WO2015069086A1 - 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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panaxol
ginseng
ginsenoside
ethyl acetate
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오원근
김진웅
성상현
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of diseases treated with sirtuins activation containing ginsenoside fraction or ginsenoside isolated therefrom.
  • ginseng extract obtained by extracting and concentrating ginseng with water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform, or a mixed solvent thereof is suspended in water, and then hexane, ethyl acetate, And a ginseng fraction obtained by adding a solvent selected from the group consisting of butanol, or a composition for preventing or treating a disease treated by sirtuin activation containing ginsenosides separated therefrom.
  • Aging involves the alteration of biological components such as genes, proteins, lipids and the like.
  • aging is a phenomenon in which the biochemical and biological functions of the biological components are changed by interaction with various physicochemical environmental factors.
  • aging is a complex and comprehensive life phenomenon in which various life phenomena such as individual development, cell division, cell death and differentiation progress together.
  • aging has been reported to involve changes in extracellular epilepsy and cell membrane receptors (Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 240 (12), 996-1002, 2002). .
  • aging is an irreversible reaction, and there was a common belief that once aging progresses, it cannot be returned to a young state, but recent research has shown that aging cells can be returned to a young state. Suggests. As an example of this, when the caveolae structure with increased expression in senescent cells is removed, cell proliferation is restored (J. Biol. Chem., 278 (30), 27789-27795, 2003) and young cells It has been reported that when the old cells were cultured in the extracellular matrix in which the young cells were cultured, the morphology of the cells was converted to a young state (J. Biol. Chem., 279 (40). ), 42270-42278, 2004).
  • Sirtuins a protein called sirtuins
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide +
  • Sirtuin 1--7 seven sirtuin proteins, of which Sirtuin 1 is present in the nucleus and metabolism, apoptosis, and cell survival as substrates of several proteins.
  • the activation of sirtuin may be used to treat aging, for example, resveratrol (known to activate sirtuin protein) is administered to yeast, fruit flies, and C. elegans . If so, it has been reported to extend lifespan by up to 59% (Nature, 425 (6954), 191-196, 2003).
  • resveratrol known to activate sirtuin protein
  • the resveratrol-administered group has been shown to have a life-long effect and significantly increased activity. That is, the mice ingesting resveratrol were confirmed to have improved their muscle ability compared to the control group by strengthening their muscles and doubling the distance.
  • sirtuin is involved in the regulation of lifespan and stress.
  • US Patent No. 8217217 discloses that resveratrol is capable of controlling weight by controlling sirtuin.
  • US Patent No. 8017634 discloses that a sirtuin regulating compound may be used for insulin resistance or metabolic diseases such as diabetes.
  • US Patent Publication No. 2006-0229265 discloses that a sirtuin activating compound may be associated with aging, stress, diabetes, obesity, degenerative brain disease, heart disease, blood clotting, inflammation, and cancer. It is disclosed that it can be used as a therapeutic agent.
  • sirtuin activators significantly increase muscle development. It has been reported that it is possible to improve the quality of life by significantly reducing the adult diseases associated with diabetes, heart disease, fatty liver and the like, sirtuin protein is emerging as an important gene associated with aging inhibition and healthy life.
  • diseases related to abnormal action of mitochondria include metabolic diseases including disorders of nerve tissues and muscle tissues and diabetes mellitus, which are also associated with aging.
  • other mitochondrial related diseases include one or more of neuropsychiatric diseases, visceral diseases, endocrine system diseases, sensory system diseases, joint diseases and muscle diseases caused by reduced mitochondrial activity.
  • neuropsychiatric disorders include, but are not limited to, one or more of dementia, Parkinson's disease, stroke, neuropsychiatric disorders, autism, mental retardation, seizure, stroke-like seizures, migraine and nerve pain.
  • the visceral disorders include one or more of liver failure, intestinal pseudo-obstruction, irritable bowel syndrome, gastroesophageal reflux disease, constipation, diarrhea, renal tubular acidosis, and fanconi syndrome. Including but not limited to.
  • the endocrine disorders include, but are not limited to, one or more of pancreatic exocrine dysfunction, hypothyroidism, hypothyroidism, hypogonadism, delayed development, type 2 diabetes and hypoglycemia It is not.
  • the sensory diseases include, but are not limited to, optic nerve atrophy, strabismus, retinal pigmentosa, blindness and hearing loss.
  • the joint disease includes, but is not limited to, one or more of degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, and osteoarthritis.
  • the muscle diseases include ataxia, dysarthria, dysphagia, spasticity, cerebral myopathy, myalgia, muscular dystrophy, muscle cramps, ptosis, eye muscle paralysis, progressive external muscle paralysis, lever optic nerve It includes, but is not limited to, one or more of Leber's hereditary optic neuropathy, respiratory disorders, reflex decline and autonomic ataxia.
  • Ginseng (P anax ginseng CA Meyer) is an arboraceae plant whose roots are mainly used as medicinal parts, and the root roots are removed and dried or the whole plant is used.
  • white ginseng ( ⁇ ⁇ : raw), red ginseng ( ⁇ ⁇ : steamed), misam ( ⁇ ⁇ : thin root) is used according to the medicinal benefits, and in the private sector, wild ginseng is also divided into camphor and wild ginseng.
  • Wonsam cultivated ginseng
  • red ginseng and wild ginseng wild ginseng
  • This drug has a peculiar smell, tastes sweet and slightly bitter, and is slightly warm in nature. It is used for refreshing, physical weakness, boredom, fatigue, anorexia, vomiting and diarrhea. It helps pulmonary function. It is known to enhance new features.
  • the inventors of the present invention ginsenosides or ginsenosides derived from the fractions by activating the sirtuin enzyme, various diseases associated with the abnormal action of aging, diabetes, neurodegenerative diseases, or mitochondria, that is, increase in cell life and The present invention was completed by confirming that there is an effect of preventing or treating a related disease.
  • Prior patents related to sirtuin activity include "composition comprising wild mulberry extract (Korean Patent No. 826209)", “thiazolopyridine sirtuin modulating compound (Korean Patent Publication No. 2011-0110194)", " Phthalazinone and related analogs as sirtuin modulators (Korean Patent No. 2011-0102468), “Isoindolinone and related analogs as sirtuin modulators” (Korean Patent Publication No. 2011-0098789), "Sir Pyridine, Bicyclic Pyridine and Related Analogues as Tuin Modulators (Korean Patent Publication No.
  • ginseng extract Korean Patent Publication No. 2011-0131783
  • processed at high temperature and high pressure containing various ginsenosides is known to have an anti-aging effect
  • the ginseng fraction of the present invention is different from the extraction conditions, The effect of a single ginsenoside as in the present invention is not disclosed.
  • the effect of inhibiting skin aging that inhibits the damage of keratinocytes disclosed in the above-mentioned prior art, and the effect of extending the life, inhibiting aging due to the activation of sirtuin as in the present invention is completely different.
  • ginsenoside Rg 3 has been disclosed to inhibit apoptosis of endothelial cells via the mitochondrial caspase pathway, As regards the treatment, it can be said that the invention is completely different from the present invention.
  • an object of the present invention is to suspend ginseng extract obtained by extracting and concentrating ginseng with water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform or a mixed solvent thereof in water, and then suspended in water.
  • ginseng extract obtained by extracting and concentrating ginseng with water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform or a mixed solvent thereof in water, and then suspended in water.
  • the present invention relates to Panaxol A (Panaxol A, Compound 1 ), Panaxol B (Panaxol B, Compound 2 ), Panaxol C (Panaxol C, Compound 3 ) of Formula 1, Dhammar-20 (22), 24- Diene-3 ⁇ , 6 ⁇ , 12 ⁇ -triol (Dammar-20 (22), 24-diene-3 ⁇ , 6 ⁇ , 12 ⁇ -triol, compound 4 ), and 20 ( S ) -ginsenoside Rg 3 (20 (S ) -Ginsenoside Rg 3 , Compound 5 ) relates to a composition for the prevention or treatment of diseases treated with sirtuin activation containing a ginseng fraction comprising at least one ginsenoside selected from the group consisting of.
  • the ginseng fraction is a ginseng extract obtained by extracting and concentrating ginseng with water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform or a mixed solvent thereof in water, and then suspended in water, hexane, ethyl acetate, And it may be a concentrate of the organic solvent layer obtained by adding an organic solvent selected from the group consisting of butanol. More preferably, the ginseng fraction is obtained by mixing ginseng extract obtained by extracting and concentrating ginseng with water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform or a mixed solvent thereof in water and then mixing with hexane.
  • It may be a concentrate of a hexane layer, a concentrate of an ethyl acetate layer obtained by mixing ethyl acetate with a residue from which the hexane layer is removed, or a concentrate of a butanol layer obtained by mixing butanol with a residue from which the ethyl acetate layer is removed.
  • Diseases treated with sirtuin activation include aging, muscle tissue disorders, metabolic diseases including diabetes, stroke, stroke-like seizures, dementia, Parkinson's disease, neurological disorders, neuropsychiatric disorders, autism, mental retardation, seizures, reflexes Hypofunction, autonomic ataxia, migraine, nerve pain, hepatic insufficiency, intestinal obstruction, irritable bowel syndrome, gastroesophageal reflux disease, constipation, diarrhea, renal tubuloacidosis, pancony syndrome, pancreatic exocrine dysfunction, hypothyroidism, parathyroid function Hypogonadism, hypogonadism, developmental delay, hypoglycemia, optic atrophy, strabismus, retinitis pigmentosa, blindness, hearing loss, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, ataxia, dysfunction, dysphagia, stiffness, encephalopathy, myalgia , Muscle dystrophy, muscle spasms, ptosis, eye
  • the present invention also relates to Panaxol A (Panaxol A, Compound 1 ), Panaxol B (Compound 2 ), Panaxol C (Panaxol C, Compound 3 ) of the formula 1 isolated from the ginseng fraction, Dammar 20 (22), 24-diene -3 ⁇ , 6 ⁇ , triol 12 ⁇ - (Dammar-20 (22), 24-diene-3 ⁇ , 6 ⁇ , 12 ⁇ -triol, compound 4), and, 20 (S) Ginsenoside Rg 3 (20 (S ) -Ginsenoside Rg 3 , A composition for the prophylaxis or treatment of a disease treated by sirtuin activation containing at least one ginsenoside selected from the group consisting of compound 5 ).
  • the present invention provides Panaxol A (Compound 1 ), Panaxol B (Panaxol B, Compound 2 ), Panaxol C (Panaxol C, Compound 3 ), and Dmarmar-20 ( 22), 24-diene -3 ⁇ , 6 ⁇ , triol 12 ⁇ - (Dammar-20 (22), 24-diene-3 ⁇ , 6 ⁇ , 12 ⁇ -triol, compound 4), and, 20 (S) - ginsenoside Side Rg 3 (20 (S ) -Ginsenoside Rg 3 , Provided is a health functional food for preventing or ameliorating a disease treated by sirtuin activation containing a ginseng fraction comprising at least one ginsenoside selected from the group consisting of compound 5 ).
  • the present invention provides a novel compound, Panaxol A (Compound 1 ), Panaxol B (Company 2 ), Panaxol C (Panaxol C, Compound 3 ), which has the following chemical structure separated from the ginseng fraction do.
  • At least one ginsenoside selected from the group consisting of Panaxol A (Panaxol A, Compound 1 ), Panaxol B (Panaxol B, Compound 2 ), and Panaxol C (Panaxol C, Compound 3 ) from ginseng. It is also possible to provide a method of separating the side.
  • the ginseng extract obtained by extracting and concentrating ginseng with water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform, or a mixed solvent thereof is suspended in water, and then hexane, ethyl acetate, And from the concentrate of the organic solvent layer obtained by adding an organic solvent selected from the group consisting of butanol, the panaxol A (Panaxol A, Compound 1 ), panaxol B (Panaxol B, Compound 2 ), and panaxol C ( One or more ginsenosides selected from the group consisting of Panaxol C, compound 3 ) can be separated.
