WO2012138034A1 - 팥꽃나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

팥꽃나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2012138034A1
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disease
formula
pharmaceutical composition
extract
nurr1
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김원곤
한백수
김경심
김광수
강영미
김유진
김천형
손미진
정회윤
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한국생명공학연구원
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention is a gendewanin N (Genkwanine N) or Yuanhuacine (Yuanhuacine), a degenerative tree extract containing one or more of the compounds or fractions thereof as a active ingredient neurodegenerative diseases or disorders caused by Nurr1 dysfunction Prophylactic or therapeutic pharmaceutical compositions, or Nurr1 activating compositions, Genkwanine N or Yuanhuacine, neurodegenerative diseases or Nurr1 function, including azalea extract or fractions thereof comprising one or more of the above compounds
  • a functional food additive for preventing or ameliorating a disease caused by a disorder and a method for preventing or treating a neurodegenerative disease or a disease caused by a Nurr1 dysfunction, comprising administering the pharmaceutical compositions.
  • Neurodeegenerative diseases are associated with symptoms when neurons degenerate, lose function, and often die. Because they are mainly progressive, the consequences of neurodegenerative diseases are often very devastating. Patients with neurodegenerative diseases may experience severe degeneration in cognitive or motor skills. As a result, their quality of life and expectations for life can be significantly reduced. In humans, these diseases include Parkinson's disease (PD), Alzheimer's disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease (HD), and frontal lobe dementia (Fronto-Temporal). Dementia, Cortico Basal Degeneration, progressive supranuclear palsy (PSP), and other diseases.
  • PD Parkinson's disease
  • AD Alzheimer's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • HD Huntington's disease
  • PGP progressive supranuclear palsy
  • Nurr1 refers to a nuclear receptor related 1 protein, also known as NR4A2 (nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), which is known to be encoded by the human NR4A2 gene.
  • NR4A2 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
  • the Nurr1 protein is an orphan nuclear receptor and a ligand for the protein has not yet been identified, the Nurr1 is a protein belonging to the nuclear receptor family of intracellular transcription factors. It has been found to play a key role in maintaining the dopaminergic system.
  • the abnormality in the Nurr1 or NR4A2 gene is known to impair the function of the dopamine system to cause Parkinson's disease, as well as to cause a wide range of inflammatory and neurological diseases such as rheumatoid arthritis, schizophrenia, and manic depression.
  • Parkinson's disease which is a representative neurodegenerative disorder caused by dysfunction of Nurr1
  • Dopamine is an important chemical for transmitting signals between cells to facilitate the body's movement. Motor disease symptoms such as tremor, rigidity, bradykinesia, postural instability and impaired speech are caused. The cause of damage to dopamine-producing cells is not clear. However, metabolic and traumatic encephalitis sequelae, such as atherosclerosis of the brain, carbon monoxide poisoning, drugs and hypothyroidism, have been studied.
  • long-term administration of these drugs causes problems with drug side effects.
  • anticholinergic drugs may show autonomic nervous system abnormalities or mental dysfunctions, and thus are limited to continuous administration to older patients.
  • the effect gradually decreases according to the long-term administration, and the side effects such as twisting the body and abnormal movements of the hands or feet are generated.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-0081188 discloses a composition for preventing and treating neurological diseases such as Parkinson's disease, which includes the extract of Scutellariae Radix having a neuroprotective effect as an active ingredient, and brain diseases, including senile dementia.
  • Patent Publication No. 2004-0012396 discloses a composition for treating degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and stroke, which includes extracts of Beauveria Bassiana 101A, and Patent Publication No. 2004-0029072.
  • a pharmaceutical composition for treating Parkinson's disease comprising an extract obtained from the guangguo (wenguanguo) peel
  • Patent Publication No. 2010-0060123 discloses a pharmaceutical for the prevention or treatment of Parkinson's disease, including ginger extract or shogaol
  • the composition is disclosed
  • Patent Publication No. 2010-0060949 discloses the prevention or prevention of diseases such as Parkinson's disease comprising peach leaf extract as an active ingredient
  • a composition for protecting nerve cells used in the treatment is disclosed
  • Patent Publication No. 2011-0013466 discloses is a pharmaceutical composition for treating Parkinson's Disease disclosed comprising at least one compound derived from grape seed extract or an active ingredient therefrom.
  • the components derived from these natural products have no side effects and have a disadvantage in that the treatment efficiency of Parkinson's disease is low.
