WO2018088862A1 - 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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flower extract
disease
red bean
prevention
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김원곤
한백수
변정수
최하영
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한국생명공학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition and health functional food for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising Daphne genkwa flower extract or fractions thereof as an active ingredient.
  • Neurodeegenerative diseases are associated with symptoms when neurons degenerate, lose function, and often die. Patients with neurodegenerative disorders may experience severe degeneration in cognitive or motor capacity, and because these disorders are primarily progressive, their quality of life and expectations for life can be significantly reduced. .
  • Parkinson's Disease PD
  • AD Alzheimer's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • HD Huntington's disease
  • Frontotemporal Dementia Frontotemporal Dementia
  • cortical-basal nucleus cortico Basal Degeneration, progressive supranuclear palsy (PSP) and other diseases.
  • Nurr1 refers to a nuclear receptor related 1 protein, also known as NR4A2 (nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), which is known to be encoded by the human NR4A2 gene.
  • NR4A2 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
  • the Nurr1 protein is an orphan nuclear receptor, a ligand for the Nurr1 protein has not yet been identified, but it has been found to play a key role in maintaining the dopaminergic system in the brain.
  • the function of the dopamine system is impaired to cause Parkinson's disease, and it is known to cause a wide range of inflammatory and neurological diseases such as rheumatoid arthritis, schizophrenia, and manic depression.
  • a representative neurodegenerative disease caused by the dysfunction of Nurr1 is Parkinson's disease.
  • Parkinson's disease is one of the important diseases in modern aging society, with the main symptoms of tremor, stiffness, slowness of movement and dysphagia.
  • Drugs for the treatment of Parkinson's disease are known as L-dopa preparations, dopamine receptor agonists, anticholinergic drugs, Eldepryl, most of these drugs are not symptomatic treatment, but symptoms It is a regulating role and requires constant medications.
  • L-dopa preparations dopamine receptor agonists
  • anticholinergic drugs Eldepryl
  • most of these drugs are not symptomatic treatment, but symptoms It is a regulating role and requires constant medications.
  • many drugs have been made and commercialized as a treatment for Parkinson's disease, but an essential therapeutic agent for completely treating Parkinson's disease has not been developed yet.
  • the red bean stem and / or root extract selected by the applicant is genotoxic in the reverse mutation test and the chromosomal aberration test during the nonclinical stability test for development into a natural product.
  • the present inventors have found that the red bean flower, which is used as a medicinal herb, is more effective in preventing or treating neurodegenerative diseases without genotoxicity, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases, including a red bean flower flower extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a health functional food for the prevention or improvement of neurodegenerative diseases, including red bean flower extract or fractions thereof.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising Daphne genkwa flower extract or a fraction thereof as an active ingredient.
  • the term “Daphne genkwa” used in the present invention refers to a deciduous tree of the dicotyledon plating medicinal adzukiaceae, also called early flowering tree or red bean tree. Azaleas grow mainly near the beach and are used to treat symptoms such as diuresis, species, and nephritis in oriental medicine. Dried buds of Adzuki bean are called Wonhwa or Flower and are used as medicinal herbs and are known to be slightly toxic. As is known, the red bean flower extract includes genkwanin, hydroxygenkwanin apigenin, and sitosterol, in addition to benzoic acid and irritating essential oils. Contains substances
  • the term 'Adzuki bean flower extract means an extract obtained from adzuki bean flowers or buds, and preferably means an extract obtained by extracting azuki bean flowers or buds with water or an organic solvent. In particular, it means an extract obtained by extracting the flowers or buds of the red bean flower with water, lower alkyl alcohols of C1 to C4, or a mixed solvent thereof.
  • Red bean flower extract according to an embodiment of the present invention is preferably an extract extracted with 80% ethanol.
  • the red bean flowers and / or buds are prepared using an organic solvent such as C1 to C4 lower alkyl alcohols such as water, methanol, ethanol, butanol, or C1 to C4 lower alkyl alcohol aqueous solution.
  • Organic solvent such as C1 to C4 lower alkyl alcohols such as water, methanol, ethanol, butanol, or C1 to C4 lower alkyl alcohol aqueous solution.
  • Flower tree flower extract was obtained.
  • the red bean flower extract may include Genkwanin N or Yuanhuacin.
  • the genkenin N may be prepared according to a method known to those skilled in the art as a terpenoid, specifically, a diterpene ester compound represented by the following Chemical Formula 1, and preferably, it may be extracted and separated from azalea flowers or buds. have.
  • the huahuacin is a terpenoid represented by the following formula (2), specifically, a diterpene ester compound, which may be prepared according to a method known to those skilled in the art, and may be preferably extracted and separated from the palm flower or bud. have.
  • fraction as used in the present invention means an active fraction obtained by fractionating a substance having a desired activity in the present invention from the sorbus flower extract using a specific solvent.
  • the obtained red bean flower flower extract is obtained by separating the fractionation layers of each solvent using a mixed solvent of an organic solvent such as hexane, ethyl acetate, butanol, or distilled water, and chromatography.
  • Fractions can be prepared by separating and purifying the active ingredient in high purity using separation methods known in the art. Fractions obtained through various purification methods are also included in the fractions of the present invention.
  • the fraction of the red bean flower extract may include Genkwanin N or Yuanhuacin.
  • Adzuki bean flower extract or fractions thereof of the present invention may be included as well as the extract by the above-described extraction solvent as well as the extract through a conventional purification process without limitation.
  • the present inventors confirmed that the red bean stem and root extracts of Korean Patent Registration No. 10-1631589, filed by the applicant, have genotoxicity in the reverse mutation test and the chromosomal aberration test during the nonclinical stability test for the development of natural products. (FIG. 1A).
  • FIG. 1B As a result of testing the genotoxicity of the red bean flower extract, it was confirmed that there is no genotoxicity in both the reverse mutation test and chromosomal aberration test.
  • the inventors also compared the active ingredient of the red bean flower flower extract and the red bean tree stem and root extracts, the genkanin N and huahuacin was detected as an active ingredient in both the red bean flower flower extract and the red bean flower stem and root extract, As a result of quantifying the active ingredient, it was confirmed that the amount of genquanin N and yuanhuacin in the red bean flower flower extract was about 7.32 and 1.23 times more than the red bean stem and root extract, respectively (FIG. 2).
  • the present inventors fed a feed formulated with 6-OHDA-induced Parkinson's animal model, followed by apomorphine-induced rotatino test, and then fed a general feed. It was confirmed that the number of revolutions is significantly reduced compared to the control (Fig. 5).
  • sprout flower extract increases the activity of Nurr1 protein, thereby causing various diseases caused by damage to dopaminergic neurons that are directly affected by the activity of Nurr1 protein, such as Parkinson's disease and Parkinson's disease. It has been shown to be effective in the prevention or treatment of various neurodegenerative diseases caused by dysfunction of Nurr1.
  • the pharmaceutical composition comprising the red bean flower extract of the present invention or a fraction thereof as an active ingredient shows an effect on the activation of Nurr1 protein, induced by damage to dopaminergic neurons directly affected by the activity of Nurr1 protein. It can be seen that it is effective in preventing or treating various neurodegenerative diseases caused by various diseases such as Parkinson's disease and dysfunction of Nurr1 other than Parkinson's disease.
  • neurodegenerative disease refers to a disease associated with symptoms that occur when neurons degenerate, lose function, and die, and Parkinson's Disease (PD) and Alzheimer's disease AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease (HD), Frontotemporal Dementia, Cortico Basal Degeneration, progressive supranuclear palsy; PSP ).
  • PD Parkinson's Disease
  • AD Alzheimer's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • HD Huntington's disease
  • Frontotemporal Dementia Cortico Basal Degeneration, progressive supranuclear palsy
  • PSP progressive supranuclear palsy
  • the neurodegenerative disease according to the invention is Parkinson's disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient or fractions thereof described above.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • compositions of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to conventional methods. .
  • it may be prepared by using diluents or excipients such as fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants which are commonly used.
