비교제형예 3: 11, 12, 14, 17번을 혼합교반하면서 80?85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13번을 80?85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

제조예 4. 맛사지 크림의 제조

장수 유전자 SIRT3의 발현을 증가시키는 발효홍삼을 함유한 맛사지 크림의 제조예는 다음과 같다.

번호	원료	제형예 4	비교 제형예 4
1	발효홍삼 추출물	5.0	-
2	밀납	10.0	10.0
3	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
4	솔비탄세스퀴올레이트	0.8	0.8
5	유동 파라핀	40.0	40.0
6	스쿠알란	5.0	5.0
7	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0
8	카르복시 비닐폴리머	0.2	0.2
9	글리세린	5.0	5.0
10	부틸렌글리콜	3.0	3.0
11	프로필렌글리콜	3.0	3.0
12	트리에탄올아민	0.2	0.2
13	방부제	미량	미량
14	색소	미량	미량
15	향료	미량	미량
16	정제수	잔량	잔량

<제조방법>

제형예 4: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16번을 혼합교반하면서 80?85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7번을 80?85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 35℃까지 냉각되면 1번을 투입한다. 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

비교제형예 4: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16번을 혼합교반하면서 80?85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작동시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7번을 80?85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

제조예 5. 영양 에센스의 제조

장수 유전자 SIRT3의 발현을 증가시키는 발효홍삼을 함유한 영양 에센스의 제조예는 다음과 같다.

번호	원료	제형예 5	비교 제형예 5
1	발효홍삼 추출물	5.0	-
2	시토 스테롤	1.7	1.7
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.5	1.5
4	세라마이드	0.7	0.7
5	세테아레스-4	1.2	1.2
6	콜레스테롤	1.5	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4	0.4
8	농글리세린	5.0	5.0
9	선플라워오일	15.0	15.0
10	카르복실비닐폴리머	0.2	0.2
11	산탄검	0.2	0.2
12	방부제	미량	미량
13	향료	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량

<제조방법>

제형예 5: 원료물질 2, 3, 4, 5 및 6번을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 7, 8 및 14번을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9번을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 10, 11, 12, 13번을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

비교제형예 5: 원료물질 2, 3, 4, 5 및 6번을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 7, 8 및 14번을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9번를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 10, 11, 12, 13번을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

Claims (9)

1. 발효홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부세포 사멸방지용 화장료 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 발효홍삼 추출물은 홍삼 추출물에 유산균을 접종하여 발효시킨 후 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger) 및 트리코더마 리세이(Tricoderma reesei)를 접종, 배양하여 수득된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 발효홍삼 추출물은 피부세포에서 SIRT3 (Silent Information Regulator 2-related protein type 3) 발현을 증가시킴으로써 세포사멸 방지 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 발효홍삼 추출물은 피부세포에서 자외선에 의해 유발되는 DNA 손상 억제 및 활성산소에 의한 세포막 산화작용 억제를 통해 세포사멸 방지 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 발효홍삼 추출물은 화장료 조성물에 0.0001 내지 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림 및 영양 에센스로 구성된 군에서 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
8. 하기 단계들을 포함하는 발효홍삼 추출물의 제조방법:
   a) 홍삼으로부터 추출용매를 이용하여 홍삼 추출물을 얻는 단계;
   b) 상기 홍삼 추출물에 락토바실러스 퍼멘텀을 접종하여 30 내지 37 ℃에서 3 내지 4일간 발효하는 단계;
   c) 상기 발효액에 아스페르길루스 니가 및 트리코더마 리세이를 각각 접종하여 25 내지 30℃에서 3 내지 4일간 배양하는 단계; 및
   d) 상기 배양액을 숙성, 열처리 및 여과하여 발효홍삼 추출물을 얻는 단계.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 추출용매는 물, 에탄올, 메탄올, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 에틸아세테이트로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

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