  • the panaxol A Panaxol A, Compound 1
  • panaxol B Panaxol B, Compound 2
  • panaxol C One or more ginsenosides selected from the group consisting of Panaxol C, compound 3
  • the ginseng is extracted by concentrating with water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform or a mixed solvent thereof to concentrate the ginseng extract in water and then mixed with hexane to concentrate the hexane layer.
  • the panaxol A Panaxol A, One or more ginsenosides selected from the group consisting of Compound 1 ), Panaxol B (Compan 2 ), and Panaxol C (Panaxol C, Compound 3 ) can be separated.
  • the present invention extracts and fractionates ginseng with water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ethyl acetate, chloroform, or a mixed solvent thereof, and then purifying and purifying pure water using chromatography, through chemical structure and physicochemical characterization.
  • a plurality of compounds having a confirmed structure are separated, and the activity of the compositions of the present invention is confirmed by a method of determining whether the ginseng fraction and the compound represented by Formula 1 have a sirtuin activation action.
  • the process of selecting the ginseng fraction of the present invention as a sirtuin activating composition is as follows. After collecting various native plants and herbal medicines, cloning the sirtuin gene and introducing it into cells to investigate the activation of sirtuin or intracellular NAD + / NADH ratio, Panax ginseng was selected as a candidate plant. Ginseng extract and ginseng fraction are prepared, from which the sirtuin activating compound is isolated.
  • ginseng Extraction solvent in the preparation of the extract is preferably 1 to 30 times the weight of ginseng weight.
  • the concentrated ginseng extract is 0.0001 ⁇ 10g, after the suspension is prepared by mixing in 1 ⁇ 10L of water, fractions can be prepared by adding various solvents.
  • the solvent for fractionating the ginseng extract is preferably selected from hexane, ethyl acetate, butanol, the solvent for the fraction is preferably added 0.5 to 2 times the weight based on the weight of the water suspended in the ginseng extract.
  • Ginsenosides of the present invention is the extraction of ginseng extract or ginseng fraction by water, organic solvent, alcohol (methanol, ethanol, propanol, etc.) or mixed solvents thereof, organic solvent and water distribution, method by column chromatography, plant A well-known method etc. which are used for separate extraction of a component can be obtained easily or combining suitably.
  • the ginseng extract or fraction can be further purified according to the commercial method as needed. Preferably preparing ginseng extract or fraction; And purely separating and purifying the compound having a sirtuin activating effect using chromatography.
  • the chromatography used in the present invention includes silica gel column chromatography, L-20 column chromatography, ion exchange resin chromatography, thin layer chromatography. Thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography, and the like can be used.
  • Panax ginseng fraction or ginsenosides isolated therefrom act on sirtuin activation and thus are associated with abnormalities of diseases associated with increased cell life, ie aging, diabetes, neurodegenerative diseases and mitochondria It can be used as a composition for the prevention or treatment of various diseases, preferably can be used as a composition for the prevention or treatment of aging or diabetes.
  • the diabetes may be senile diabetes.
  • the ginseng fraction of the present invention or ginsenosides separated therefrom can be easily separated from ginseng and have high stability, and thus can be used as additives for food and medicine.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease treated by sirtuin activation including ginsenoside fraction or ginsenoside isolated therefrom.
  • the pharmaceutical compositions may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations contain at least one excipient such as starch in the ginseng fraction of the present invention or ginsenosides separated therefrom. , Calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the dosage of the ginseng fraction of the present invention or the pharmaceutical composition containing ginsenoside isolated therefrom is determined by the age, sex and weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration and It will depend on the prescriber's judgment. Dosage determination based on these factors is within the level of skill in the art and generally dosages range from 0.01 mg / kg / day to approximately 2000 mg / kg / day. More preferred dosage is 1 mg / kg / day to 500 mg / kg / day. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition containing the ginseng fraction of the present invention or ginsenoside isolated therefrom can be administered to mammals such as rats, livestock, humans and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections. Since the extract of the present invention has little toxicity and side effects, it is a drug that can be used safely even when taken for long periods of time.
  • the present invention provides a health functional food comprising a food acceptable acceptable food supplement additive containing ginsenoside fraction or ginsenoside separated therefrom.
  • the health functional food of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills or liquids, and the food to which the extract of the present invention can be added, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes And health functional foods.
  • the present invention provides a dietary supplement for preventing or ameliorating a disease treated by sirtuin activation, which includes a ginsenoside fraction or a foodstuff acceptable food supplement additive containing ginsenoside isolated therefrom. .
  • Panax ginseng fraction of the present invention or a composition containing ginsenosides isolated therefrom has the effect of activating the sirtuins enzyme, which is associated with an increase in cell life through action on energy metabolism. It can be usefully used for the prevention or treatment of aging, diabetes, neurodegenerative diseases or mitochondria and various diseases related to the diseases, cosmetics and foods.
  • 1A and 1B are diagrams showing the correlation between HMBC [H ⁇ C] and NOESY [H ⁇ H] of the compounds 1 to 3 (new compounds) of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming the sirtuin 1 activity of the compounds 1 to 5 of the present invention using luminescence.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of confirming the effect of the sirtuin 1 activity of compounds 1 to 5 of the present invention on the p53 using a luciferase reporter assay in HEK293 cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of confirming the activity of sirtuin 1 of compounds 1 to 5 of the present invention through the ratio of NAD + / NADH in HEK293 cells.
  • 5 is a photograph of fibroblasts stained with ⁇ -galactosidase.
  • the ginseng used in the present invention was dried and purchased in the local market of Gwangju. 100 g of the dried ginseng was extracted using an ultrasonic extractor three times for 4 hours using 1000 ml of a solvent such as distilled water, ethanol, methanol, acetone, and the like. Then, the extract which removed solid content was concentrated under reduced pressure, and each extract was obtained. Then, the separation conditions of the ginseng fraction and ginsenoside of the present invention were set through the method for confirming the activity of sirtuin 1 disclosed in Example 4.
  • a solvent such as distilled water, ethanol, methanol, acetone, and the like.
  • each of the ginseng extracts was suspended in water (2 L) and then concentrated in a hexane layer obtained by mixing with hexane (2 L), and the ethyl acetate layer obtained by mixing ethyl acetate (2 L) with the residue from which the hexane layer was removed.
  • the dried ginseng (206 g) was obtained by dipping the ginseng extract in a 90% ethanol solution for 1 week at room temperature, and the extract was concentrated under reduced pressure to obtain a ginseng extract (19.6 g).
  • the ginseng extract was suspended in 2 L of water, and then concentrated under reduced pressure of the hexane layer obtained by mixing with hexane (2 L) and ethyl acetate (2 L) obtained by mixing ethyl acetate (2 L) with the residue (water layer) from which the hexane layer was removed.
  • the reduced pressure concentrate and the reduced pressure concentrate of the butanol layer obtained by mixing butanol (2 L) with the residue (water layer) from which the ethyl acetate layer was removed were used as the fractions under each condition.
  • ginsenosides were separated from the ginseng butanol fraction (7.2 g). After separating and purifying the active substance, butanol fraction (6.5 g) was subjected to silica gel column chromatography (3 ⁇ 50 cm; 63-200 mm particle size) in EtOAc / MeOH (10: 0 to 0: 1). And divided into seven subfractions (F1-F7).
  • the small fraction F1 (503 mg) was subjected to four small fractions using RP-18 column chromatography (1 ⁇ 30 cm; 40-63 mm particle size) of MeOH / H 2 O (1/3 ⁇ 1/0). Divided by (F1.1-F1.4). Subfraction F1.3 (103 mg) was subjected to RP-18 column chromatography (1 ⁇ 30 cm; 40-63 mm particle size) of MeOH / H 2 O (1/2 ⁇ 1/1) to give 6 fractions. Divided by (F1.4.1-F1.4.6).
  • Small fraction F1.4.5 (20 mg) was subjected to RP-18 column chromatography (1 ⁇ 30 cm; 40-63 mm particle size) using solvent conditions of MeOH / H 2 O (1/2 ⁇ 1/0). Compound 1 (2.0 mg) was obtained. Small fraction F1.4.6 (19mg) to MeOH / H 2 O (1/2 ⁇ 1/0) of the RP-18 column chromatography using a (1 ⁇ 30cm 40-63mm particle size) of the compound 4 ( 3.1 mg) was isolated. Small fraction F3 (701 mg) was divided into seven small fractions by silica gel column chromatography (1 ⁇ 30 cm; 63-200 mm particle size) of CHCl 3 / MeOH (40: 0 ⁇ 0: 1). .1-F3.7).
  • HMQC heteronuclear multiple-quantum coherence
  • NMR Heteronuclear multiple-bond coherence
  • DEPT distortionless enhancement by polarization
  • Compound 1 was isolated as a brown powder, the molecular formula was determined from the [M + Na] + (calcd for C 30 H 48 O 4 Na, 495.3450) from the measured value of HRFABMS as C 30 H 48 O 4 495.3457. Compound 1 was able to confirm strong IR absorption values at ⁇ max OH (3397 cm ⁇ 1 ), C ⁇ O (1722, 1705 cm ⁇ 1 ), and C ⁇ C (1654 cm ⁇ 1 ).
  • the compound 1 is 6 ⁇ , 20 ( S ) -dihydroxydammar-3,12-dione-24-ene (6 ⁇ , 20 ( S ) -dihydroxydammar-3,12-dione-24-ene) It was named Panaxol A having a structure.
  • Compound 2 was determined from was isolated as a brown powder, its molecular formula is C 30 H 48 O 5 to the [M + Na] + of at measure of 511.3409 HRFABMS (calcd for C 30 H 48 O 5 Na, 511.3399) .
  • Compound 2 was able to confirm strong IR absorption values at ⁇ max OH (3362 cm ⁇ 1 ), C ⁇ O (1721, 1700 cm ⁇ 1 ), and C ⁇ C (1637 cm ⁇ 1 ).
  • 1 H and 13 C NMR analysis of the compound 2 was confirmed that a side which is a substituent hydroxy group in C-3 and C-12 single two ketone groups and C-6 of the compound [1] is connected similarly.
  • Compound 2 is 3,12- dione -6 ⁇ , 20 (S), 24- trihydroxy wall Mar -25- yen (3,12-dione-6 ⁇ , 20 (S), 24-trihydroxydammar-25-ene Panaxol B having a structure of).
  • Compound 3 was determined from was isolated as a brown powder, its molecular formula is C 30 H 48 O 5 to the [M + Na] + of at measure of 511.3346 HRFABMS (calcd for C 30 H 48 O 5 Na, 511.3399) .
  • Compound 3 was able to confirm strong IR absorption values at ⁇ max OH (3361 cm ⁇ 1 ) and C ⁇ O (1715, 1700 cm ⁇ 1 ).
  • Compound 3 13 C NMR analysis results ⁇ C 46.0 (C-22) in a chemical shift value of the chemical shift of the compound 3 Compound 2, 123.2 (C-23) , 143.3 (C-24), 70.2 (C- 25), 31.3 (C-26), and 31.2 (C-27).
  • compound 3 is 3,12- dione -6 ⁇ , 20 (S), 25- trihydroxy wall Mar -23- yen (3,12-dione-6 ⁇ , 20 (S), 25-trihydroxydammar-23-ene Panaxol C having a structure of).
  • Sirtuin 1 is a protein that deacetylates the K382 portion of p53. This deacetylation activates p53-related transcription and ultimately counteracts apoptosis due to cellular aging, DNA damage and stress. It is known. Therefore, the degree of sirtuin 1 enzyme activation of the compounds 1 to 5 of the present invention was measured using the sirtuin enzyme directly.
  • Sirtuin 1 reaction solution 500mM Tris / Cl pH 8.0, 100mM MgCl 2 , 1.37M NaCl, 270mM KCl, 100mg / ml BSA
  • compound 1 ⁇ 5 of the present invention 10 ⁇ 20 ⁇ g / ml
  • a biomolecular 2X substrate mixture was added to the reaction solution.