  • Solid form preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • Such solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like can also be used.
  • various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives and the like may be prepared.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base material of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • compositions of the invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, ie, in an amount sufficient to prevent or treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical prophylaxis or treatment.
  • Effective dose levels may include the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex of the patient, the sensitivity to the drug of the patient, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and rate of release, duration of treatment, Depending on the elements, including drugs used in combination or coincidental with the compositions of the present invention and other factors well known in the medical art, they may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dosage or dosage of the pharmaceutical composition comprising the red bean flower extract or fractions thereof according to the present invention as an active ingredient may vary depending on the patient's age, physical condition, weight, etc., but generally 0.01 to 1,000 mg / kg ( Weight) per day. In addition, within the effective daily dose range may be added once a day or divided several times a day.
  • the present invention is to provide a health functional food for the prevention or improvement of neurodegenerative diseases, including the red bean flower extract or fractions thereof.
  • health functional food used in the present invention means a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to Act No. 6767 of the Health Functional Food Act. It means ingestion for the purpose of obtaining useful effects on health use such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the red bean flower extract of the present invention or a fraction thereof When the red bean flower extract of the present invention or a fraction thereof is used as a food additive, the extract or a fraction thereof may be added to a food or beverage as it is or in combination with other food additives.
  • the amount thereof is not particularly limited, but is 1 to 5% by weight, preferably 1 to 3, based on the weight of the final food. It can be added in an addition amount of% by weight. However, in the case of long-term intake for health and hygiene or health control purposes, the addition amount may be below the above range, but may be used in an amount above the above range when there is no problem in terms of safety.
  • the kind of the food or drink is not particularly limited, but includes all the food or drink in a conventional sense, preferably meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, etc.
  • Dairy products including noodles, gums, ice creams, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes.
  • red bean flower extract or fractions thereof of the present invention When adding the red bean flower extract or fractions thereof of the present invention to food, various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH It may be added together with auxiliary ingredients such as regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols and the like.
  • the sweetener is not particularly limited, but may be a natural sweetener such as taumarin, stevia extract, or a synthetic sweetener such as saccharin, aspartame, and the like, and the natural carbohydrate is not particularly limited thereto.
  • Glucose, fructose, etc. can be used.
  • disaccharides e.g., maltose, sucrose, etc.
  • polysaccharides e.g., dextrin, cyclodextrin, etc.
  • sugar alcohols e.g., xylitol, sorbitol, erythritol, etc.
  • Red bean flower extract or fractions thereof of the present invention has been confirmed safety, health functional foods comprising the same may have the effect of preventing or improving the symptoms of neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising a red bean flower extract or a fraction thereof as an active ingredient. Provide a method.
  • the subject refers to an animal, and is typically a mammal that can exhibit a beneficial effect by treatment with the extract of the present invention.
  • Preferred examples of such subjects include primates, such as humans.
  • Such subjects also include all subjects with or at risk of neurodegenerative disease symptoms.
  • the present invention provides the use of the sorbus flower extract or fractions thereof for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides the use of the sorbus flower extract or fractions thereof for producing a medicament having a prophylactic or therapeutic effect of neurodegenerative diseases.
  • the pharmaceutical composition comprising the red bean flower extract of the present invention or a fraction thereof as an active ingredient exhibits an excellent effect on restoring the inhibition of Nurr1 protein activity due to neuronal damage without showing any adverse side effects. There is an excellent effect in the prevention or treatment of the neurodegenerative diseases caused.
  • Figure 1A shows the induction of the reverse mutation of the red bean stem and / or root extract
  • Figure 1B shows that the red bean flower extract does not cause the reverse mutation.
  • TA98 refers to Salmonella typhimurium TA98 strain
  • TA1535 refers to Salmonella typhimurium TA1535 strain
  • TA1537 refers to Salmonella typhimurium TA1537 strain.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the active ingredient of the sorbus flower extract by LC-MS / MS method.
  • A) are the standards DGH-1 (m / z 105.2> 591.2) and DGH-2 (m / z 105.1> 639.2), and in B) DGF-EX is the adzuki bean flower extract, DG-EX is the adzuki bean stem and And / or root extract.
  • Figure 3 is a graph showing the change of Nurr1 protein activity according to the concentration of the red bean flower extract through luciferase analysis.
  • Con-3ul means control (1% DMSO) (**: p ⁇ 0.01).
  • Figure 4 is a graph showing the results of comparative experiments showing the change of Nurr1 protein activity according to the concentration of the red bean stem and / or root extract and the red bean flower extract through luciferase analysis.
  • DG-EX means stalk and / or root extract
  • DGF-EX means stalk flower extract.
  • Figure 5 is a graph showing the results of the rotation test (rotation test) two weeks or four weeks after the grade of the red bean flower flower extract in 6-OHDA (6-hydroxydopamine) -induced Parkinson's disease animal model.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the change of dopaminergic neurons in the mesenchymal cerebral cortex after 4 weeks of feeding of red bean flower extract in 6-OHDA (6-hydroxydopamine) -induced Parkinson's disease animal model.
  • Figure 7 is a graph comparing the change of the number of dopaminergic neurons in the mesenchymal cerebral cortex after 4 weeks of feeding of the red bean flower extract in the 6-OHDA (6-hydroxydopamine) -induced Parkinson's disease animal model.
  • PBS was not injected with 6-OHDA
  • 6OHDA was injected with 6-OHDA
  • 6OD + 10 was injected with 10 mg / kg adzuki bean flower extract after 6-OHDA injection
  • 6OD + 50 was injected with 6-OHDA.
  • After 50 mg / kg means the group fed a red bean flower flower extract.
  • the dose setting test was conducted at 1,250, 313, 78.1 and 19.5 ⁇ g / plate at azeotropic ratio 4 below. .
  • growth inhibition by DG-EX was not less than 5,000 ⁇ g / plate of TA98 strain without metabolic activity, more than 313 ⁇ g / plate of TA100, TA1535 and TA1537 strain, and of TA100, TA1535 and TA1537 strain with metabolic activity. Observed at 5,000 ⁇ g / plate. No growth inhibition was observed in strains WP2uvrA (pKM101) without metabolic activity, and TA98 and WP2uvrA (pKM101) strains in the presence.
  • test substance DG-EX was not observed at all doses in the absence and presence of metabolic activity.
  • TA98, TA100, TA1535, TA1537, and WP2uvrA (pKM101) strains without metabolic activity were present in the test substance group, regardless of the presence or absence of metabolic activity.
  • the return variant colony number did not exceed twice the negative control, and no dose dependent increase was observed.
  • test substance DG-EX was found to be genetically mutagenic because the number of reverse mutation colonies in the TA1537 strain in the presence of metabolic activity increased by more than twice the negative control.
  • the chromosomal aberration test was performed in accordance with the guidelines of the KFDA at Biotoxtek, a GLP (Good Laboratory Practice) organization.
  • the structural chromosome induced by the chromosome CHL (Chinese Hamster Lung) / IU cells cultured in mammals using the chromosome of the structural abnormality induced was evaluated.
  • the cell proliferation inhibition test was performed at 2,500, 1,250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 and 19.5 ⁇ g / mL with the maximum dose of 5,000 ⁇ g / mL DG-EX.
  • Cell proliferation inhibition was calculated as a relative population doubling (RPD) after DG-EX treatment as an indicator of cell proliferation inhibition.
  • the dose that clearly inhibited cell proliferation by 50% or more was 1250 ⁇ g / mL or more in the absence and presence of the metabolic activity system of the short-term treatment, and 625 ⁇ g / mL or more in the absence of the metabolic activity system of the continuous treatment.
  • Precipitation of the test substance was observed above 2,500 ⁇ g / mL in the presence and absence of metabolic activity in the short-term treatment and in the absence of metabolic activity in the continuous treatment.
  • the occurrence frequency of abnormal number of cells at 450 and 900 ⁇ g / mL in the presence of the metabolic activity system of the short-term treatment was 12.5 and 13.0%, which was statistically increased compared to the negative control group (0%). It was.