  • One object of the present invention is at least one terpenoid compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by the formula (1) and Yuanhuacine represented by the formula (2), or a pharmaceutical thereof To an acceptable salt, or to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases (neurodegenerative diseases) comprising a red bean flower extract or fractions thereof comprising any one or more of the above compounds as an active ingredient.
  • neurodegenerative diseases neurodegenerative diseases
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease caused by Nurr1 dysfunction, comprising a red bean flower extract, a fraction thereof or a compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a Nurr1 activating composition
  • a Nurr1 activating composition comprising an adzuki bean extract, a fraction thereof or a compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient.
  • Yet another object of the present invention is at least one terpenoid compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or It is to provide a functional food additive for the prevention or improvement of neurodegenerative diseases comprising a bean extract or fractions thereof comprising any one or more compounds as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is a terpenoid compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or a pharmaceutically acceptable thereof. It provides a method for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising administering a possible salt, or a pharmaceutical composition comprising a red bean flower extract or a fraction thereof comprising the compound of any one or more of the above compounds as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to prevent the disease caused by Nurr1 dysfunction comprising the step of administering a pharmaceutical composition comprising a red bean flower extract, a fraction thereof or a compound represented by the formula (1) or (2) as an active ingredient or To provide a method of treatment.
  • Aspen extract of the present invention or a compound isolated therefrom is a natural-derived compound, Parkinson's caused by inhibiting the activity of Nurr1 protein by showing an excellent effect in restoring the inhibition of Nurr1 protein activity by neuronal damage without showing any side effects Neurodegenerative diseases, including disease, can be prevented or treated.
  • Figure 1 is a graph showing the change of Nurr1 protein activity according to the concentration of methanol extract of Azalea through Luciferase analysis.
  • Figure 2 is a graph showing the inhibitory effect of the concentration of sorbus extract on neuronal cell death induced by 6-OHDA (6-hydroxydopamine).
  • Figure 3 is a graph showing the therapeutic effect of the bean extract methanol extract in Parkinson's animal model.
  • Figure 4 is a graph showing the Nurr1 protein activity change by the various solvent extracts of the red bean flower.
  • Figure 5 is a graph showing the increase in Nurr1 protein activity according to the concentration of Genkwanine N and Yuanhuacine compound isolated from the extract of the Red Beanstalk.
  • the present invention is a terpenoid compound (terpenoid) selected from the group consisting of Genkwanine N represented by the formula (1) and Yuanhuacine represented by the formula (2)
  • terpenoid selected from the group consisting of Genkwanine N represented by the formula (1) and Yuanhuacine represented by the formula (2)
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a red bean flower extract or fractions thereof comprising any one or more of the above compounds as an active ingredient. do.
  • Genkwanine N of the present invention is a terpenoid represented by Formula 1, specifically, a diterpene ester compound, and may be prepared according to a method known to those skilled in the art.
  • Genkwanine N can be isolated and purified from plants known in the art using polar or nonpolar solvents.
  • commercially available compounds may be purchased or synthesized. Preferably it can be extracted and separated from the red bean.
  • Yuanhuacine of the present invention is a terpenoid represented by Formula 2, specifically, a diterpene ester compound, and may be prepared according to a method known to those skilled in the art.
  • Yuanhuacine can be isolated and purified from plants known in the art using polar or nonpolar solvents.
  • commercially available compounds may be purchased or synthesized. Preferably it can be extracted and separated from the red bean.
  • Diaphne genkwa refers to a deciduous shrub of the dicotyledon plant plated cedar. It is also known as early flowering tree and red bean tree, and it grows mainly near the beach. In Oriental medicine, it is used to treat symptoms such as diuresis, species, and nephritis.
  • the term "Adzuki bean extract” refers to an extract obtained from adzuki bean, preferably an extract obtained from a stem or root of adzuki bean, and more preferably, a stem or root of adzuki bean.
  • the sorbus extract is largely composed of five kinds of compounds of coumarins, flavonoids, lignans, terpenoids and other compounds. The number of compounds can reach several hundred [Xu, W.-C. et al. , Chem. Biodiversity , 2011, 8: 1215-1233.
  • the stem and / or root pulverized stalk of the red bean biloba is about 2 to 20 times the dry weight, preferably about 3 to 5 times the volume of water, methanol, ethanol, butanol and the like.
  • Organic solvents such as C1 to C5 lower alkyl alcohols are used as a solvent, soaked for 3 to 5 hours, filtered to separate solids and primary liquid components, and the solids are immersed and filtered in the same manner to form secondary liquid components. Obtained and mixed. Thereafter, the mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was lyophilized to obtain an adzuki bean extract.