  • the sample is centrifuged and reacted with developer II mixture.
  • SIRT1 assay buffer sirtuin 1 assay buffer
  • protein activity was measured at 360/450 nm, and the results are shown in FIG. 2.
  • the control group was treated with the same volume (within 0.1% of cell culture) only DMSO, the solvent of the compound.
  • the compounds 1 to 5 of the present invention increase the activity of the sirtuin 1 enzyme in a concentration-dependent manner, in particular, it is confirmed that the sirtuin activation function of the compound 4 is remarkably excellent.
  • the activity of p53 was confirmed intracellularly using the report that the activity of p53 is decreased when sirtuin 1 activity (deacetylase activity) increases in the cell (Molecular Cell, 28, 277-290, 2007). That is, a method of predicting the activity of sirtuin 1 was used by measuring the activity of p53 using luciferase transfection.
  • HEK293 cells were cultured at about 70% saturation and washed with PBS. After treatment with 0.25% trypsin (trypsin) for 1 minute at room temperature, DMEM was added to collect the cells, centrifuged for 5 minutes at 2,500rpm to remove the supernatant to obtain a cell precipitate. The cells were then mixed well with DMEM medium. Next, 3 ⁇ l of lipopectAMINE (life Technologies, Inc) was added to 100 ⁇ l of serum-free media (serum free media, DMEM), slowly mixed, and left at room temperature for 15 minutes, followed by 3.0 ⁇ g of p53-Luc (p53-Lucifer).
  • trypsin trypsin
  • Lyase vector 3.0 ⁇ g of pCMV- ⁇ -galactosidase (plasmid with ⁇ -galactosidase gene as a standard for constant transfection efficiency), 0.2 ⁇ g of sirtuin 1 (SIRT1), 0.3 ⁇ g
  • SIRT1 sirtuin 1
  • LipopectAMINE a mixture of each vector (or DNA-plasmid), and HEK293 cells were slowly mixed, incubated at room temperature for 20 minutes in suspension, aliquoted in a 60 mm culture vessel, and incubated in a CO 2 incubator for 24 hours. Thereafter, each of the compounds 1 to 5 were added to the concentrations indicated in FIG. 3 the next day, and then incubated for another 24 hours. Next, the cultured HEK293 cells were washed twice with PBS, 500 ⁇ l of extract solution was added to each culture vessel, and the cells were disrupted and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. The supernatant (cell extract) obtained at this time was used to measure the activity of luciferase and ⁇ -galactosidase.
  • Luciferase activity was obtained from supernatant (cell extract) extracted from 100 ⁇ l of cells, 100 ⁇ l of 20 nM D-luciferin and 300 ⁇ l of reaction solution (20 mM glycin, 12.5 mM MgSO 4 , 3 mM EGTA, 15 mM potassium phosphate, 1 mM DTT). , 1 mM ATP) was measured by a luminometer. Luciferase activity was corrected by measuring ⁇ -galatosidase activity to correct gene injection efficiency.
  • the activity of ⁇ -galactosidase was determined using 30 ⁇ l of cell extract, 66 ⁇ l of ONPT (4 mg / ml), and 204 ⁇ l of reaction solution (0.1 M sodium phosphate, 1 mM MgCl 2 , 45 mM ⁇ -mercaptoethanol, pH 7.5). After the reaction in a 37 °C thermostat, the absorbance was measured by a spectrophotometer.
  • Fig. 3 shows the luciferase activity of p53.
  • p53 p53-luc
  • p53 activity increased and p53 (p53-luc) and sirtuin 1 (SIRT1) were simultaneously transfected. It can be seen that the transcriptional activity of p53 decreases when specified, and that sirtuin 1 inhibits the activity of p53.
  • the resveratrol treatment of the sirtuin 1 activating material can be confirmed that the activity of p53 is further reduced, Compounds 1 to 5 can be seen to further reduce the activity of p53 in the cell as well. Therefore, through the above results, it can be seen that the compounds 1 to 5 have an effect of increasing the sirtuin 1 enzyme activity.
  • CYR-to-1 enzyme has been known as a kind of '+ NAD-dependent histone energy is activated when the run out state on the cell deacetylase (NAD + dependant histone deacetylase)' . Therefore, if the NAD + / NADH ratio is measured after the compound treatment in the cell, the degree of sirtuin 1 activation in the cell can be confirmed.
  • HEK293 cells After culture for HEK293 cells with 70% saturated compounds 1 ⁇ 5 (2.5 ⁇ 20 ⁇ g / ml) or resveratrol of 4.6 ⁇ g / ml (20 ⁇ M) was added (molecular weight 228, positive control) and incubated again for 12 hours . Then, HEK293 cell line was collected cells using PBS, and the supernatant was removed by centrifugation at 8,000 rpm for 5 minutes. The HEK293T cell line was collected using AAT Bioquest's NAD + / NADH Lysis Buffer (AAT Bioquesr Cat. 15263) to obtain cell extracts, and the NAD + / NADH ratio was increased using AAT Bioquest's NAD + / NADH Quantitation kit. The results are shown in Figure 4 (Result 2 means that the NAD + content is increased by 2 times).
  • compounds 4 and 5 strongly increased the NAD + / NADH ratio at the treatment concentration of 2.5 ⁇ 5 ⁇ g / ml, especially compound 4 is a compound with excellent life extension effect by increasing the NAD + / NADH ratio do.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Differences in constituent molecular species include young cells with a population doubling of 20 or less (passage 8, p8, passage 8) and aged cells (passage 35, p35, passage 35).
  • Senescent cells are characterized by morphological changes, increased ⁇ -galactosidase activity, and decreased rates of cell division.
  • the cells were grown in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) for 1-2 days to fill 60-70% of the cells, followed by 2 days in 0.1% bovine serum albumin (BSA) or serum-deficient media for serum-starvation. After activating the cells to cause G 1 arrest (G 1 arrest), experiments were performed to identify senescent cells (Biochem Biophys Res Commun., 302 (4), 778-784, 2003). The change of ⁇ -galactosidase in senescent cells after compound treatment was measured using Cell Signaling's staining kit (Senescence ⁇ -Galactosidase Staining Kit, # 9860).
  • BSA bovine serum albumin
  • Human fibroblasts (HDF) used in the experiment were prepared with young cells (7 passaged cells) and aging cells (35 passages), respectively, and aliquoted in 6-well plates and incubated for 48 hours in a CO 2 incubator. . Thereafter, Compound 4 was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a 1 M stock solution, and the concentration of the cell culture medium was adjusted according to the volume of the cell culture medium (DMSO 0.1% or less). In aging cell cultures, cells were stabilized by treatment with serum free media for 1 day before compound 4 was treated. After treatment with Compound 4 in the cells with a micropipette, morphological changes after 12 hours were observed through the ⁇ -galactosidase staining results.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ⁇ -galactosidase staining method is as follows. Human fibroblasts treated with the compound in the senescent cells were compared with the method of staining the senescent cells and young cells not treated with the compound as a positive control. Each human fibroblast was washed twice with PBS, 1 ml of a 1x fixative solution in a staining kit was added to each well, and left at room temperature for 15 minutes. Thereafter, each cell was washed twice with PBS again, and each well was added with 1 ml of ⁇ -galactosidase staining solution in the staining kit, and left for 12 hours for staining. The morphological changes were observed through the ⁇ -galactosidase stained results. The results obtained after treating Compound 4 of the present invention at a concentration of 5 ⁇ g / ml are shown in FIG. 5.
  • Example 8-2 Long-term and tissue toxicity experiments in experimental and control groups
  • Compound 4 (200 g) of the present invention was mixed with 175.9 g lactose, 180 g potato starch and 32 g colloidal silicic acid. 10% gelatin solution was added to the mixture, which was then ground and passed through a 14 mesh sieve. It was dried and the mixture obtained by adding 160 g of potato starch, 50 g of talc and 5 g of magnesium stearate was made into a tablet.
  • Compound 4 (1 g), 0.6 g sodium chloride and 0.1 g ascorbic acid of the present invention were dissolved in distilled water to make 100 ml. The solution was bottled and sterilized by heating at 20 ° C. for 30 minutes.
  • Butanol fraction of the ginseng 90% ethanol aqueous solution extract of the present invention was added to the cooking seasoning by 1% by weight to prepare a cooking seasoning for health promotion.
  • Butanol fraction of the ginseng 90% ethanol aqueous solution extract of the present invention was added to the flour in 0.1% by weight, and using this mixture to prepare bread, cake, cookies, crackers and noodles to prepare a health-promoting food.
  • Butanol fraction of the ginseng 90% ethanol aqueous solution extract of the present invention was added to the soup and gravy 0.1% by weight to prepare a soup for health promotion and gravy.
  • Butanol fraction of the ginseng 90% ethanol aqueous solution extract of the present invention was added to the milk at 0.1% by weight, and the milk was used to prepare various dairy products such as butter and ice cream.
  • Butanol fraction of the ginseng 90% ethanol aqueous solution extract of the present invention was added to 1,000 ml of tomato juice or carrot juice to prepare a vegetable juice for health promotion.

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Abstract

본 발명의 인삼(Panax ginseng) 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 조성물은 시르투인(sirtuins) 효소를 활성화하는 효과가 있어, 에너지 대사과정에 대한 작용을 통하여 세포수명의 증가와 관련되는 질환인 노화, 당뇨병, 신경퇴행성 질환이나 미토콘드리아와 관련 각종 질환의 예방 또는 치료용 의약품, 화장품 및 식품 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인(sirtuins) 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인구 노령화는 세계적으로 큰 사회적 이슈 중의 하나이다. 미국과 일본의 경우, 65세 이상의 노인 인구는 현재 각각 13%, 16%에 달하며 25년 후에는 24%, 32%에 달할 것으로 예상되고 있다. 일본에서도, 현재 일본의 장수관련 산업의 규모가 39조엔인데, 20년 후에는 155조엔 정도까지 성장할 것이라고 예상하고 있다(2000년 일본 통산성 산업구조조정 심의의원회 "21세기 경제 산업 정책 비전 보고서"). 한국의 경우에도 2010년 기준으로 전체 11.0%인 노인인구가 2030년에는 24.3%에 달할 것으로 예상되기에, 이에 대한 시급한 대책마련이 필요한 상황이다.
노화는 유전자, 단백질, 지질 등의 생체 구성성분의 변화를 수반한다. 즉, 노화는 다양한 물리화학적 환경 요인과의 상호 작용에 의해 상기 생체 구성성분의 생화학적 및 생물학적 기능이 변화하는 현상이다. 또한, 노화는 개체의 발생, 세포 분열, 세포 사멸 및 분화 등의 다양한 생명 현상의 변화가 함께 진행되는 복잡하고 종합적인 생명현상이다. 이에 대해, 노화 현상이 세포외 간질 및 세포막 수용체(cell membrane receptor)의 변화를 수반하는 현상이라고 보고되기도 하였다(Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 240(12), 996-1002, 2002).
한편, 노화는 비가역적인(irreversible) 반응이기에, 일단 노화가 진행이 되면 이를 어린(young) 상태로 되돌릴 수 없다는 통념이 있었으나, 최근의 연구 결과는, 노화가 일어난 세포를 어린 상태로 되돌릴 수 있음을 시사하고 있다. 이에 대한 예로서, 노화 세포에서 발현이 증가하는 카베올래(caveolae) 구조를 제거하였을 경우, 세포증식이 회복되고(J. Biol. Chem., 278(30), 27789-27795, 2003), 어린 세포(young cell)를 배양했던 세포간질(extracellular matrix)에서 노화 세포(old cell)를 배양하였을 경우, 세포의 형태가 어린 상태로 전환된다는 것이 보고된 바 있다(J. Biol. Chem., 279(40), 42270-42278, 2004).