  • the incidence of cells with structural abnormalities was 6.0 and 8.0%, which was significantly increased compared to the negative control group (0%) (data not shown).
  • the frequency of appearance of cells with structural abnormalities was more than 10% in the control group, which was significantly increased compared to the negative control group.
  • the occurrence frequency of abnormal number of cells at 900, 1,000, 1,100, and 1,200 ⁇ g / mL in the presence of the metabolic activity system of the short-term treatment was 12.5, 11.5, 10.0, and 8.5%, compared with the negative control group. Academically significant increase.
  • the incidence of cells with structural abnormalities was found to be 7.5, 7.0, 8.5 and 4.5%, which was significantly increased compared to the negative control.
  • Table 5 The results are shown in Table 5 below.
  • ctg chromatid gap
  • csg chromosome gap
  • ctb chromatid break
  • cte chromatid exchange
  • csb chromosome break
  • cse chromosome exchange
  • frg fragmentation
  • end endoreduplication
  • pol polyploidy
  • RPD Relative Population Doubling
  • Trt-Rec time Treatment-Recovery times
  • gap- Total number of cells with structural abnormalities except gap
  • gap + Total number of cells with structural abnormalities including gap Number
  • the test substance DG-EX has a frequency of at least 10% and a frequency of at least 5% and less than 10% of cells with abnormalities in the presence of metabolic activity in the short-term treatment method. It was confirmed that the cause of chromosomal aberrations.
  • the active ingredient of DGF-EX the red bean flower flower extract obtained in Example 1
  • the active ingredient of DG-EX which is the stalk and root extract obtained in Comparative Example 1-1, was also analyzed.
  • the stem and root extracts of the Azaleas have two active ingredients, DGH-1 and DGH-2.
  • DGH-1 has a very low UV extinction coefficient, which is used to analyze DGH-1 in the extract by HPLC UV method. Is very difficult. Therefore, LC-MS / MS multiple reaction monitoring (MRM) method was used to effectively analyze both DGH-1 and DGH-2.
  • MRM method detects parent ions with specific product ions and analyzes specific substances in complex samples.
  • each extract was dissolved in MeOH at a concentration of 10 ⁇ g / mL, and then 10 ⁇ l was HPLC and analyzed using LC-MS / MS using MRM.
  • the active ingredients DGH-1 and DGH-2 were detected in both the red bean flower extract (DGF-EX) and the stem root extract (DG-EX) (FIG. 2B).
  • Example 1 In order to confirm whether the DGF-EX obtained in Example 1, which is a test substance, is mutagenic, a histimin-required strain Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 and tryptophan-required strains A reverse mutation test was carried out using the Escherichia coli WP2uvrA (pKM101) strain in the presence (S9 +) and no (S9-) metabolic systems.
  • the maximum dose of this test In order to set the maximum dose of this test, the maximum dose of 5,000 ⁇ g / plate recommended in the guidelines was used, and the dose setting test was conducted at 1,250, 313, 78.1 and 19.5 ⁇ g / plate at azeotropic ratio 4 below.
  • test substance DGF-EX was 1250 ⁇ g / plate or more of TA98 and TA1535 strains without metabolic activity, 313 ⁇ g / plate or more of TA100 strain, 78.1 ⁇ g / plate or more of TA1537 strain, 5,000 ⁇ g / plate of the TA98 and TA1535 strains and 1250 ⁇ g / plate of the TA100 and TA1537 strains were observed. No growth inhibition was observed in WP2uvrA (pKM101) strains with and without metabolic activity.
  • test substance DGF-EX for all doses in the TA98, TA1535, TA1537 strains in the presence of metabolic activity did not return more than twice the negative control number, and was not mutagenic. Indicated.
  • test substance DGF-EX was not inducible to gene mutation under the present test conditions.
  • the chromosomal aberration test was performed in accordance with the Food and Drug Administration's guidelines at Biotoxtech, a GLP (Good Laboratory Practice) organization.
  • Example 1 In order to confirm whether the chromosome of DG-EX obtained in Example 1, which is a test substance, causes the structural abnormality, CHL (Chinese Hamster Lung) / IU cells, which are cultured mammalian cells, are used to determine the structural abnormality of chromosomes. Was evaluated.
  • CHL Choinese Hamster Lung
  • IU cells which are cultured mammalian cells
  • the maximum dose of the chromosome aberration test In order to set the maximum dose of the chromosome aberration test, the maximum dose of DGF-EX 5,000 ⁇ g / mL, the cell proliferation inhibition test at 2,500, 1,250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 and 19.5 ⁇ g / mL was carried out.
  • the dose that clearly inhibited cell proliferation by 50% or more was 625 ⁇ g / mL or more in the absence and presence of the metabolic activity system in the short-term treatment method and 156 ⁇ g / mL or more in the absence or presence of the metabolic activity system in the continuous treatment method.
  • a dose that inhibits about 55% cell proliferation was calculated.
  • the metabolic activity-free 428.3 ⁇ g / mL and 725 ⁇ g / mL present in the short-term treatment were 133.1 ⁇ g / mL without the metabolic activity in the continuous treatment.
  • ctg chromatid gap
  • csg chromosome gap
  • ctb chromatid break
  • cte chromatid exchange
  • csb chromosome break
  • cse chromosome exchange
  • frg fragmentation
  • end endoreduplication
  • pol polyploidy
  • MMC Mitomycin C
  • P Benzo [a] pyrene
  • RPD Relative Population Doubling
  • Trt-Rec time Treatment-Recovery times
  • gap- total number of cells with structural abnormality except gap
  • gap + structural abnormality including gap Total number of cells with
  • GAL4-LBD plasmid, luciferase plasmid that GAL4 can bind to, and beta-galactosidase were transfected into human-derived neuroblast BE (2) C cells.
  • DGF-EX was treated for 16 hours at concentrations of 1, 25 and 40 ppm.
  • the cells treated in this way were incubated in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. for 20 hours, and the extracts were dissolved in DMSO and treated with 1% DMSO, followed by luciferase fluorescence. 3 is shown.
  • DGF-EX significantly activated the Nurr1 protein at concentrations of 1 ppm and 25 ppm.
  • DGF-EX showed the maximum activity when treated at a concentration of 25 ppm, and showed about twice as much Nurr1 protein activation activity as the control.
  • DGF-EX showed 21, 23 and 120% higher activity at 1, 10 and 50 ppm, respectively, than DG-EX.
  • the red bean flower extract is apparent in rats fed the feed containing the rotational speed by apomorphine after 2 and 4 weeks even at low concentrations compared to the general concentrations of known red bean root extracts. It was confirmed to decrease.
  • Example 5 the therapeutic effect of the red bean flower flower extract on the Parkinson's animal model was confirmed. Subsequently, it was further investigated whether the dopaminergic neuron death was inhibited by the red bean flower flower administration in the substantia nigra area of the midbrain. .
  • Parkinson's disease animal model was prepared in the same manner as in Example 5, and rats were killed 4 weeks after surgery, and then perfused with 4% paraformaldehyde and brain was extracted.
  • the brain was made into sections of 40 ⁇ m thick by vibratome, followed by immunostaining with tyrosine hydroxylase antigen.
  • the flakes were treated with 3% hydrogen peroxide solution, washed three times with PBS, blocked with 5% horse serum at room temperature for 1 hour and then treated with tyrosine hydroxylase antigen at 4 ° C. overnight.
  • the sections were washed with PBS, treated with secondary anti-rabbit IgG, and then treated with avidin-biotinylated peroxidase complex and 3,3′-diaminobenzidine.
  • Dopaminergic neurons which were stained by color development, were observed under a microscope and the results are shown in FIG. 6, and the results were shown in FIG. 7 by counting the number of neurons.
  • 6-OHDA-injected left black matter (6-OHDA) and non-injected right-black area (unlesioned) are compared
  • 6-OHDA is injected in rats to which a normal feed (vehicle) is administered.