  • the sorbus extract may include the Genkwanine N or Yuanhuacine compound.
  • the red bean flower extract obtained is obtained by separating the fractionation layer of each solvent using a mixed solvent of an organic solvent such as hexane, ethyl acetate, butanol, or distilled water,
  • the active ingredient can be separated and purified in high purity from each fraction using separation methods known in the art.
  • the hexane fraction of the sorbus extract may include the Genkwanine N or Yuanhuacine compound of the present invention.
  • the inventors of the present invention are directed to extracts of various forms obtained from various natural products, in order to identify components derived from natural products which are excellent in preventing or treating various diseases including Parkinson's disease caused by Nurr1 dysfunction without any side effects.
  • various diseases including Parkinson's disease caused by Nurr1 dysfunction without any side effects.
  • the organic solvent extracts of Daphne genkwa can increase Nurr1 activity (FIG. 1).
  • the present inventors confirmed that the red bean extract extract that increases the Nurr1 activity has an effect of preventing nerve cell damage caused by compounds known to induce neuronal cell death (eg, 6-OHDA) (FIG. 2).
  • nerve cell damage caused by compounds known to induce neuronal cell death (eg, 6-OHDA)
  • FIG. 3 As a result of feeding a mixture of adzuki bean extract to an animal model that killed dopaminergic neurons in the rat brain, it was confirmed that the nerve function impaired by the killed dopaminergic neurons gradually improved (FIG. 3). ).
  • the present inventors have found that a variety of diseases caused by damage to dopaminergic neurons that are directly affected by the activity of Nurr1 protein, such as Parkinson's and Parkinson's disease, by increasing the activity of Nurr1 protein by Azalea extract It was confirmed that the effect on the prevention or treatment of various diseases caused by dysfunction of Nurr1.
  • the present inventors analyzed the active fractions and active ingredients for activating Nurr1 protein in the extract of Sorbus almond, and found that the hexane or ethyl acetate fraction of Sorbus almond showed an effect on Nurr1 protein activation (FIG. 4), among which Genkwanine N And Yuanhuacine compound was confirmed to show an excellent effect on Nurr1 protein activation (Fig. 5).
  • Nurr1 protein is involved in the establishment and maintenance of dopaminergic phenotypes in certain neuronal populations of the central nervous system, and it has been shown that reduced Nurr1 expression is involved in neurodegenerative diseases including Parkinson's disease [Chu, Y. et al ., J. Comp.
  • the hexane or ethyl acetate fractions of the zinnia and Genkwanine N or Yuanhuacine increase the Nurr1 protein activity, thereby directly affecting dopaminergic activity by Nurr1 protein activity. It can be seen that it is effective in the prevention or treatment of various diseases caused by nerve cell damage, for example, various diseases caused by dysfunction of Nurr1 other than Parkinson's disease and Parkinson's disease.
  • Genkwanine N and Yuanhuacine compounds of the present invention having an effect on the activation of Nurr1 can be usefully used for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases including Parkinson's disease.
  • neurodegenerative disease refers to a disease associated with symptoms that occur when neurons degenerate, lose function, and die. It is mainly progressive and the consequences are very destructive and patients with the disease may experience severe degeneration in cognitive or motor skills.
  • the neurodegenerative diseases include, but are not limited to, Parkinson's disease (PD), Alzheimer's disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease (HD), and temporal lobe dementia. (Fronto-Temporal Dementia), Cortico Basal Degeneration, and progressive supranuclear palsy (PSP).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in the form of Genkwanine N of Formula 1 or Yuanhuacine of Formula 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • pharmaceutically acceptable salts means all salts that retain the desired biological and / or physiological activity of the compound and exhibit undesired toxicological effects to a minimum.
  • salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • inorganic acids and organic acids may be used as the free acid
  • hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, nitric acid, sulfuric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid
  • methane sulfonic acid, p -toluene sulfonic acid, acetic acid, and triacid may be used as the organic acid.
  • Fluoroacetic acid maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid (glycollic) acid), gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanillic acid, hydroiodic acid, etc. Can be, and not limited to these.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts may also be obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of Genkwanine N of Formula 1 or Yuanhuacine compound of Formula 2 include salts of acidic or basic groups which may be present in Genkwanine N or Yuanhuacine compound, unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, Hydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p -toluenesulfonate (tosylate) salts; and the like through the methods for preparing salts known in the art. Can be prepared.