노화와 관련된 가장 중요한 기관 중의 하나는 미토콘드리아인데, 노화 관련 기전이 에너지 대사를 조절하는 기전과 관련이 있기 때문이다. 미토콘드리아는 노화를 억제하기 위해 시르투인(sirtuins, SIRTs)이라는 단백질의 발현을 조절하여 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide+)의 함량을 일정하게 유지하는 역할을 한다. 포유동물 세포에는 7개의 시르투인 단백질들이 있다고 보고되어 있으며(시르투인1 내지 7), 그 중 시르투인1은 핵 내에 존재하면서 여러 단백질들을 기질로 하여 대사와 아폽토시스(apoptosis), 세포 생존(cell survival) 등의 생명현상을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 특히, 아폽토시스를 조절하는 p53, 세포 생존을 관장하는 FOXO(Forkhead box), 글루코스 항상성(glucose hemeostasis)을 조절하는 PGC-1α(peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha), 전사조절인자인 p300 등에서 아세틸(acetyl)기를 제거하여 이들 단백질의 활성을 조절한다고 보고되어 있다(PLoS One., 4(10), e7350, 2008).
또한, 시르투인의 활성화 작용이 노화 치료에 사용될 수 있다는 예로서, 레스베라트롤(resveratrol, 시르투인 단백질을 활성화하는 것으로 알려짐)을 효모(yeast), 초파리, 예쁜꼬마선충(C. elegans) 등에 투여하였을 경우, 수명이 최고 59%까지 연장된 사실이 보고된 바 있다(Nature, 425(6954), 191-196, 2003). 이 외에도, 레스베라트롤을 마우스에 투여한 결과, 레스베라트롤 투여군에서 수명연장 효과가 나타나고, 활동능력이 월등히 증가되는 것으로 관찰된 바 있다. 즉, 레스베라트롤을 섭취한 마우스는 대조군에 비해 근육이 튼튼해지고 2배나 더 먼 거리를 달렸을 정도로 운동능력이 향상된 것으로 확인되었다. 또한, 미국등록특허 제7977049호와 미국등록특허 제7544497호에는 수명과 스트레스의 조절에 시르투인이 관여됨이 개시되어 있다. 이 외에도, 미국등록특허 제8242171호에는 레스베라트롤이 시르투인을 조절하여 체중조절이 가능함이 개시되어 있으며, 미국등록특허 제8017634호에는 시르투인 조절 화합물이 당뇨병과 같은 인슐린 저항성 질환이나 대사질환의 치료에 이용될 수 있음이 개시되어 있으며, 미국공개특허 제2006-0229265호에는 시르투인 활성화 화합물이 노화, 스트레스, 당뇨, 비만, 퇴행성 뇌질환, 심장질환, 혈액응고와 관련된 질환, 염증, 암 등의 치료제로 사용될 수 있음이 개시되어 있다.
노화를 억제하는 것보다 더 중요한 것은, 노인성 질환의 감소와 관련된 삶의 질 문제로서(Cell, 127(6), 1109-1122, 2006), 이처럼, 시르투인 활성화 물질들이 근육의 발생을 현저히 증가시키고, 당뇨병, 심장병, 지방간 등과 관련된 성인병들을 현저히 감소시켜 삶의 질을 향상시킬 수 있다는 것이 보고된 바 있어, 시르투인 단백질이 노화 억제 및 건강한 삶과 관련된 중요한 유전자로 부각되고 있다.
한편, 미토콘드리아의 비정상적인 작용과 관련된 질환으로는, 신경 조직과 근육 조직의 장애 및 당뇨병을 포함하는 대사 질환이 있으며, 이는 노화와도 관련이 있다. 또한, 이 외의 미토콘드리아 관련 질환은 미토콘드리아 활성 저하로 야기되는 신경 정신 질환, 내장 질환, 내분비계 질환, 감각계 질환, 관절 질환 및 근육 질환 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 신경 정신질환은 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 신경정신장애, 자폐증, 정신 지체, 발작(seizure), 뇌졸중 유사 발작, 편두통 및 신경 통증 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 내장 질환은 간부전, 장 간폐색증(intestinal pseudo-obstruction), 과민성 장 증후군, 위식도역류질환, 변비, 설사, 신세뇨관성산증(renal tubular acidosis) 및 판코니 증후군(fanconi syndrome) 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 내분비계 질환은 췌장 외분비 기능부족증, 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism), 부갑상선 기능 저하증(hypoparathyroidism), 생식 기능 저하증(hypogonadism), 발달 지연, 제2형 당뇨 및 저혈당 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 감각계 질환은 시신경위축, 사시, 망막색소변성증, 실명 및 청력 손실 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 관절 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 및 골성관절염 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 근육 질환은 운동실조(ataxia), 구음장애(dysarthria), 연하곤란(dysphagia), 경직(spasticity), 뇌근병증, 근육통, 근이영양증, 근육 경련, 안검하수, 눈근육마비, 진행성 외안근 마비, 레버 시신경 위축증(Leber's hereditary optic neuropathy), 호흡 장애, 반사 작용 저하 및 자율신경실조증 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 두릅나무과의 식물로 뿌리를 주로 약용부위로 사용하고 있으며, 뿌리의 잔뿌리를 제거하고 말려서 사용하거나 식물 전체를 사용하고 있다. 특히 우리나라에서는 백삼(白蔘:생 것), 홍삼(紅蔘:찐 것), 미삼(尾蔘:가는 뿌리)으로 구분하여 약효에 따라 사용하며, 민간에서는 야생삼도 장뇌와 산삼으로 구별한다. 중국에서는 인삼의 뿌리와 뿌리줄기를 말하며 원삼(재배삼), 홍삼, 산삼(야생삼)으로 구별한다. 이 약은 특이한 냄새가 있으며 맛은 달고 약간 쓰며 성질은 약간 따뜻한 것으로 알려져 있으며, 원기를 보하고 신체허약, 권태, 피로, 식욕부진, 구토, 설사에 쓰이며 폐기능을 도우며 진액을 생성하고 안신작용 및 신기능을 높여 주는 것으로 알려져 있다.
한편, 본 발명자들은 인삼 분획물 또는 상기 분획물 유래의 진세노사이드들이 시르투인 효소를 활성화함으로써 노화, 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 또는 미토콘드리아의 비정상적인 작용과 관련이 있는 각종 질환, 즉, 세포수명의 증가와 관련되는 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성할 수 있었다.
시르투인 활성과 관련된 선행 특허로는 "산뽕나무 추출물을 포함하는 조성물(한국등록특허 제826209호)", "티아졸로피리딘 시르투인 조절 화합물(한국공개특허 제2011-0110194호)", "시르투인 조절제로서의 프탈라지논 및 관련 유사체(한국공개특허 제2011-0102468호)", "시르투인 조절제로서의 이소인돌리논 및 관련 유사체(한국공개특허 제2011-0098789호)", "시르투인 조절제로서의 피리딘, 비시클릭 피리딘 및 관련 유사체(한국공개특허 제2011-0079763호)", "시르투인 조절제로서의 퀴나졸리논, 퀴놀론 및 관련 유사체(한국공개특허 제2011-0065536호)", "시르투인 조절제로서의 크로메논 유사체(한국공개특허 제2011-0063573호)", "시르투인 조절제로서의 벤족사졸, 벤즈티아졸 및 관련 유사체(한국공개특허 제2011-0044291호)" 등이 있으나, 상기 특허에 개시된 화합물은 본 발명의 진세노사이드계 화합물과는 그 구조와 특성이 다르다.
또한, 각종 진세노사이드를 함유한 고온고압에서 가공된 인삼추출물(한국공개특허 제2011-0131783호)이 피부 노화 방지 효과가 있음이 알려져 있기는 하지만, 본 발명의 인삼 분획물과 추출조건이 다르며, 본 발명에서와 같은 단일 진세노사이드의 효과는 개시되어 있지 않다. 또한, 상기 선행문헌에 개시된 각질세포의 손상을 억제하는 피부노화 억제효과와, 본 발명과 같은 시르투인의 활성화에 따른 수명연장, 노화억제 등의 효과는 전혀 다른 것이라고 할 수 있다.
또한, 진세노사이드 Rg3가 미토콘드리아의 카스파아제(caspase) 경로를 통해 혈관내피세포(endothelial cell)의 세포사멸(apoptosis)을 억제함이 개시되어 있기는 하지만, 이는 혈관내피세포와 관련된 혈관질환의 치료와 관련된 것으로서 역시 본 발명과는 기술구성이 전혀 다른 발명이라고 할 수 있다.
본 발명의 목적은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3), 담마르-20(22),24-디엔-3β,6α,12β-트리올(Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol, 화합물 4), 및, 20(S)-진세노사이드 Rg3(20(S)-Ginsenoside Rg3, 화합물 5)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 포함하는 인삼 분획물을 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014010788-appb-I000001
상기 인삼 분획물은 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매를 가하여 얻은 유기용매층의 농축물일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 인삼 분획물은 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거한 잔사에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 또는, 상기 에틸아세테이트층을 제거한 잔사에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물일 수 있다.
상기 시르투인 활성화로 치료되는 질환은 노화, 근육조직장애, 당뇨병을 포함하는 대사 질환, 뇌졸중, 뇌졸중 유사 발작, 치매, 파킨슨병, 신경조직장애, 신경정신장애, 자폐증, 정신 지체, 발작, 반사 작용 저하, 자율신경실조증, 편두통, 신경 통증, 간부전, 장간폐색증, 과민성 장 증후군, 위식도역류질환, 변비, 설사, 신세뇨관성산증, 판코니 증후군, 췌장 외분비 기능부족증, 갑상선 기능 저하증, 부갑상선 기능 저하증, 생식 기능 저하증, 발달 지연, 저혈당, 시신경위축, 사시, 망막색소변성증, 실명, 청력 손실, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골성관절염, 운동실조, 구음장애, 연하곤란, 경직, 뇌근병증, 근육통, 근이영양증, 근육 경련, 안검하수, 눈근육마비, 진행성 외안근 마비, 레버 시신경 위축증 및 호흡 장애로 이루어진 질환 중에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 인삼 분획물로부터 분리된 상기 화학식 1의 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3), 담마르-20(22),24-디엔-3β,6α,12β-트리올(Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol, 화합물 4), 및, 20(S)-진세노사이드 Rg3(20(S)-Ginsenoside Rg3, 화합물 5)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 형태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3), 담마르-20(22),24-디엔-3β,6α,12β-트리올(Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol, 화합물 4), 및, 20(S)-진세노사이드 Rg3(20(S)-Ginsenoside Rg3, 화합물 5)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 포함하는 인삼 분획물을 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 인삼 분획물로부터 분리된 하기 화학구조를 갖는 신규 화합물인 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3)를 제공한다.
Figure PCTKR2014010788-appb-I000002
또한, 인삼으로부터 상기 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 및, 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 분리하는 방법도 제공할 수 있다.
바람직하게는, 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매를 가하여 얻은 유기용매층의 농축물로부터 상기 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 및, 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 분리할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 인삼 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거한 잔사에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 또는, 상기 에틸아세테이트층을 제거한 잔사에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물로부터 상기 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 및, 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 분리할 수 있다.
이하 본 발명을 자세하게 설명한다.
본 발명은 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 및 분획한 후 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리 정제하고 화학구조 및 물리화학적 특성규명을 통하여 구조를 확인한 다수의 화합물을 분리하고, 이중에서 상기 인삼 분획물 및 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 시르투인 활성화 작용이 있는지를 측정하는 방법을 통해 본 발명의 조성물들의 활성을 확인한다.
본 발명의 인삼 분획물이 시르투인 활성화 조성물로 선택된 과정은 하기와 같다. 각종 자생식물 및 한약재를 채집하여 시르투인 유전자를 클로닝한 후 세포 내로 도입하여 시르투인 활성화 작용을 조사하거나 세포내 NAD+/NADH 비율을 조사하여 인삼(Panax ginseng)을 후보식물로 선정한 후, 인삼 추출물 및 인삼 분획물을 제조하고, 이로부터 시르투인 활성화 화합물을 분리한다.