  • Dopaminergic neurons in one of the black areas was found to be significantly reduced compared to normal.
  • DGF red bean flower extract

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Abstract

본 발명은 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물과는 다르게 유전독성이 없으면서도 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 효과가 우수한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 팥꽃나무 꽃(Daphne genkwa flower) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)은 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 종종 사멸하는 경우의 증상들과 관련된다. 신경퇴행성 질환을 가진 환자들은 인지(cognitive) 또는 운동(motor) 능력에 있어서 극심한 퇴화를 겪을 수 있고, 이들 질환은 주로 진행성이기 때문에 결과적으로 그들의 삶의 질 및 삶에 대한 기대는 현저히 감소될 수 있다.
이들 질환은 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington’s disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP) 및 다른 질병들을 포함한다.
한편, 상당수의 신경퇴행성 질환에는 Nurr1(nuclear receptor related 1) 단백질이 관련된 것으로 알려져 있다. 상기 Nurr1은 NR4A2(nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2)라고도 알려져 있는 핵수용체 관련 1 단백질을 의미하며, 이는 사람의 NR4A2 유전자에 의해 암호화되는 것으로 알려져 있다. 상기 Nurr1 단백질은 고아 핵 수용체(orphan nuclear receptor)로서, 아직까지는 상기 Nurr1 단백질에 대한 리간드가 규명되어 있지 않지만, 뇌에서 도파민 시스템(dopaminergic system)을 유지하는 핵심적인 역할을 수행함이 규명되었다. 상기 Nurr1 또는 NR4A2 유전자에 이상이 발생하면, 도파민 시스템의 기능이 손상되어 파킨슨병을 유발시킬 뿐만 아니라, 류마티스 관절염, 정신분열증, 조울증 등의 광범위한 염증성 및 신경성 질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 상기 Nurr1의 기능장애에 의하여 유발되는 대표적인 신경퇴행성 질환은 파킨슨병이다.
파킨슨병은 떨림, 경직, 운동 완만 및 보행 이상증 등을 주된 증상으로 하는 현대 고령화 사회에 있어서 중요한 질환 중 하나로, 뇌의 흑색질(substantia nigra)과 선조체(corpus striatum) 부위에서 도파민(dopamin)이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이다.
이와 같은 파킨슨병의 치료를 위한 약물로는 엘-도파(L-dopa) 제제, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 엘데프릴(Eldepryl) 등이 알려져 있으며, 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것이므로 지속적인 약물의 복용을 필요로 한다. 지금까지 파킨슨병 치료제로 많은 약들이 만들어져 상용화되고 있으나, 파킨슨병을 완전히 치료하기 위한 본질적인 치료제는 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.
최근 도파민성 신경세포의 분화, 성장 및 유지에 중요한 역할을 하는 Nurr1 단백질의 기능을 활성화시켜주는 화합물들이 파킨슨병에 좋은 약효를 보여 파킨슨병 치료제의 질환 타겟으로 응용될 수 있다고 보고되고 있다.
본 출원인이 선출원한 국내특허등록 제10-1631589호에서는 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물이 Nurr1 단백질의 활성화에 관여하며, 파킨슨병 동물모델에 투여한 결과 파킨슨병의 증상이 완화되는 것을 확인한 바 있다.
그러나, 본 출원인이 선출원한 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물은 천연물 신약으로의 개발을 위한 비임상 안정성 시험 중 복귀돌연변이시험 및 염색체이상 시험에서 유전독성이 있음이 확인되었다.
이와 같은 문제점을 개선하고자, 본 발명자들은 한방에서 약재로 사용되고 있는 팥꽃나무 꽃이 유전독성은 없으면서도 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 더욱 효과적임을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
국내특허등록 제10-1631589호
본 발명의 목적은 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 팥꽃나무 꽃(Daphne genkwa flower) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘팥꽃나무(Daphne genkwa)’는 쌍떡잎식물 도금약목 팥꽃나무과의 낙엽관목을 의미하며, 조기꽃나무 또는 이팥나무라고도 한다. 팥꽃나무는 주로 바닷가 근처에서 성장하며, 한의학에서는 이뇨, 수종, 신장염 등의 증상을 치료하는데 사용된다. 팥꽃나무의 말린 꽃봉오리는 원화(花) 또는 완화(莞花)라 하며 약재로 사용하며 약간의 독성이 있는 것으로 알려져 있다. 공지된 바에 의하면, 팥꽃나무 꽃 추출물은 겐콰닌(genkwanin), 하이드록시겐콰닌(hydroxygenkwanin) 아피게닌(apigenin) 및 시토스테롤(sitosterol) 등을 포함하며, 그 외에도 벤조익산(benzoic acid)과 자극성의 정유 물질을 함유하고 있다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘팥꽃나무 꽃 추출물’은 팥꽃나무 꽃 또는 꽃봉오리로부터 수득한 추출물을 의미하며, 바람직하게는 팥꽃나무의 꽃 또는 꽃봉오리를 물 또는 유기용매로 추출하여 수득한 추출물을 의미하고, 구체적으로는 팥꽃나무의 꽃 또는 꽃봉오리를 물, C1 내지 C4의 저급 알킬알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득한 추출물을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 팥꽃나무 꽃 추출물은 바람직하게는 80% 에탄올로 추출한 추출물이다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 팥꽃나무 꽃 및/또는 꽃봉오리를 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C1 내지 C4 저급 알킬알코올 등의 유기용매, 또는 C1 내지 C4 저급 알킬알코올 수용액을 사용하여 팥꽃나무 꽃 추출물을 수득하였다. 상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 겐콰닌 N(Genkwanin N) 또는 유안후아신(Yuanhuacin)을 포함할 수 있다.
상기 겐콰닌 N은 하기 화학식 1로 표시되는 테르페노이드, 구체적으로는 다이테르펜 에스테르 화합물로서 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 바람직하게는 팥꽃나무 꽃 또는 꽃봉오리로부터 추출, 분리할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000001
상기 유안후아신은 하기 화학식 2로 표시되는 테르페노이드, 구체적으로는 다이테르펜 에스테르 화합물로서, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 바람직하게는 팔꽃나무 꽃 또는 꽃봉오리로부터 추출, 분리할 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000002
본 발명에서 사용된 용어 “분획물”이란 특정 용매를 사용하여 상기 팥꽃나무 꽃 추출물로부터 본 발명에서 목적으로 하는 활성을 가지는 물질을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 수득한 팥꽃나무 꽃 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올, 또는 증류수 등의 유기용매의 혼한용매를 이용하여 각 용매의 분획층을 분리하여 수득하고, 크로마토그래피 등의 당업계에 공지된 분리방법을 이용하여 활성성분을 고순도로 분리 정제하여 분획물을 제조할 수 있다. 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물도 본 발명의 분획물에 포함된다. 상기 팥꽃나무 꽃 추출물의 분획물은 겐콰닌 N(Genkwanin N) 또는 유안후아신(Yuanhuacin)을 포함할 수 있다.
본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라 통상적인 정제과정을 거친 추출물도 제한 없이 포함될 수 있다. 본 발명자들은 본 출원인이 선출원한 국내특허등록 제10-1631589호의 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물이 천연물 신약으로의 개발을 위한 비임상 안정성 시험 중 복귀돌연변이시험 및 염색체이상 시험에서 유전독성이 있음을 확인하였다(도 1A). 한편, 팥꽃나무 꽃 추출물의 유전독성을 시험한 결과, 복귀돌연변이시험 및 염색체이상 시험에서 모두 유전독성이 없음을 확인하였다(도 1B).
본 발명자들은 또한 팥꽃나무 꽃 추출물과 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물의 유효성분을 비교 분석한 결과 팥꽃나무 꽃 추출물과 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물 모두에서 유효성분으로 겐콰닌 N 및 유안후아신이 검출되었으며, 각 유효성분을 정량한 결과 팥꽃나무 꽃 추출물에서의 겐콰닌 N 및 유안후아신의 양이 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물에 비해 각각 약 7.32배 및 1.23배 많음을 확인하였다(도 2).