  • the present invention comprises the Genkwanine N or Yuanhuacine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or an adzuki bean extract or a fraction thereof containing at least one compound as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising an acceptable carrier.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not stimulate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated as liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, etc. may be added as necessary.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases caused by Nurr1 dysfunction comprising a red bean flower extract, fractions thereof, or a compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient. .
  • “Nurr1 (nuclear receptor related 1)” in the present invention means a nuclear receptor related 1 protein, also known as nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2 (NR4A2), which is known to be encoded by the human NR4A2 gene. . It is also known to be involved in many neurodegenerative diseases. Although the Nurr1 protein is an orphan nuclear receptor and a ligand for the protein has not yet been identified, the Nurr1 is a protein belonging to the nuclear receptor family of intracellular transcription factors. It has been found to play a key role in maintaining the dopaminergic system.
  • NR4A2 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
  • PD Parkinson's disease
  • AD Alzheimer's disease
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • HD Huntington's disease
  • schizophrenia and mood swings caused by dopamine dysfunction, including neurodegenerative disorders such as Fronto-Temporal Dementia, Cortico Basal Degeneration, and progressive supranuclear palsy (PSP) And a wide variety of inflammatory diseases.
  • PSP progressive supranuclear palsy
  • the present invention provides a Nurr1 activating composition
  • a Nurr1 activating composition comprising an adzuki bean extract, a fraction thereof or a compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient.
  • Nurr1 protein of the present invention is an orphan nuclear receptor (orphan nuclear receptor), the ligand for the protein has not yet been identified, but Nurr1 is a protein belonging to the nuclear receptor family of intracellular transcription factors, the dopamine system ( It has been found to play a key role in maintaining the dopaminergic system. In addition, it has been known that abnormalities of the Nurr1 protein may cause disorders of the dopamine system and cause neurodegenerative diseases. Nurr1 has been studied as a neurodegenerative protein target. Therefore, the Genkwanine N or Yuanhuacine compound of the present invention can be used for Nurr1 function research and the like, but is not limited thereto.
  • the present invention is one or more terpenoid compounds selected from the group consisting of Genkwanine N represented by the formula (1) and Yuanhuacine represented by the formula (2), or Provided is a functional food additive for the prevention or improvement of neurodegenerative diseases, comprising a red bean flower extract or a fraction thereof comprising any one or more of the compounds as an active ingredient.
  • composition of the present invention has already been confirmed to be stable as a natural product of red bean extract, or a compound separated therefrom, when common sense for a long time according to the usual eating habits, as well as preventing various neurodegenerative diseases including Parkinson's disease It can have an effect of improving the symptoms of the disease.
  • the term "prevention" is to activate the Nurr1 protein by using a composition comprising Genkwanine N of Formula 1 or Yuanhuacine compound of Formula 2, or a bean extract or a fraction thereof containing the compound as an active ingredient Any action that inhibits or delays the development of neurodegenerative diseases.
  • the term "improvement” refers to Genkwanine N of Formula 1 or Yuanhuacine compound of Formula 2, or activating Nurr1 protein by using a composition comprising a bean extract or a fraction thereof containing at least one compound as an active ingredient Suspicion of neurodegenerative disease and all the actions that improve or benefit the symptoms of the onset individual.
  • the compound When using Genkwanine N of Formula 1 or Yuanhuacine compound of Formula 2 of the present invention, or Adzuki bean extract or fractions thereof containing at least one of the compounds as a food additive, the compound is added to food or beverage as it is or It can be used in combination with other food additives.
  • the food additive of the present invention is added at the time of preparation of food or beverage, the amount thereof is not particularly limited, but is added in an amount of 1 to 5% by weight, preferably 1 to 3% by weight, based on the weight of the final food. Can be added. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or for health control, the added amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the kind of the food or drink is not particularly limited, but includes all food or drink in a general sense, preferably meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, etc.
  • Dairy products including noodles, gums, ice creams, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes and the like.
  • a food additive containing a compound isolated from the red bean extract of the present invention when adding a food additive containing a compound isolated from the red bean extract of the present invention to food, various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids , Protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, may be added together with auxiliary components, such as alcohol, the content of the auxiliary component is not particularly limited, but 0.01 to 0.1 by weight of the final food It is preferably in weight percent.
  • a food additive containing a compound isolated from the sorbus extract of the present invention when adding a food additive containing a compound isolated from the sorbus extract of the present invention to the beverage, it may include various sweeteners or natural carbohydrates, and the like as an additional component like a conventional beverage.
  • the sweetener is not particularly limited to this, but natural sweeteners such as taumartin, stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, etc.