본 발명의 인삼 분획물을 제조할 때, 먼저 농축된 인삼 추출물을 제조하고, 상기 농축된 인삼 추출물에 물을 가하여 현탁물을 제조한 뒤 각종 용매로 분획하여 분획물을 제조할 수 있는데, 이 때, 인삼 추출물 제조시의 추출용매는 인삼 중량의 1~30배 중량인 것이 좋다. 또한, 농축된 인삼 추출물이 0.0001~10g일 경우를 기준으로, 1~10ℓ의 물에 혼합하여 현탁물을 제조한 후, 각종 용매를 가하여 분획물을 제조할 수 있다. 또한, 인삼 추출물을 분획하기 위한 용매는 헥산, 에틸아세테이트, 또는 부탄올에서 선택되는 것이 바람직하며, 상기 분획용 용매는 인삼 추출물을 현탁한 물의 중량을 기준으로 0.5~2배 중량을 가하는 것이 좋다.
본 발명의 진세노사이드들은 인삼 추출물 또는 인삼 분획물을 물, 유기용매, 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 등) 또는 이들의 혼합용매에 의한 추출, 유기용매와 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법 등을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 상기 인삼 추출물이나 분획물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다. 바람직하게는 인삼 추출물 또는 분획물을 제조하는 단계; 및, 크로마토그래피를 이용하여 시르투인 활성화 효과가 있는 화합물을 순수하게 분리 정제하는 단계;를 통해 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 크로마토그래피로는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 박층크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.
상기 인삼(Panax ginseng) 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드는 시르투인 활성화에 작용하므로 세포수명의 증가와 관련되는 질환, 즉, 노화, 당뇨병, 신경퇴행성 질환 및 미토콘드리아의 비정상적인 작용과 관련이 있는 각종 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 노화 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다. 특히 상기 당뇨병은 노인성 당뇨병일 수 있다.
본 발명의 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드는 인삼으로부터 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 안정도도 높으므로 식품, 의약품의 첨가제로 이용할 수 있다.
본 발명은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다. 상세하게는, 본 발명은 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 인삼(Panax ginseng) 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 조성물은 시르투인(sirtuins) 효소를 활성화하는 효과가 있어, 에너지 대사과정에 대한 작용을 통하여 세포수명의 증가와 관련되는 질환인 노화, 당뇨병, 신경퇴행성 질환이나 미토콘드리아와 관련 각종 질환의 예방 또는 치료용 의약품, 화장품 및 식품 등에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 화합물 1~3(신규 화합물)의 HMBC [H→C] 및 NOESY [H→H]의 상관관계를 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 화합물 1~5의 시르투인1 활성을 루미노센스(luminescence)를 이용하여 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 HEK293 세포에서 루시퍼라아제 리포터 어세이를 이용하여 본 발명의 화합물 1~5의 시르투인1 활성이 p53에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 HEK293 세포에서 NAD+/NADH 비율을 통해 본 발명의 화합물 1~5의 시르투인1의 활성을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 5는 β-갈락토시다아제에 의하여 염색된 섬유아세포를 찍은 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지기 위해, 또한 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1. 인삼 추출물 및 분획물의 제조>
본 발명에 이용된 인삼은 건조된 것을 광주의 지역시장에서 구입하였다. 상기 건조된 인삼을 100g을 증류수, 에탄올, 메탄올, 아세톤 등의 용매 1000㎖을 사용하여 4시간 동안 3회에 걸쳐 초음파 추출기를 사용하여 추출하였다. 이 후, 고형분을 제거한 추출액을 감압 농축하여 각 추출물을 얻었다. 그리고, 실시예 4에 개시된 시르투인1의 활성 확인 방법을 통해 본 발명의 인삼 분획물 및 진세노사이드의 분리 조건을 설정하였다. 즉, 하기 표 1의 인삼 추출물의 시르투인1 활성 효과를 확인한 후, 90% 에탄올 수용액 추출물 및 70% 메탄올 수용액 추출물을 다시 분획하여 시르투인1의 활성 효과를 비교하였다. 이를 위해 상기 인삼 추출물들을 각각 물(2ℓ)에 현탁한 후 헥산(2ℓ)과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거한 잔사에 에틸아세테이트(2ℓ)를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 및, 상기 에틸아세테이트층을 제거한 잔사에 부탄올(2ℓ)을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물을 얻어서, 상기 농축물들을 각 조건에서의 분획물로 이용하였다. 또한, 표 2에서 보여준 바와 같이, 90% 에탄올 수용액 및 100% 메탄올 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획한 분획물의 시르투인1 활성 효과를 확인한 바, 각 추출물의 분획물에서 시르투인1 활성이 좋음을 확인할 수 있으며, 특히 부탄올 분획물에서 그 효과가 가장 좋음을 알 수 있다.
표 1
추출물 추출량(건조시료 100g당 추출량g) 활성측정농도(㎍/㎖) 무처리군 대비시트루인1 활성 효과 (%)
30% 에탄올 수용액 추출물 4.02g 20 125
50% 에탄올 수용액 추출물 4.40g 20 130
70% 에탄올 수용액 추출물 3.89g 20 122
90% 에탄올 수용액 추출물 4.01g 20 134
100% 에탄올 추출물 3.13g 20 130
100% 메탄올 추출물 3.06g 20 126
100% 아세톤 추출물 0.86g 20 119
증류수 추출물 4.36g 20 101
무처리군(대조군) - - 100
표 2
조건 활성측정농도(㎍/㎖) 무처리군 대비 시트루인1 활성 효과 (%)
90% 에탄올 수용액 추출물 20 134
90% 에탄올 수용액 추출물의 헥산 분획물 20 89
90% 에탄올 수용액 추출물의 에틸아세테이트 분획물 20 103
90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물 20 153
무처리군(대조군) - 100
<실시예 2. 인삼 부탄올 분획물의 제조 및 진세노사이드의 분리>
건조된 인삼(206g)을 90% 에탄올 수용액에 1주일간 실온에서 담그는 방법을 이용하여 인삼 추출액을 얻은 후, 상기 추출액을 감압농축하여 인삼 추출물(19.6g)을 얻었다. 상기 인삼 추출물을 2ℓ의 물에 현탁시킨 후, 헥산(2ℓ)과 혼합하여 얻은 헥산층의 감압농축물, 상기 헥산층을 제거한 잔사(물층)에 에틸아세테이트(2ℓ)를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 감압농축물, 및, 상기 에틸아세테이트층을 제거한 잔사(물층)에 부탄올(2ℓ)을 혼합하여 얻은 부탄올층의 감압농축물을 얻어서, 상기 감압농축물들을 각 조건에서의 분획물로 이용하였다. 또한, 이 중에서 상기 인삼 부탄올 분획물(7.2g)로부터 진세노사이드들을 분리하였다. 활성물질을 분리 정제 후 구조를 확인하기 위하여 부탄올 분획물(6.5g)을 EtOAc/MeOH(10:0 → 0:1)의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(3×50㎝; 63-200㎜ 입자크기)를 실시하여 7개의 소분획물로 나누었다(F1-F7). 상기 소분획물 F1(503㎎)을 MeOH/H2O(1/3 → 1/0)의 RP-18 칼럼 크로마토그래피(1×30㎝; 40-63㎜ 입자크기)를 이용하여 4개의 소분획물로 나누었다(F1.1-F1.4). 소분획물 F1.3(103㎎)을 MeOH/H2O(1/2 → 1/1)의 RP-18 칼럼 크로마토그래피(1×30㎝; 40-63㎜ 입자크기)를 수행하여 6개의 분획으로 다시 나누었다(F1.4.1-F1.4.6). 소분획물 F1.4.2(23㎎)를 HPLC[Optima Pak C18 column(10×250㎜, 10μm 입자크기, RS Tech, Korea); mobile phase MeOH in H2O containing 0.1% HCO2H (0-40 min: 62% MeOH); flow rate 2㎖/min; UV detection at 205 and 254nm]를 실시하여 화합물 2(tR=32min, 1.9㎎)와 화합물 3(tR=36min, 2.3㎎)을 얻었다.
소분획물 F1.4.5(20㎎)를 MeOH/H2O(1/2 → 1/0)의 용매조건을 사용하여 RP-18 칼럼 크로마토그래피(1×30㎝; 40-63㎜ 입자크기)에서 화합물 1(2.0㎎)을 얻을 수 있었다. 소분획물 F1.4.6(19㎎)을 MeOH/H2O(1/2 → 1/0)의 RP-18 칼럼 크로마토그래피(1×30㎝; 40-63㎜ 입자크기)를 사용하여 화합물 4(3.1㎎)를 분리하였다. 소분획물 F3(701㎎)을 CHCl3/MeOH(40:0 → 0:1)의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(1×30㎝; 63-200㎜ 입자크기)를 실시하여 7개의 소분획물으로 나누었다(F3.1-F3.7).
화합물 5(tR=40min, 3.3㎎)가 소분획물 F3.4.8(26㎎)을 HPLC[Optima Pak C18 column(10×50㎜, 10μm 입자크기, RS Tech, Korea); mobile phase MeOH in H2O containing 0.1% HCO2H (0-40min: 80% MeOH); flow rate 2㎖/min; UV detection at 205 and 254nm]를 실시하여 분리되었다.
<실시예 3. 인삼으로부터 유래된 진세노사이드의 물리 화학적 성질 확인>
상기 실시예 2에서 분리된 진세노사이드들의 구조를 ESI 질량분석기(Electrospray Ionization mass spectrometer)를 사용하여 얻은 분자량 및 핵자기 공명 분석의 1H-NMR 및 13C-NMR 분석 결과를 토대로 화합물의 구조를 분석하였다. 상기 진세노사이드 중에서 신규 화합물 1~3의 화합물의 구조는 추가적인 핵자기공명(NMR) 분석을 통하여 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC(1H-detected heteronuclear multiple-quantum coherence), HMBC(heteronuclear multiple-bond coherence), DEPT(distortionless enhancement by polarization) 스펙트럼을 얻고 분자구조를 결정하였다.
실시예 3-1. 파낙솔 A (화합물 1)
Panaxol A;
Brown, amorphous powder;
[α]
Figure PCTKR2014010788-appb-I000003
+25.01 (c 0.3, MeOH);
IR (KBr) νmax 3397, 1722, 1705, 1654, 1381, 1182, 982, 905 ㎝-1;
1H NMR data (500 MHz) 및 13C NMR data (125 MHz) - 표 3 참조;
HRFABMS m/z 495.3457 (calcd for C30H48O4Na, 495.3450).
화합물 1은 갈색의 분말로서 분리되었으며, 분자식은 C30H48O4로 HRFABMS의 측정치인 495.3457에서의 [M+Na]+(calcd for C30H48O4Na, 495.3450)로부터 결정되었다. 화합물 1은 νmax OH (3397 ㎝-1), C=O (1722, 1705 ㎝-1) 및 C=C (1654 ㎝-1)에서의 강한 IR 흡수치를 확인할 수 있었다. 화합물 1의 1H NMR 분석결과 δH 1.40, 1.39, 1.30, 1.17, 0.90 및 0.89에서 6개의 메틸기를, δH 1.73과 1.67에서 olefenic 에 결합된 메틸기, δH 4.15 (td, J = 10.5, 3.5 Hz)에서 옥시메타인 프로톤을, δH 5.15 (t, J = 6.5 Hz)에서 한 개의 올레피닉 프로톤을 확인할 수 있었다. 13C-NMR 결과는 δC 218.4와 212.5에서 2개의 케톤 카보닐(ketone carbonyl) 탄소, δC 131.7과 124.6에서 2개의 올레핀 탄소(olefinic carbon), δC 67.6에서 1개의 옥시메틴 탄소(oxymethine carbon) 및 δC 73.3에서 sp 3 형 산소가 연결된 4급 탄소를 포함하여 30개의 탄소로 이루어진 화합물임을 확인하였다.