또한, 팥꽃나무 꽃 추출물과 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물의 Nurr1 단백질의 활성도를 비교 실험한 결과, 본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물이 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물보다 더 높은 활성을 보임을 확인하였다(도 4).
이에 더하여, 본 발명자들은 6-OHDA 유도성 파킨슨 동물모델에 팥꽃나무 꽃 추출물을 배합한 사료를 급이한 후 아포몰핀-유발 회전 테스트(apomorphine-induced rotatino test)를 한 결과 일반 사료를 급이한 대조군에 비해 회전수가 확연히 감소함을 확인할 수 있었다(도 5).
이와 같이, 본 발명자는 팥꽃나무 꽃 추출물이 Nurr1 단백질의 활성도를 증가시킴으로써 Nurr1 단백질의 활성에 직접적으로 영향을 받는 도파민성 신경세포의 손상에 의하여 유발되는 다양한 질환, 예를 들어 파킨슨병 및 파킨슨병 이외의 Nurr1의 기능장애에 의해 유발되는 다양한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 Nurr1 단백질의 활성화에 효과를 나타내므로, Nurr1 단백질의 활성에 직접적으로 영향을 받는 도파민성 신경세포의 손상에 의하여 유발되는 다양한 질환, 예를 들어 파킨슨병 및 파킨슨병 이외의 Nurr1의 기능장애에 의해 유발되는 다양한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타냄을 알 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “신경퇴행성 질환”이란 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 사멸하는 경우 나타나는 증상들과 관련된 질환을 의미하며, 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington’s disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)를 포함한다. 바람직하게 본 발명에 따른 신경퇴행성 질환은 파킨슨 병이다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 또는 이의 분획물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들어 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물의 투여량 또는 복용량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 0.01 ~ 1,000 mg/kg(몸무게)/1일 범위 내에서 투여하는 것이 바람직하다. 그리고, 1일 유효 투입량 범위 내에서 하루에 한 번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 “건강기능식품”은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, ‘기능성’이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 식품 첨가물로 사용하는 경우, 식품 또는 음료에 상기 추출물 또는 이의 분획물을 그대로 첨가하거나 또는 다른 식품 첨가물과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 식품 또는 음료의 제조시에 첨가할 경우, 이의 첨가량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종적인 식품의 중량에 대하여 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 1 내지 3 중량%의 첨가량으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에 첨가량은 상기 범위 이하일 수 있으나, 안전성 면에서 문제가 없는 경우 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
아울러, 상기 식품 또는 음료의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 통상적인 의미에서의 식품 또는 음료를 모두 포함하고, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 포함한다.
본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 식품에 첨가할 경우에는, 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등의 보조성분과 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 음료에 첨가할 경우에는, 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 감미제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 타우마린, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있고, 상기 천연 탄수화물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 단당류(예를 들어, 포도당, 과당 등), 이당류(예를 들어, 말토오스, 수크로오스 등), 다당류(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예를 들어, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물은 안전성이 확인되었고, 이를 포함하는 건강기능식품은 신경퇴행성 질환의 증상을 예방 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘팥꽃나무(Daphne genkwa)’, ‘팥꽃나무 꽃 추출물’, ‘분획물’, ‘신경퇴행성 질환’ 및 ‘투여’ 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 추출물을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유 동물이다. 이러한 대상체의 바람직한 예에는 인간과 같은 영장류가 포함된다. 또한 이와 같은 대상체들에는 신경퇴행성 질환 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함된다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물의 사용을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 약제를 생산하기 위한 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물의 사용을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘팥꽃나무(Daphne genkwa)’, ‘팥꽃나무 꽃 추출물’, ‘분획물’ 및 ‘신경퇴행성 질환’ 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물은 별다른 부작용을 나타내지 않으면서도 신경손상에 의한 Nurr1 단백질의 활성 억제를 회복시키는데 우수한 효과를 나타내므로, Nurr1 단백질의 활성 억제로 인해 유발되는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있다.
도 1A은 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물의 복귀돌연변이 유발을 나타내고, 도 1B은 팥꽃나무 꽃 추출물이 복귀돌연변이 유발성이 없음을 나타낸 것이다. TA98은 살모넬라 티피뮤리움(salmonella typhimurium) TA98 균주, TA1535는 티피뮤리움(salmonella typhimurium) TA1535 균주, TA1537은 티피뮤리움(salmonella typhimurium) TA1537 균주를 의미한다.
도 2는 LC-MS/MS 방법으로 팥꽃나무 꽃 추출물의 유효성분을 분석한 결과를 나타낸 것이다. A)는 표준물질 DGH-1(m/z 105.2>591.2) 및 DGH-2(m/z 105.1>639.2)이고, B)에서 DGF-EX는 팥꽃나무 꽃 추출물, DG-EX는 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물을 의미한다.
도 3은 팥꽃나무 꽃 추출물의 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도의 변화를 루시퍼라아제 분석을 통하여 나타낸 그래프이다. Con-3ul은 대조군(1% DMSO)을 의미한다 (** : p < 0.01).
도 4는 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물과 팥꽃나무 꽃 추출물의 각 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도의 변화를 루시퍼라아제 분석을 통하여 나타낸 비교실험결과를 나타낸 그래프이다. DG-EX는 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물, DGF-EX는 팥꽃나무 꽃 추출물을 의미한다.
도 5는 6-OHDA(6-hydroxydopamine) 유도성 파킨슨병 동물모델에서 팥꽃나무 꽃 추출물의 급이 2주 또는 4주 후의 회전 테스트(rotation test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 6-OHDA(6-hydroxydopamine) 유도성 파킨슨병 동물모델에서 팥꽃나무 꽃 추출물의 급이 4주 후 중뇌 흑질부에서의 도파민성 신경세포의 변화를 면역조직화학 분석으로 관찰한 도이다.
도 7은 6-OHDA(6-hydroxydopamine) 유도성 파킨슨병 동물모델에서 팥꽃나무 꽃 추출물의 급이 4주 후 중뇌 흑질부에서의 도파민성 신경세포의 수의 변화를 비교한 그래프이다. PBS는 6-OHDA를 주입하지 않은 군, 6OHDA는 6-OHDA 주입군, 6OD+10은 6-OHDA 주입 후 10 mg/kg 팥꽃나무 꽃 추출물을 급이한 군, 6OD+50은 6-OHDA 주입 후 50 mg/kg 팥꽃나무 꽃 추출물을 급이한 군을 의미한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물의 유전독성 시험
본 출원인이 선출원한 국내특허등록 제10-1631589호에 따른 팥꽃나무 줄기 및/또는 뿌리 추출물의 시험관 내(in vitro) 유전독성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 복귀돌연변이 실험 및 염색체이상 실험을 수행하였다.
1-1. 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물의 제조
팥꽃나무의 줄기 14 kg과 뿌리 6 kg을 세절한 다음, 120 L 80% 에탄올에 48시간 동안 침지하고, 여과하여 고형분과 1차 액상성분을 분리하였다. 상기 분리된 고형분을 다시 120 L 80% 에탄올에 24시간 동안 침지하고, 여과하여 2차 액상성분을 수득하였다. 상기 수득한 1차 액상성분과 2차 액상성분을 혼합하고, 상기 혼합물을 감압하에 농축시킨 다음, 잔사를 동결건조하여 1140.9 g의 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물(이하, 이를 “DG-EX”라 칭할 수 있다)을 제조하였다.
1-2. 복귀돌연변이 실험
팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물의 유전독성을 확인하기 위하여, GLP(Good Laboratory Practice) 기관인 ㈜바이오톡스텍에서 식약처 가이드라인에 근거하여 복귀돌연변이 시험을 수행하였다.