화합물 1의 상세한 1H 및 13C NMR 분석결과는 화합물 1이 파낙사디온(panaxadione) 화합물의 A/B 링 구조와 비슷함을 제시한다. 또한, 화합물 1의 C/D링과 치환기의 모습은 베투라포에네트리올(betulafolenetriol)의 3-O-아세틸-12-케토(3-O-acetyl-12-keto) 유도체와 비슷함을 확인하였다. 위의 추정 구조는 2개의 카보닐 그룹이 탄소 C-3과 C-12에 각각 붙어있으며, 2개의 수산기는 C-6과 C-20에 그리고, 올레핀 그룹은 C-24와 C-25 사이에 있는 것을 예시한다. 치환기의 정확한 구조를 확인하기 위하여 HMBC 실험이 수행되었다. 수소 H-2 (δH 2.78), H3-28 (δH 1.39), H3-29 (δH 1.40)로부터 탄소위치 C-3 (δC 218.4)으로의 연결, H-5 (δH 1.78)과 H-7 (δH 1.92)으로부터 C-6 (δC67.6), H-11 (δH 2.29)과 H-13 (δH 2.95)으로부터 C-12 (δC212.5), H-17 (δH 2.47)과 H3-21(δH 1.17)로부터 C-20 (δC 73.3), 그리고 H-24 (δH 5.15)로부터 C-26 (δC 25.7)과 C-27 (δC 17.1)로의 수소와 탄소간의 연결은 위의 추정치가 정확함을 확인시켜 주었다.
수소 H-5와 H-6 (J = 10.5 Hz)의 짝지음 상수(coupling constant) 값은 H-6이 H-5와 축을 이루는(axial) 관계임을 추정하였으며, 추가적인 H-6으로부터 H3-19과 H3-29으로의 연결을 보여주는 NOESY 실험을 통하여 6번의 수산기가 α-위치로 배열됨을 결정하였다. 수소 H-13과 H-17 (J = 10.0 Hz) 및 H-17로부터 H3-21로의 NOESY 연결은 H-17은 α-배열을 C-20(S)로 입체배열됨을 확인하였다. 위와 같은 결과로부터 화합물 1은 파낙사디온(panaxadione)과 베투라포에네트리올(betulafolenetriol)의 3-O-아세틸-12-케토 유도체를 갖는 신규화합물로 결정하다. 이에, 상기 화합물 1은 6α,20(S)-디히드록시담마르-3,12-디온-24-엔(6α,20(S)-dihydroxydammar-3,12-dione-24-ene) 구조를 갖는 파낙솔 A(Panaxol A)로 명명하였다.
실시예 3-2. 파낙솔 B (화합물 2)
Panaxol B;
Brown, amorphous powder;
[α]
Figure PCTKR2014010788-appb-I000004
-51.5 (c 0.2, MeOH);
IR (KBr) νmax 3362, 2971, 1721, 1700, 1637, 1586, 1421, 1181, 1023, 905, 670㎝-1;
1H NMR data (500 MHz) 및 13C NMR data (125 MHz) - 표 3 참조;
HRFABMS m/z 511.3409 (calcd for C30H48O5Na, 511.3399).
화합물 2는 갈색의 분말로서 분리되었으며, 그것의 분자식은 C30H48O5로 HRFABMS의 측정치인 511.3409에서의 [M+Na]+ (calcd for C30H48O5Na, 511.3399)로부터 결정되었다. 화합물 2는 νmax OH (3362 ㎝-1), C=O (1721, 1700 ㎝-1) 와 C=C (1637 ㎝-1)에서의 강한 IR 흡수치를 확인할 수 있었다. 화합물 2의 1H 및 13C NMR 분석결과는 화합물 1의 사이드 치환기인 C-3과 C-12번의 2개의 케톤기 및 C-6의 수산기는 비슷하게 연결되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 화합물 2의 HMBC 결과인, H2-2 (δH 2.79와 2.31), H3-28 (δH1.67), H3-29 (δH 1.71)로부터 C-3 (δC 218.8), 그리고 H-11 (δH 2.29), H-13 (δH 3.41), H-17 (δH 2.80)로부터 C-12 (δC 211.9), H-5 (δH 1.94)와 H-7 (δH 1.87)로부터 C-6 (δC 67.2)로부터 확인되었다.
화합물 2의 1H 및 13C NMR 분석은 추가적으로, 2개의 케톤기와 1개의 수산기외에 분자식 추정치로부터 2개의 수산기 및 1개의 올레핀 그룹의 존재를 제시한다. 13C NMR 분석결과로부터 확인된 한 쌍의 δH 5.28 (brs)과 4.97 (brs)에 있는 올레핀 수소로부터 기인한 δC 110.5의 탄소와 δH 1.90 (brs)에서 관찰되는 메틸기의 강한 벗겨짐 (deshielding)은 Δ25,26 올레핀계의 존재와 δH 1.90에서 관찰되는 메틸기가 H3-27에 기인한 수소임을 제시한다. 이러한 결과들은 H3-27 (δH 1.90)으로부터 C-25 (δC 150.7)과 C-26 (δC110.5)으로의 HMBC 연결, H2-26 (δH 5.28과 4.97), H3-27 (δH 1.90)으로부터 δC 76.2으로의 HMBC 연결은 δC 76.2에 있는 탄소의 위치가 C-24이며 수산기가 존재함을 확인하였다. 추가의 수산기의 위치는 20번에 있음을 H-13 (δH 3.41), H-17 (δH 2.80), H3-21 (δH 1.46)으로부터 C-20 (δC 73.7)으로의 HMBC 연결로부터 확인하였다.
화합물 2의 입체구조는 짝지움 상수, 기존 문헌값의 NMR 결과분석 및 NOESY 실험을 통하여 확인되었다. H-5와 H-6 (J = 10.1 Hz)의 짝지음상수는 H-6이 H-5와 axial 관계이며 6번의 수산기가 a-배열임을 제시하며, H-17도 a-배열임을 H-13과 H-17 (J = 10.0 Hz)의 짝지음 상수로부터 확인하였다. C/D 환의 입체배열과 화합물 2와 3-O-아세틸-12-케토 유도체의 C-17, C-20, C-21, 그리고 C-22의 NMR 결과는 C-20의 결과가 C-20(S)임을 제시하며, 이러한 결과는 H-6과 H3-19 및 H3-29, H-17로부터 H3-21로의 NOESY 연결로부터 확인되었다. 따라서, 화합물 2는 3,12-디온-6α,20(S),24-트리히드록시담마르-25-엔(3,12-dione-6α,20(S),24-trihydroxydammar-25-ene)의 구조를 갖는 파낙솔 B(Panaxol B)로 명명하였다.
실시예 3-3. 파낙솔 C (화합물 3)
Panaxol C;
Brown, amorphous powder;
[α]
Figure PCTKR2014010788-appb-I000005
+25.01 (c 0.3, MeOH);
IR (KBr) νmax 3361, 2972, 1715, 1700, 1541, 1459, 1340, 1227, 1030, 926, 653 ㎝-1;
1H NMR data (500 MHz) 및 13C NMR data (125 MHz) - 표 3 참조;
HRFABMS m/z 511.3409 (calcd for C30H48O5Na, 511.3399).
화합물 3은 갈색의 분말로서 분리되었으며, 그것의 분자식은 C30H48O5로 HRFABMS의 측정치인 511.3346에서의 [M+Na]+ (calcd for C30H48O5Na, 511.3399)로부터 결정되었다. 화합물 3은 νmax OH (3361 ㎝-1) 와 C=O (1715, 1700 ㎝-1)에서의 강한 IR 흡수치를 확인할 수 있었다. 화합물 3의 13C NMR 분석결과는 화합물 3의 화학적 이동값이 화합물 2의 화학적 이동값에서 δC 46.0 (C-22), 123.2 (C-23), 143.3 (C-24), 70.2 (C-25), 31.3 (C-26), 31.2 (C-27)이외에는 유사함을 보였다. 화합물 3의 1H NMR 스펙트럼은 한쌍의 올레피닉 프로톤으로 추정할 수 있는 결과는 δH 6.25 (m) 과 6.02 (d, J = 15.4 Hz) 화학적 이동값이 화합물 2의 Δ25,26의 올레피닉 프로톤인 화학적 이동값인 δH 5.28 (brs) 과 4.97 (brs) 대신에 새로이 나타났으며, 또한 옥시메틴(oxymethine) 프로톤인 δH-24 4.41 (t, J = 5.0 Hz)가 화합물 3에서는 사라졌다.
이러한 결과들은 화합물 3의 HMBC 결과인 H3-26/27 (δH 1.53, 6H)로부터 C-24 (δC 143.3)과 C-25 (δC 70.2), H2-22 (δH 2.61과 2.54)로부터 C-23 (δC 123.2)과 C-24 (δC 143.3) 으로의 연결로부터 확인하였다. 화합물 3의 J=15.4 Hz의 큰 결합상수는 H-23과 H-24가 E-type의 Δ23,24 올레핀 결합을 하고 있음을 제시한다. 수소 H-5와 H-6 (J = 11.0 Hz), H-13과 H-17 (J = 10.0 Hz)의 큰 결합상수와 또한 NOESY 스펙트럼으로부터 얻은 H-6으로부터 H3-19 및 H3-29으로의 연결, H-17로부터 H3-21로의 연결은 C-6, C-17, C-20의 입체배열을 결정한다. 이에, 화합물 3은 3,12-디온-6α,20(S),25-트리히드록시담마르-23-엔(3,12-dione-6α,20(S),25-trihydroxydammar-23-ene)의 구조를 갖는 파낙솔 C(Panaxol C)로 명명하였다.
표 3
position 화합물 1 a 화합물 2 b 화합물 3 b
δH (J in Hz) δC δH (J in Hz) δC δH (J in Hz) δC
1 1.75, m 39.3, CH2 2.12 m 38.8, CH2 2.14 m 38.5, CH2
1.01, m 1.59 m 1.49 m
2 2.78, m 32.6, CH2 2.79 m 32.5, CH2 2.80 m 33.5, CH2
2.48, m 2.31m 2.25 m
3 218.4, C 218.8, C 218.6, C
4 47.2, C 48.1, C 48.1, C
5 1.78, d (10.5) 58.6, CH 1.94 d (10.1) 59.1, CH 1.93 d (11.0) 59.1, CH
6 4.15, td (10.5, 3.5) 67.6, CH 4.28 m 67.2, CH 4.27 m 67.2, CH
7 2.34, m 43.9, CH2 2.37 m 45.1, CH2 2.33 m 45.0, CH2
1.92, m 1.87 m 1.87 m
8 40.7, C 41.5, C 41.6, C
9 1.93, m 51.8, CH 1.96 m 53.4, CH 1.99 m 53.4, CH
10 38.2, C 40.1, C 40.6, C
11 2.29 m 38.9, CH2 2.36 m 38.6, CH2 2.37 m 37.9, CH2
2.20 m 2.29 m 2.31 m
12 212.5, C 211.9, C 211.9, C
13 2.95, d (10.0) 55.6, CH 3.41 d (10.0) 56.5, CH 3.42 d (10.0) 56.4, CH
14 54.7, C 56.3, C 56.3, C
15 1.56, m 31.0, CH2 1.53 m 31.4, CH2 1.58 m 32.4, CH2
1.05, m 1.23 m 1.23 m
16 1.77, m 24.5, CH2 2.12 m 24.9, CH2 2.16 m 24.8, CH2
1.37, m 1.87 m 1.90 m
17 2.47 m 45.5, CH 2.80 m 44.4, CH 2.79 m 44.3, CH
18 0.90, s 16.7, CH3 0.90 s 16.9, CH3 0.89 s 16.5, CH3
19 0.89, s 17.1, CH3 0.82 s 17.3, CH3 0.83 s 17.1, CH3
20 73.3, C 73.7, C 74.0, C
21 1.17, s 26.3, CH3 1.46 s 27.3, CH3 1.46 s 27.6, CH3
22 2.08 m 38.0, CH2 1.94 m 39.7, CH2 2.61 m 46.0, CH2
1.32, m 1.49 m 2.54 m
23 2.16, m 22.5, CH2 2.02 m 33.5, CH2 6.25 m 123.2, CH
2.08, m 1.17 m
24 5.15, t (6.5) 124.6, CH 4.41 t (5.0) 76.2, CH 6.02 d (15.4) 143.3, CH
25 131.7, C 150.7, C 70.2, C
26 1.73, s 25.7,CH3 5.28 br s 110.5, CH2 1.53 s 31.3 c , CH3
4.97 br s
27 1.67, s 17.1, CH3 1.90 br s 18.8, CH3 1.53 s 31.2 c ,CH3
28 1.39, s 31.8, CH3 1.67 s 32.4, CH3 1.67 s 32.5, CH3
29 1.40, s 19.5, CH3 1.71 s 20.2, CH3 1.70 s 20.3, CH3
30 1.30, s 17.0, CH3 1.24 s 17.5, CH3 1.26 s 17.5, CH3
a Data were measured in CDCl3. b Data were measured in C5D5N.
실시예 3-4. 담마르-20(22),24-디엔-3β,6 α ,12β-트리올 (화합물 4)
Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol;
FAB-MS: [M+Na]+ m/z 481.38;
1H NMR data (400 MHz, in C5D5N): 5.39 (1H, brt, J = 7.1 Hz, H-22), 5.19 (1H, brt, J = 7.1 Hz, H-24), 4.33 (1H, m, H-12), 3.86 (1H, m, H-6), 3.44 (1H, dd, J = 11.3, 5.0 Hz, H-3), 2.68 (2H, dd, J = 7.5, 7.1 Hz, H-23), 1.92 (3H, s, H-29), 1.73 (3H, s, H-21), 1.52 (3H, s, H-26), 1.48 (3H, s, H-27), 1.36 (3H, s, H-30), 1.06 (3H, s, H-28), 0.92 (3H, s, H-18), 0.87 (3H, s, H-19);
13C NMR data (150 MHz, in C5D5N): 39.6 (C-1), 28.2 (C-2), 78.4 (C-3), 40.4 (C-4), 61.8 (C-5), 67.7 (C-6), 47.7 (C-7), 41.5 (C-8), 50.5 (C-9), 40.4 (C-10), 32.7 (C-11), 72.6 (C-12), 50.7 (C-13), 50.9 (C-14), 32.3 (C-15), 28.9 (C-16), 50.4 (C-17), 17.7 (C-18), 17.1 (C-19), 140.1 (C-20), 13.2 (C-21), 123.2 (C-22), 27.5 (C-23), 123.5 (C-24), 131.3 (C-25), 25.7 (C-26), 17.5 (C-27), 32.0 (C-28), 16.5 (C-29), 17.7 (C-30).
실시예 3-5. 20( S )-진세노사이드 Rg 3 (화합물 5)
20(S)-Ginsenoside Rg3;
ESI-MS: [M+H]+ m/z 785.1;
1H NMR data (400 MHz, in DMSO-d 6): 5.09 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-24), 3.37 (1H, m, H-12), 3.01 (1H, dd, J = 8.6, 2.3 Hz, H-3), 2.07 (1H, m, H-23a), 1.90 (1H, m, H-23b), 1.89 (1H, m, H-17), 1.87 (1H, m, H-2a), 1.73 (1H, m, H-16a), 1.67 (1H, m, H-11a), 1.63 (3H, s, H-26), 1.57 (1H, m, H-13), 1.56 (1H, m, H-2b), 1.55 (1H, m, H-1a), 1.54 (3H, s, H-27), 1.46 (1H, m, H-6a), 1.43 (1H, m, H-7a), 1.41 (1H, m, H-15a), 1.39 (1H, m, H-22a), 1.36 (1H, m, H-6b), 1.34 (1H, overlap, H-9), 1.28 (1H, m, H-22b), 1.21 (1H, m, H-16b), 1.19 (1H, m, H-7b), 1.11 (1H, m, H-11b), 1.01 (3H, s, H-21), 0.97 (3H, s, H-28), 0.94 (1H, m, H-1b), 0.93 (1H, m, H-15b), 0.89 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, s, H-30), 0.80 (3H, s, H-19), 0.73 (3H, s, H-29), 0.69 (1H, overlap, H-5); sugar part: 4.26 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-1'), 3.31 (1H, t, J = 5.5 Hz, H-2'), 3.34 (1H, t, J = 5.5 Hz, H-3'), 3.07 (1H, overlap, H-4'), 3.07 (1H, overlap, H-5'), 3.64 (1H, m, H-6'a), 3.41 (1H, m, H-6'b), 4.42 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-1''), 2.98 (1H, t, J = 5.5 Hz, H-2''), 3.12 (1H, t, J = 5.5 Hz, H-3''), 3.11 (1H, t, J = 5.5 Hz, H-4''), 3.02 (1H, overlap, H-5''), 3.60 (1H, m, H-6'a), 3.47 (1H, m, H-6'b);
13C NMR data (100MHz, in DMSO-d 6): 38.5 (C-1), 25.7 (C-2), 88.1 (C-3), 38.6 (C-4), 55.4 (C-5), 17.6 (C-6), 34.3 (C-7), 36.2 (C-8), 49.3 (C-9), 38.8 (C-10), 30.8 (C-11), 69.7 (C-12), 47.3 (C-13), 50.4 (C-14), 30.5 (C-15), 35.8 (C-16), 53.4 (C-17), 15.4 (C-18), 15.8 (C-19), 71.8 (C-20), 26.3 (C-21), 34.8 (C-22), 21.8 (C-23), 125.4 (C-24), 129.8 (C-25), 25.4 (C-26), 17.5 (C-27), 27.4 (C-28), 15.7 (C-29), 16.5 (C-30), sugar part: 103.5(C-1'), 81.2 (C-2'), 76.4 (C-3'), 69.9 (C-4'), 76.3 (C-5'), 60.9 (C-6'), 103.8 (C-1''), 75.2 (C-2''), 76.0 (C-3''), 69.8 (C-4''), 76.7 (C-5''), 60.7 (C-6'').
<실시예 4. 시험관 내에서 시르투인1 효소 활성 측정>
시르투인1은 p53의 K382 부분을 디아세틸화시키는 단백질로 이러한 디아세틸화는 p53-관계된 전사과정을 활성화하며 궁극적으로 세포의 노화 및 DNA 손상과 스트레스에 기인한 아폽토시스(apoptosis)에 반대적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 화합물 1~5의 시르투인1 효소 활성화 정도를 시르투인 효소를 직접 사용하여 측정하였다.
먼저, 루미노센스(luminescence)를 이용하여 시르투인1 효소의 활성(deacetylase activity)을 측정하였다(시르투인1 deacetylase activity 활성이 증가한다는 것과 시르투인1의 활성이 높아진다는 것은 동일한 의미임). 이를 위해, Flour de-Lys-SIRT1 기질(KI-177)과 Flour de-Lys-Developer II(KI-176) 및 시르투인1 효소(SIRT1, human, recombinant, SE-293)는 바이오몰사로부터 구입하여 사용하였다. 시르투인1 반응액(500mM Tris/Cl pH 8.0, 100mM MgCl2, 1.37M NaCl, 270 mM KCl, 100㎎/㎖ BSA)에 본 발명의 화합물 1~5를 10~20㎍/㎖로 처리하고, 시르투인1 효소를 첨가하여 반응시킨 후 바이오몰사의 2X substrate mixture를 반응액에 넣었다. 반응종료 후 시료를 원심분리하여 developer II mixture로 반응시킨다. 이후, 시르투인1 어세이 버퍼(SIRT1 assay buffer)를 첨가한 후 360/450nm에서 단백질의 활성을 측정하여, 상기 결과를 도 2에 나타내었다. 이 때 대조군은 화합물의 용매인 DMSO만 동일부피(세포 배양액의 0.1% 이내)로 처리하였다.
도2를 참고하면, 양성대조군인 레스베라트롤과 음성대조군인 니코틴아미드(nicotinamide, 분자량 122)를 사용하여 확인한 결과, 2.3㎍/㎖(10μM)의 레스베라트롤(분자량 228)을 사용시 시트루인1의 활성은 2배 정도 활성화되었으며 1.2㎍/㎖(10μM) 니코틴아미드를 처리시 30~50%의 시르투인1 단백질 활성을 저해함을 확인하여 활성제와 저해제를 동시에 측정할 수 있는 시스템이 확립되었음을 알 수 있다.
한편, 본 발명의 화합물 1~5는 농도 의존적으로 시르투인1 효소의 활성을 증가시키는 것이 확인되는데, 특히, 화합물 4의 시르투인 활성화 기능이 현저하게 우수한 것으로 확인된다.
<실시예 5. p53 루시퍼라아제 리포터 어세이를 이용한 시르투인1의 활성 확인>
세포 내에서 시르투인1의 활성(deacetylase activity)이 높아지면, p53의 활성이 떨어진다는 보고(Molecular Cell, 28, 277-290, 2007)를 이용하여 p53의 활성을 세포 내에서 확인하였다. 즉, 루시퍼라아제 트랜스펙션(transfection)을 이용하여 p53의 활성을 측정함으로써, 시르투인1의 활성을 예측하는 방법을 사용하였다.
HEK293 세포를 70% 정도 포화상태로 배양한 후 PBS로 세척하였다. 0.25%의 트립신(trypsin)을 실온에서 1분간 처리한 후 DMEM을 가하여 세포를 수집하고, 2,500rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하여 세포 침전물을 얻었다. 이 후 상기 세포들을 DMEM 배지로 잘 혼합하였다. 다음으로는 혈청 결핍 배지(serum free media, DMEM) 100㎕에 3㎕의 lipopectAMINE(life Technologies, Inc)을 점적한 후 천천히 섞어 15분간 실온에 방치한 후, 3.0㎍의 p53-Luc(p53-루시퍼라아제 벡터), 3.0㎍의 pCMV-β-갈락토시다아제(transfection의 효율을 일정하게 맞추기 위한 표준물질로 β-galactosidase 유전자를 가진 plasmid), 0.2㎍의 시르투인1(SIRT1), 0.3㎍의 Myc 발현 벡터(Myc expression vector) 또는 공벡터(empty vector)를 넣은 미세 원침 튜브를 이용하여 30초에 걸쳐 상기 혈청 결핍 배지에 천천히 점적하면서 혼합하여 실온에서 다시 15분간 방치하였다. LipopectAMINE과 각각의 벡터(또는 DNA-plasmid)의 혼합액과 HEK293 세포를 천천히 섞어 현탁액 상태로 20분간 실온에서 배양한 후 60㎜ 배양용기에 분주하고 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 다음날 각각의 화합물 1~5를 각각 도 3에서 적시한 농도로 첨가한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 다음으로는, 배양된 HEK293 세포를 PBS로 2회 세척하고 각각의 배양용기에 500㎕의 추출용액을 가하여 세포를 파괴한 뒤 14,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이 때 얻은 상층액(세포 추출액)을 루시퍼라아제(luciferase)와 β-갈락토시다아제의 활성 측정에 사용하였다.