시험물질인 상기 1-1에서 수득한 DG-EX의 유전자 돌연변이 유발성 여부를 확인하기 위해, 히스티민 요구성 균주인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) TA98, TA100, TA1535, TA1537과 트립토판 요구성 균주인 대장균(Escherichia coli) WP2uvrA(pKM101)을 이용하여 대사활성계 존재(S9+) 및 비존재(S9-) 하의 경우에 대해 복귀돌연변이 시험을 실시하였다.
(1) 용량설정시험
본 시험인 복귀돌연변이시험의 최고용량을 설정하기 위해, 가이드라인에서 추천하는 5,000 μg/plate를 최고용량으로 하고, 이하 공비 4로 1,250, 313, 78.1 및 19.5 μg/plate로 용량설정시험을 실시하였다.
그 결과, DG-EX에 의한 생육저해가 대사활성계 비존재하의 TA98 균주의 5,000 μg/plate, TA100, TA1535 및 TA1537 균주의 313 μg/plate 이상, 대사활성계 존재하의 TA100, TA1535 및 TA1537 균주의 5,000 μg/plate에서 관찰되었다. 대사활성계 비존재하의 WP2uvrA(pKM101) 균주, 존재하의 TA98 및 WP2uvrA(pKM101) 균주에서는 생육저해가 관찰되지 않았다.
따라서, 본 시험인 복귀돌연변이시험의 용량은 하기 표1과 같이 설정하였다. 또한, 음성대조군 및 양성대조군을 설정하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000003
시험물질인 DG-EX의 침전은 대사활성계 비존재하 및 존재하의 모든 용량에서 관찰되지 않았다.
(2) 복귀돌연변이시험
각 균주들에 시험물질 DG-EX를 상기 농도별로 처리하여 배양한 후, 복귀변이콜로니수를 육안 계수하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000004
S.D: Standard Deviation
*: 성장 억제를 나타냄
그 결과, 대사활성계 존재하의 TA1537 균주의 1,250 μg/plate에서는 복귀변이 콜로니수가 음성대조군과 비교하여 2배 이상 재현성 있게 증가하였고, 2,500 μg/plate 이상에서는 DG-EX에 의한 생육저해가 관찰되어 복귀변이 콜로니수가 감소하는 경향이 관찰되었다.
대사활성계 비존재하의 TA98, TA100, TA1535, TA1537 및 WP2uvrA(pKM101) 균주와 대사활성계 존재하의 TA98, TA100, TA1535 및 WP2uvrA(pKM101) 균주에서는 시험물질군에서 대사활성계의 유무에 관계없이 각 균주의 모든 용량에 대하여 복귀변이 콜로니수는 음성 대조군의 2배를 초과하지 않았고, 용량의존적인 증가도 관찰되지 않았다.
각 균주에 대한 양성대조군의 복귀변이콜로니수는 음성대조군과 비교하여 2배 이상 확실하게 증가하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1A에 나타난 바와 같이, 본 시험조건 하에서 시험물질 DG-EX는 대사활성계 존재하의 TA1537 균주에서 복귀돌연변이콜로니수가 음성대조군의 2배 이상 증가하여 유전자 돌연변이 유발성이 있는 것으로 판정되었다.
1-3. 염색체이상 실험
팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물의 유전독성을 확인하기 위하여, GLP(Good Laboratory Practice) 기관인 ㈜바이오톡스텍에서 식약처 가이드라인에 근거하여 염색체이상 시험을 수행하였다.
시험물질인 상기 1-1에서 수득한 DG-EX의 염색체의 구조적 이상 유발성 여부를 확인하기 위해, 포유류의 배양세포주인 CHL(Chinese Hamster Lung)/IU 세포를 사용하여 염색체의 구조적 이상 유발성의 유무를 평가하였다.
(1) 세포증식억제시험
본 시험인 염색체이상시험의 최고용량 설정을 위해, DG-EX 5,000 μg/mL를 최고용량으로 하여 이하 2,500, 1,250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 및 19.5 μg/mL로 세포증식억제시험을 실시하였다. 세포증식억제는 DG-EX 처리 후 상대세포증가수(relative population doubling, RPD)를 산출하여 세포증식 억제의 지표로 하였다.
그 결과, 대사활성계 비존재하 및 존재하, 연속처리법의 대사활성계 비존재하에서 세포독성이 관찰되었다. 세포증식을 명확하게 50% 이상 억제하는 용량은 단시간처리법의 대사활성계 비존재하 및 존재하의 1,250 μg/mL 이상, 연속처리법의 대사활성계 비존재하의 625 μg/mL 이상이었다.
따라서, 본 시험의 용량은 하기 표 3과 같이 설정하였다. 또한, 음성대조군 및 양성대조군을 설정하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000005
시험물질의 침전은 단시간처리법의 대사활성계 비존재하 및 존재하, 연속처리법의 대사활성계 비존재하의 2,500 μg/mL 이상에서 관찰되었다.
(2) 염색체이상시험
염색체이상시험 결과, 단시간처리법의 대사활성계 존재하의 450 및 900 μg/mL에서 수적이상을 가진 세포의 출현빈도가 12.5 및 13.0%로, 음성대조군(0%)과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 구조이상을 가진 세포의 출현빈도는 6.0 및 8.0%로, 음성대조군(0%)과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다(데이터 미도시).
단시간처리법의 대사활성계 비존재하 및 연속처리법의 대사활성계 비존재하에서는 염색체이상을 가진 세포의 출현빈도는 5% 미만으로 염색체이상 유발작용은 확인되지 않았으며, 음성대조군과 비교시 통계적인 유의성도 관찰되지 않았다.
각 처리계열에 대한 양성대조군에서는 구조이상을 가진 세포의 출현빈도는 10% 이상으로, 음성대조군과 비교시 통계학적으로 유의하게 증가하였다.
이에 따라, 단시간처리법의 대사활성계 존재하의 구조이상에 대한 의양성 결과를 명확히 하기 위하여, 하기 표 4의 용량으로 본 시험과 동일한 방법으로 확인시험을 실시하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000006
확인시험 결과, 단시간처리법의 대사활성계 존재하의 900, 1,000, 1,100 및 1,200 μg/mL에서 수적이상을 가진 세포의 출현빈도는 12.5, 11.5, 10.0 및 8.5%로 확인되었으며, 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 구조이상을 가진 세포의 출현빈도는 7.5, 7.0, 8.5 및 4.5%로 확인되었으며, 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000007
약어: ctg: chromatid gap, csg: chromosome gap, ctb: chromatid break, cte :chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange, frg: fragmentation, end: endoreduplication, pol: polyploidy, B[a]P: Benzo[a]pyrene, RPD: Relative Population Doubling, Trt-Rec time: Treatment-Recovery times, gap-: gap을 제외한 구조이상을 가지는 세포의 총 수, gap+: gap을 포함하는 구조이상을 가지는 세포의 총 수
a): 염색체 이상을 가지는 세포수로부터 제외된 것들
*: p<0.01, #: p<0.05, ##: p<0.01
이상의 결과로부터, 본 시험조건 하에서 시험물질 DG-EX는 단시간처리법의 대사활성계 존재하에서 수적 이상을 가진 세포의 출현빈도가 10% 이상, 구조이상을 가진 세포의 출현빈도가 5% 이상 10% 미만으로 확인되어 염색체 이상 유발성이 있는 것으로 판정되었다.
실시예 1: 팥꽃나무 꽃 추출물의 제조
팥꽃나무의 꽃 부위 3.5 kg을 70 L의 80% 에탄올에 48시간 동안 침지하고, 여과하여 고형분과 1차 액상성분을 분리하였다. 상기 분리된 고형분을 다시 70 L의 80% 에탄올에 24시간 동안 침지하고, 여과하여 2차 액상성분을 수득하였다. 상기 수득한 1차 액상성분과 2차 액상성분을 혼합하고, 상기 혼합물을 감압하에 농축시킨 다음, 잔사를 동결건조하여 859 g의 팥꽃나무 꽃 추출물(이하, 이를 “DGF-EX”라 칭할 수 있다)을 제조하였다.
실시예 2: 팥꽃나무 꽃 추출물의 유효성분 분석
상기 실시예 1에서 수득한 팥꽃나무 꽃 추출물인 DGF-EX의 유효성분을 분석하였다. 비교를 위하여 상기 비교예 1-1에서 수득한 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물인 DG-EX의 유효성분 또한 함께 분석하였다.
팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물에는 DGH-1과 DGH-2의 두 개의 유효성분이 있는데, 이중 DGH-1은 UV 흡광 계수(UV extinction coefficient)가 매우 낮아 HPLC UV 방법으로 추출물에 있는 DGH-1를 분석하기가 매우 어렵다. 따라서, 추출물에서 유효물질 DGH-1 과 DGH-2 모두를 효과적으로 분석하기 위하여 LC-MS/MS의 MRM(multiple reaction monitoring)방법으로 분석하였다. MRM 방법은 특정 생성 이온(product ion)을 갖는 어미 이온(parent ion)을 검출하는 방법으로 복잡한 시료에서 특정 물질을 분석하는 방법이다.
그 결과, 표준물질 DGH-1 와 DGH-2 화합물은 각각 3.81분, 6.99분에 검출되었고, 0.1 ug 주입 시 각각 1.05 x 104, 1.8 x 104 세기(intensity)를 보여 비슷한 민감도로 MRM방법으로 검출되었다 (도 2A).
또한, 각 추출물을 10 μg/mL 농도로 MeOH에 녹인 후 10 μl를 HPLC한 다음, MRM 방식의 LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 팥꽃나무 꽃 추출물(DGF-EX) 과 줄기뿌리 추출물 (DG-EX) 모두에서 유효성분 DGH-1 과 DGH-2 가 검출되었다(도 2B).
실시예 3: 팥꽃나무 꽃 추출물의 유전독성 시험
상기 실시예 1에서 수득한 팥꽃나무 꽃 추출물의 시험관 내(in vitro) 유전독성을 확인하기 위하여, 하기와 같이 복귀돌연변이 실험 및 염색체이상 실험을 수행하였다.
3-1. 복귀돌연변이 실험
팥꽃나무 꽃 추출물의 유전독성을 확인하기 위하여, GLP(Good Laboratory Practice) 기관인 ㈜바이오톡스텍에서 식약처 가이드라인에 근거하여 복귀돌연변이 시험을 수행하였다.
시험물질인 상기 실시예 1에서 수득한 DGF-EX의 유전자 돌연변이 유발성 여부를 확인하기 위해, 히스티민 요구성 균주인 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) TA98, TA100, TA1535, TA1537과 트립토판 요구성 균주인 대장균(Escherichia coli) WP2uvrA(pKM101) 균주를 이용하여 대사활성계 존재(S9+) 및 비존재(S9-) 하의 경우에 대해 복귀돌연변이 시험을 실시하였다.
(1) 용량설정시험
본 시험의 최고용량을 설정하기 위해, 가이드라인에서 추천하는 5,000 μg/plate를 최고용량으로 하고, 이하 공비 4로 1,250, 313, 78.1 및 19.5 μg/plate로 용량설정시험을 실시하였다.
그 결과, 시험물질 DGF-EX에 의한 생육저해가 대사활성계 비존재하의 TA98 및 TA1535 균주의 1,250 μg/plate 이상, TA100 균주의 313 μg/plate 이상, TA1537 균주의 78.1 μg/plate 이상, 존재하의 TA98 및 TA1535 균주의 5,000 μg/plate, TA100 및 TA1537 균주의 1,250 μg/plate 이상에서 관찰되었다. 대사활성계 비존재하 및 존재하의 WP2uvrA(pKM101) 균주에서는 생육저해가 관찰되지 않았다.
따라서, 본 시험인 복귀돌연변이시험의 용량은 하기 표 6과 같이 설정하였다. 또한, 음성대조군 및 양성대조군을 설정하였다.
[표 6]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000008
(2) 복귀돌연변이시험
각 균주들에 시험물질 DGF-EX를 상기 농도별로 처리하여 배양한 후, 복귀변이콜로니수를 육안 계수하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000009
S.D: Standard Deviation
*: 성장 억제를 나타냄
그 결과, 시험물질군에서 대사활성계의 유무에 관계없이 각 균주의 모든 용량에 대하여 복귀변이 콜로니수는 음성 대조군의 2배를 초과하지 않았고, 용량의존적인 증가도 관찰되지 않았다. 양성 대조군에서는 각 균주의 복귀변이 콜로니수가 음성 대조군과 비교하여 2배 이상 확실하게 증가하였다. 이를 도 1에 나타내었다.
도 1B에 나타낸 바와 같이, 시험물질 DGF-EX는 대사활성계 존재하의 TA98, TA1535, TA1537 균주에서 모든 용량에 대하여 복귀변이 콜로니수는 음성 대조군의 2배를 초과하지 않았고, 돌연변이 유발성이 없음을 나타내었다.
시험물질에 의한 생육저해가 대사활성계 비존재하의 TA98 및 TA1535 균주의 625 μg/plate 이상, TA100 균주의 156 μg/plate 이상, TA1537 균주의 87.1 μg/plate, 존재하의 TA98 및 TA1535 균주의 2,500 μg/plate 이상, TA100 균주의 1,250 μg/plate, TA1537 균주의 625 μg/plate 이상에서 관찰되었다. 대사활성계 비존재하 및 존재하의 WP2uvrA(pKM101) 균주에서는 생육저해가 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터, 본 시험 조건하에서 시험물질 DGF-EX는 유전자돌연변이 유발성이 없는 것으로 판정되었다.
3-2. 염색체이상 실험
팥꽃나무 꽃 추출물의 유전독성을 확인하기 위하여, GLP(Good Laboratory Practice) 기관인 ㈜바이오톡스텍에서 식약처 가이드라인에 근거하여 염색체이상 시험을 수행하였다.
시험물질인 상기 실시예 1에서 수득한 DG-EX의 염색체의 구조적 이상 유발성 여부를 확인하기 위해, 포유류의 배양세포주인 CHL(Chinese Hamster Lung)/IU 세포를 사용하여 염색체의 구조적 이상 유발성의 유무를 평가하였다.
(1) 세포증식억제시험
본 시험인 염색체이상시험의 최고용량 설정을 위해, DGF-EX 5,000 μg/mL를 최고용량으로 하고, 이하 2,500, 1,250, 625, 313, 156, 78.1, 39.1 및 19.5 μg/mL로 세포증식억제시험을 실시하였다.
그 결과, 대사활성계 비존재하 및 존재하, 연속처리법의 대사활성계 비존재하에서 세포독성이 관찰되었다. 세포증식을 명확하게 50% 이상 억제하는 용량은 단시간처리법의 대사활성계 비존재하 및 존재하의 625 μg/mL 이상, 연속처리법의 대사활성계 비존재하의 156 μg/mL 이상이었다. 약 55% 세포증식을 억제하는 용량을 산출한 결과, 단시간처리법의 대사활성계 비존재하는 428.3 μg/mL 및 존재하는 725 μg/mL, 연속처리법의 대사활성계 비존재하는 133.1 μg/mL이었다.
따라서, 본 시험의 용량은 하기 표 8과 같이 설정하였다. 또한, 음성 대조군 및 양성 대조군을 설정하였다.
[표 8]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000010
(2) 염색체이상시험
염색체이상시험 결과, 단시간처리법의 대사활성계 비존재하 및 존재하, 연속처리법의 대사활성계 비존재하의 염새체 이상을 가진 세포의 출현빈도는 5% 미만으로, 염색체이상 유발작용은 확인되지 않았으며, 음성대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 각 처리군에 대한 양성 대조군에서는 구조이상을 가진 세포의 출현빈도는 10% 이상으로, 음성대조군과 비교시 통계적으로 유의하게 증가하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
[표 9]
Figure PCTKR2017012790-appb-I000011
약어: ctg: chromatid gap, csg: chromosome gap, ctb: chromatid break, cte :chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange, frg: fragmentation, end: endoreduplication, pol: polyploidy, MMC: Mitomycin C, B[a]P: Benzo[a]pyrene, RPD: Relative Population Doubling, Trt-Rec time: Treatment-Recovery times, gap-: gap을 제외한 구조이상을 가지는 세포의 총 수, gap+: gap을 포함하는 구조이상을 가지는 세포의 총 수
a): 염색체 이상을 가지는 세포수로부터 제외된 것들
*: p<0.01
이상의 결과로부터, 본 시험조건하에서 시험물질 DGF-EX의 염색체이상 유발성은 음성으로 판정되었다.