루시퍼라아제 활성은 100㎕의 세포에서 추출된 상층액(세포 추출액)과 100㎕의 20nM D-luciferin과 300㎕의 반응액(20mM glycin, 12.5mM MgSO4, 3mM EGTA, 15mM potassium phosphate, 1mM DTT, 1mM ATP)을 사용하여 발광분석기(luminometer)로 측정하였다. 유전자 주입 효율을 보정하기 위하여 β-갈락토시다아제(β-galatosidase) 활성을 측정하여 루시퍼라아제 활성을 보정하였다. β-갈락토시다아제의 활성은 30㎕의 세포추출액과 66㎕의 ONPT(4㎎/㎖), 204㎕의 반응액(0.1M sodium phosphate, 1mM MgCl2, 45mM β-mercaptoethanol, pH 7.5)을 37℃ 항온조에서 반응시킨 후 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 이 때 p53-Luc와 시르투인1 및 화합물이 모두 첨가되지 않는 군(도 3의 첫 번째 라인), p53-Luc만 첨가되고 시르투인1과 화합물은 포함되지 않는 군(도 3의 두 번째 라인), 대조군(p53-Luc와 시르투인1이 첨가되었지만 화합물은 처리되지 않는 군, 도 3의 세 번째 라인)은 모두 화합물 대신 DMSO를 처리하였다(화합물 처리군과 동일한 부피로서 세포 배양액의 0.1% 이내).
도 3에 상기 p53의 루시퍼라아제 활성 결과를 나타낸 바, p53(p53-luc)을 트랜스펙션하였을 때 p53의 활성이 증가하였고 p53(p53-luc)과 시르투인1(SIRT1)을 동시에 트랜스펙션하였을 때 p53의 전사활성이 감소하는 것을 알 수 있어 시르투인1이 p53의 활성을 억제하는 것을 알 수 있다.
이 때, 시르투인1 활성화 물질인 레스베라트롤 처리시 p53의 활성이 더욱 감소됨을 확인할 수 있는데, 화합물 1~5도 마찬가지로 세포 내에서 p53의 활성을 더욱 감소시키는 것을 알 수 있다. 따라서, 상기 결과를 통해, 화합물 1~5가 시르투인1 효소 활성을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 6. NAD + /NADH 비율 확인>
시르투인1의 효소활성 변화가 세포 내에서의 NAD+/NADH의 비율을 변화시킬 것으로 예상하고 세포에서 이들의 농도를 측정하였다. 시르투인1 효소는 '세포에 에너지가 고갈된 상태가 되면 활성화되는 NAD+ 의존형 히스톤 디아세틸라제(NAD+ dependant histone deacetylase)'의 한 종류로 알려져 있다. 따라서, 세포내에서 화합물의 처리 후 NAD+/NADH 비율을 측정한다면, 세포 내에서의 시르투인1 활성화 정도를 확인할 수 있다.
HEK293 세포를 70% 포화상태로 배양한 후 화합물 1~5(2.5~20㎍/㎖) 또는 4.6㎍/㎖(20μM)의 레스베라트롤(분자량 228, 양성대조군)을 첨가한 후 다시 12시간 동안 배양하였다. 이후, HEK293 세포주를 PBS를 사용하여 세포를 수집하고, 8,000rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 수집된 HEK293T 세포주에 AAT Bioquest사의 NAD+/NADH 라이시스 버퍼(AAT Bioquesr Cat. 15263)를 사용하여 세포추출물을 얻고, AAT Bioquest사의 NAD+/NADH Quantitation kit를 사용하여 NAD+/NADH 비율이 증가되는 지를 측정하였고, 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다(결과값 2는 NAD+의 함량이 2배 증가함을 의미함).
도 4를 참고하면, 본 발명의 화합물 1~5의 처리로 인해 세포내에서 NAD+/NADH의 비율이 큰 폭으로 변화되는 것을 확인할 수 있다. 본 발명의 화합물 1~5는 세포내에서 NAD+/NADH의 비율을 증가시키는 점으로부터, 이들 인삼 유래의 화합물들이 모두 시르투인 활성화 화합물임을 확인할 수 있다.
특히, 화합물 4와 5는 2.5~5㎍/㎖의 처리농도에서 강하게 NAD+/NADH 비율을 증가시켰으며, 특히, 화합물 4는 NAD+/NADH 비율을 강하게 증가시켜 수명연장 효과가 우수한 화합물임을 제시한다.
<실시예 7. 젊은 세포와 노화된 세포의 제작 및 시료의 처리>
Primary 인간 섬유아세포는 신생아의 음경포피(foreskin)에서 분리하였다. 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 항생제가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 계대 배양으로 유지하였다. 구성 분자종의 차이는 세포수가 2배가 되는 population doubling이 20 이하인 젊은 세포(passage 8, p8, 8번 계대 배양된 세포)와 70 이상인 노화된 세포(passage 35, p35, 35번 계대 배양된 세포)와 비교하였다. 노화(senescent) 세포의 특성은 형태적인 변화, β-갈락토시다아제 활성도 증가, 세포분열능의 감소비율 정도로 특정된다. 이를 위해 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)에서 세포를 60~70% 채울 정도로 1~2일 정도 키운 다음, 0.1% BSA(bovine serum albumin) 또는 혈청 결핍 배지 상에서 2일간 키워 혈청 결핍(serum-starvation)에 의해 세포를 G1 정지(G1 arrest)에 이르게 하는 세포동화를 시킨 후, 노화 세포의 확인을 위한 실험을 실시하였다(Biochem Biophys Res Commun., 302(4), 778-784, 2003). 화합물 처리후 노화세포에서 나타나는 β-갈락토시다아제의 변화는 셀 시그날링사(Cell Signaling)의 염색키트(Senescence β-Galactosidase Staining Kit, #9860)을 사용하여 측정하였다.
실험에 사용한 인간섬유아세포(HDF)는 젊은 세포(7번 계대된 세포)와 노화된 세포(계대수 35번 세포주)를 각각 준비하여 6-웰 플레이트에서 분주하고 CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 이 후, 화합물 4를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 1M 스탁용액(stock solution)을 만들었고, 세포배양배지(cell culture media)의 부피에 맞추어(DMSO 0.1% 이하) 처리농도를 얻었다. 노화된 세포 배양시 화합물 4를 처리하기 전 혈청 결핍 배지(serum free media)로 1일간 처리하여 세포를 안정화(synchronization)시켰다. 마이크로피펫(micropippet)으로 세포에 화합물 4를 처리한 후, 12시간 후의 형태학적 변화(morphological change)를 β-갈락토시다아제가 염색된 결과를 통하여 관찰하였다.
한편, β-갈락토시다아제가 염색방법은 다음과 같다. 노화세포에 화합물이 처리된 인간섬유아세포와 양성 대조군으로 화합물이 처리되지 않은 노화세포 및 젊은 세포를 염색하는 방법을 사용하여 비교하였다. 각각의 인간섬유아세포를 PBS로 2회 세척하고 각각의 웰에 염색키트 내의 세포 고정용액(1x fixative solution)을 1㎖씩 넣은 후 실온에서 15분간 방치하였다. 이후, 각각의 세포를 다시 PBS로 2회 세척하고 각각의 웰에 염색키트 내의 β-갈락토시다아제 염색용액(β-galactosidase staining solution)을 1㎖씩 넣은 후 12시간 방치하여 염색하였고, 형태학적 변화(morphological change)를 β-갈락토시다아제가 염색된 결과를 통하여 관찰하였다. 본 발명의 화합물 4를 세포에 5㎍/㎖의 농도로 처리한 후 나타난 결과를 도 5에 표시하였다.
도 5를 참고하면, 노화된 세포 수, 즉 β-갈락토시다아제에 의하여 염색된 세포수를 측정한 결과, 노화세포인 p35 세대수의 세포는 74개의 세포 중 70개가 염색되었으며, p8의 젊은세포는 2개의 세포가 염색되었다. 화합물 4를 노화세포인 p35세포에 처리한 결과 전체 63개의 세포 중 36개의 세포가 염색되어 노화세포가 젊은세포로 변화되었음을 알 수 있다.
<실시예 8. 독성실험>
실시예 8-1. 급성독성
본 발명의 인삼 90% 에탄올 추출물의 부탄올 분획물 및 화합물 4를 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 30마리를 대조군과 실험군에 각각 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 PEG-400/tween-80/에탄올(8/1/1, v/v/v) 만을 투여하고, 실험군은 인삼 90% 에탄올 추출물의 부탄올 분획물 및 화합물 4를 상기 PEG-400/tween-80/에탄올(8/1/1, v/v/v)에 녹여 실시예 8에서 이용된 투여농도인 20㎎/㎏/day의 100배(2g/㎏/day)의 농도로 각각 경구투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2g/㎏/day 농도의 인삼 90% 에탄올 추출물 및 화합물 4를 투여한 실험군에서 마우스가 모두 생존하는 것으로 확인되었다.
실시예 8-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험
장기 독성 실험은 본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물 및 화합물 4를 2g/㎏/day로 8주 동안 노화 모델로 이용된 C57BL/6J 마우스(각 군당 10마리)에 투여하여 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 인삼 90% 에탄올 추출물의 부탄올 분획물 및 화합물 4를 투여한 실험군과 PEG-400/tween-80/에탄올(8/1/1, v/v/v)만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 모든 조직에서 특이한 이상이 관찰되지 않았다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 화합물 4(200g)를 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 화합물 4(1g), 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 인삼 90% 에탄올 수용액 추출물의 부탄올 분획물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1의 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3), 담마르-20(22),24-디엔-3β,6α,12β-트리올(Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol, 화합물 4), 및, 20(S)-진세노사이드 Rg3(20(S)-Ginsenoside Rg3, 화합물 5)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 포함하는 인삼 분획물을 함유하는 것을 특징으로 하는 시르투인(sirtuins) 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000006
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인삼 분획물은 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매를 가하여 얻은 유기용매층의 농축물인 것을 특징으로 하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 인삼 분획물은 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거한 잔사에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 또는, 상기 에틸아세테이트층을 제거한 잔사에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물인 것을 특징으로 하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시르투인 활성화로 치료되는 질환은 노화, 근육조직장애, 당뇨병을 포함하는 대사 질환, 뇌졸중, 뇌졸중 유사 발작, 치매, 파킨슨병, 신경조직장애, 신경정신장애, 자폐증, 정신 지체, 발작, 반사 작용 저하, 자율신경실조증, 편두통, 신경 통증, 간부전, 장간폐색증, 과민성 장 증후군, 위식도역류질환, 변비, 설사, 신세뇨관성산증, 판코니 증후군, 췌장 외분비 기능부족증, 갑상선 기능 저하증, 부갑상선 기능 저하증, 생식 기능 저하증, 발달 지연, 저혈당, 시신경위축, 사시, 망막색소변성증, 실명, 청력 손실, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골성관절염, 운동실조, 구음장애, 연하곤란, 경직, 뇌근병증, 근육통, 근이영양증, 근육 경련, 안검하수, 눈근육마비, 진행성 외안근 마비, 레버 시신경 위축증 및 호흡 장애로 이루어진 질환 중에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 하기 화학식 1의 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3), 담마르-20(22),24-디엔-3β,6α,12β-트리올(Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol, 화합물 4), 및, 20(S)-진세노사이드 Rg3(20(S)-Ginsenoside Rg3, 화합물 5)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 시르투인(sirtuins) 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000007
  6. 하기 화학식 1의 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3), 담마르-20(22),24-디엔-3β,6α,12β-트리올(Dammar-20(22),24-diene-3β,6α,12β-triol, 화합물 4), 및, 20(S)-진세노사이드 Rg3(20(S)-Ginsenoside Rg3, 화합물 5)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 포함하는 인삼 분획물을 함유하는 것을 특징으로 하는 시르투인(sirtuins) 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000008
  7. 하기 화학구조를 갖는 신규 화합물 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1)
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000009
  8. 하기 화학구조를 갖는 신규 화합물 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2)
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000010
  9. 하기 화학구조를 갖는 신규 화합물 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3)
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000011
  10. 인삼을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 인삼 추출물을 물에 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매를 가하여 얻은 유기용매층의 농축물로부터 하기 파낙솔 A(Panaxol A, 화합물 1), 파낙솔 B(Panaxol B, 화합물 2), 및, 파낙솔 C(Panaxol C, 화합물 3)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 진세노사이드를 분리하는 방법.
    Figure PCTKR2014010788-appb-I000012
PCT/KR2014/010788 2013-11-11 2014-11-11 인삼 분획물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 함유하는 시르투인 활성화로 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 WO2015069086A1 (ko)

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