실시예 4: Nurr1 단백질 활성에 대한 팔꽃나무 꽃 추출물의 효과 확인
상기 실시예 1에서 수득한 DGF-EX의 Nurr1 단백질 활성화 효과를 확인하기 위하여, GAL4 검정 시스템(GLA4 assay system)을 이용하여 Nurr1 단백질 활성 실험을 수행하였다.
GAL4-LBD 플라스미드, GAL4가 결합할 수 있는 루시퍼라아제(luciferase) 플라스미드 및 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 인간유래 신경모세포(neuroblast)인 BE(2)C 세포에 형질주입한 후, DGF-EX를 1, 25 및 40 ppm의 농도로 16시간 동안 처리하였다. 이렇게 처리한 세포를 20시간동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 추출물은 DMSO에 녹여 처리하고, 대조군에는 1% DMSO를 처리한 후 루시퍼라아제 형광분석을 수행하였다.. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, BE(2)C 세포에서 DGF-EX에 의해 Nurr1 단백질의 활성이 증가함을 확인하였다. DGF-EX는 1 ppm 및 25 ppm의 농도에서 Nurr1 단백질을 의미있게 활성화시켰다. 특히, DGF-EX는 25 ppm의 농도로 처리하였을 때 최대 활성을 나타내었으며, 대조군 대비 약 2배 이상의 Nurr1 단백질 활성화 활성을 나타내었다.
또한, DGF-EX와 상기 비교예 1에서 수득한 DG-EX의 Nurr1 단백질 활성을 상기와 같은 방법으로 비교하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, DGF-EX은 DG-EX 보다 1, 10 및 50 ppm에서 각각 21, 23, 120% 높은 활성을 보였다.
실시예 5: 파킨슨병 동물모델에서의 팥꽃나무 꽃 추출물의 효과 확인
팥꽃나무 꽃 추출물이 파킨슨병 동물모델에 미치는 영향을 확인하기 위하여 본 시험을 수행하였다.
중뇌의 흑질 부위에 존재하는 도파민성 신경세포를 특이적으로 사멸시키기 위하여, 실험군으로 18마리의 6주령의 SD rat(코아텍 사)에 정위고정성 도구(stereotaxic tool)를 이용하여 뇌의 AP(-4.3), ML(-1.8), DV(-8.2) 부위와 AP(-5.0), ML(-1.8), DV(-8.2) 부위에 6-OHDA(0.2 μg/μl, final volume 5μl)를 직접 주입하여 파킨슨병 동물모델을 제작하였다. 상기 6-OHDA 투여 30분 전에 데시프라민(desipramine)을 25 mg/kg의 용량으로 투여함으로써 도파민성 신경세포 이외의 세포사는 억제시켰다. 또한, 대조군으로 6마리의 6주령의 SD rat(코아텍 사)에 6-OHDA 대신 PBS를 주입하였다.
6-OHDA를 주입한 18마리 중 6마리에게는 일반 사료를 주었고(대조군), 6마리에게는 팥꽃나무 꽃 추출물의 1일 투여량이 50 mg/kg이 되도록 배합된 사료, 나머지 6마리에게는 팥꽃나무 꽃 추출물의 1일 투여량이 100 mg/kg이 되도록 배한된 사료를 급이시켰다.
수술 후 2주 및 4주째에 회전 테스트(rotation test)를 수행하였다. 도파민 수용체 작용물질인 아포몰핀(apomorphine)을 파킨슨병 동물모델에 주사하면 도파민의 신경제거성 초과민증(denervation supersensitivity)에 의하여 병변 반대측으로의 회전이 유발되며, 이는 회전운동 측정기(rotometer)를 이용하여 정량적으로 측정이 가능하다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 팥꽃나무 꽃 추출물은 알려진 팥꽃나무 뿌리 추출물의 일반적 투여 농도들과 대비하여 저농도로 투여하여도 2주 및 4주 후의 아포몰핀에 의한 회전수가 포함된 사료를 먹인 쥐에서 확연히 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 6: 파킨슨병 동물모델에서의 팥꽃나무 꽃 추출물의 효과의 면역조직화학 분석
상기 실시예 5에서 팥꽃나무 꽃 추출물의 파킨슨 동물모델에 대한 치료효과를 확인한데 이어서, 실제로 중뇌의 흑질 (substantia nigra) 부위에서 도파민성 신경세포의 사멸이 팥꽃나무 꽃 추출물 투여로 억제되었는지 추가적으로 조사하였다.
상기 실시예 5와 동일하게 파킨슨병 동물모델을 제조한 뒤, 수술 후 4주째에 rat를 죽인 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 관류(perfusion)한 다음 뇌를 적출하였다. 바이브라톰(vibratome)으로 상기 뇌를 두께 40μm 박편(section)을 만든 다음, 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase) 항원으로 면역염색(immunostaining)을 실시하였다. 상기 박편을 3% 과산화 수소액으로 처리하고 PBS로 3회 세척한 후, 5% 말 혈청(horse serum)으로 1시간 상온에서 블로킹 한 다음 티로신 수산화효소 항원을 4℃에서 밤새 처리 하였다. 상기 박편(section)을 PBS로 세척 후 2차 anti-rabbit IgG를 처리한 다음 avidin-biotinylated peroxidase complex와 3,3‘-다이아미노벤지딘을 처리하였다. 발색하여 염색된 도파민성 신경세포를 현미경 아래서 관찰하여 그 결과를 도 6에 나타내었고, 신경세포 수를 카운팅하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 6-OHDA를 주입한 왼쪽 흑질 (6-OHDA) 과 주입하지 않은 오른쪽 흑질 부위 (unlesioned)를 비교하면, 일반 사료 (vehicle)를 투여한 rat의 경우 6-OHDA를 주입한 흑질 부위에서의 도파민성 신경세포가 정상 흑질과 비교하여 현저히 감소됨을 확인하였다. 그러나, 팥꽃나무 꽃 추출물(DGF)을 10 mg/kg 와 50 mg/kg로 투여한 경우, 6-OHDA를 주입한 흑질에서도 정상 흑질 부위와 유사한 수준의 신경세포가 유지됨을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 6-OHDA를 주입한 결과, 97.5%의 도파민성 신경세포가 사멸되었으나, 팥꽃나무 꽃 추출물(DGF)을 10 mg/kg 및 50 mg/kg 투여시 도파민성 신경세포의 사멸이 현저히 억제(각각 39.6% 및 70.1% 사멸)됨을 확인하였다.
이를 통해, 꽃나무 꽃 추출물(DGF)이 6-OHDA에 의한 도파민성 신경세포 사멸을 강력히 억제하고 있음을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. 팥꽃나무 꽃(Daphne genkwa flower) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 C1 내지 C4 저급 알킬알코올 수용액으로 추출된, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 에탄올 추출물인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항이 있어서,
    상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 겐콰닌 N(Genkwanin N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine)을 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington’s disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 팥꽃나무 꽃(Daphne genkwa flower) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 C1 내지 C4 저급 알킬알코올 수용액으로 추출된, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 에탄올 추출물인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 팥꽃나무 꽃 추출물은 겐콰닌 N(Genkwanin N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine)을 유효성분으로 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington’s disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration) 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 팥꽃나무 꽃(Daphne genkwa flower) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료방법.
  14. 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 약제를 생산하기 위한 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물의 사용.
  15. 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 팥꽃나무 꽃 추출물 또는 이의 분획물의 사용.
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