  • the natural carbohydrate is not particularly limited thereto, but a monosaccharide (eg For example, glucose, fructose, etc.), disaccharides (eg, maltose, sucrose, etc.), polysaccharides (eg, dextrin, cyclodextrin, etc.), or sugar alcohols (eg, xylitol, sorbitol, erythritol, etc.) ),
  • the content of the natural carbohydrate is not particularly limited, but is preferably included in a ratio of about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the final beverage product.
  • the invention is a terpenoid compound (terpenoid) compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or a pharmaceutical thereof Prevention of neurodegenerative diseases comprising administering to a subject in need thereof an acceptable salt, or a pharmaceutical composition comprising an adzuki bean extract or fractions thereof comprising the compound of any one or more of the above compounds as an active ingredient or Provide a method of treatment.
  • terpenoid selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or a pharmaceutical thereof
  • Prevention of neurodegenerative diseases comprising administering to a subject in need thereof an acceptable salt, or a pharmaceutical composition comprising an adzuki bean extract or fractions thereof comprising the compound of any one or more of the above compounds as an active ingredient or Provide a method of treatment.
  • the present invention provides a Nurr1 dysfunction comprising administering to a subject in need thereof a red bean extract, fractions thereof, or a pharmaceutical composition comprising the compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient. It provides a method for preventing or treating a disease caused by.
  • the present invention is a terpenoid compound (terpenoid) compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof Or it provides a use for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating neurodegenerative diseases of the pharmaceutical composition comprising a red bean flower extract or fractions thereof comprising any one or more of the above compounds as an active ingredient.
  • terpenoid terpenoid compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • terpenoid terpenoid compound selected from the group consisting of Genkwanine N represented by Formula 1 and Yuanhuacine represented by Formula 2, or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • it provides a use for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating neurodegenerative diseases of the pharmaceutical composition comprising a red bean flower extract or fractions thereof comprising any one or more of the above compounds as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for the manufacture of a therapeutic agent for diseases caused by Nurr1 dysfunction of the pharmaceutical composition comprising a bean extract, fractions thereof, or a compound represented by Formula 1 or Formula 2 as an active ingredient.
  • the term "individual" of the present invention means any animal, including humans, who may or may have a neurodegenerative disease, and is caused by the neurodegenerative disease or Nurr1 dysfunction by administering to a subject a pharmaceutical composition of the present invention.
  • the disease can be effectively prevented or treated.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent, or in combination with an existing neurodegenerative disease therapeutic agent, and may be administered sequentially or simultaneously with the conventional therapeutic agent.
  • administration means introducing a predetermined substance into a patient in an appropriate manner and the route of administration of the composition can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration, rectal administration, but is not limited thereto.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which solid preparations, in addition to the composition, include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose, Prepare by mixing gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be used. May be included.
  • the oral composition is formulated to coat or protect the active agent from degradation in the stomach.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • compositions of the present invention may be administered by any device in which the active substance may migrate to target cells.
  • Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, injectable and the like.
  • Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.).
  • Stabilizers e.g.
  • Preservatives eg, mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc. may be included.
  • composition may be administered in single or multiple doses in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to prevent or treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical prophylaxis or treatment, and an effective dose level refers to the severity of the disease, the activity of the drug, Including the age, body weight, health, sex of the patient, sensitivity to the drug of the patient, time of administration of the composition of the invention used, route of administration and rate of release, duration of treatment, drugs used in combination or concurrently with the composition of the invention used Factors, and factors well known in the medical arts.
  • 1,260.93 g of the stem and 1,487.17 g of the stem of the Daphne genkwa were cut into small pieces, immersed in 13 L methanol for 4 hours, and filtered to separate the solids and the first liquid component.
  • the separated solid was again immersed in 13 L methanol for 4 hours and filtered to obtain a secondary liquid component.
  • the obtained primary liquid component and the secondary liquid component were mixed, the mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was lyophilized to prepare 172.71 g of red bean extract.
  • Example 2 Isolation of Active Ingredients from Various Beanstalk Extracts
  • Methanol extract and the extract of the red bean root and stem obtained in Example 1 was concentrated under reduced pressure to add a variety of solvents in order to confirm the effect on the Nurr1 protein activity of the fraction for each solvent.
  • the solvent used is hexane, ethyl acetate (EtOAc), distilled water (dH 2 O), and butanol (BuOH).
  • the dried red bean flower extract was dissolved in 1: 1 mixed solvent of distilled water and hexane and fractionated to obtain a hexane layer.
  • 2 L of distilled water and a 1: 1 mixed solvent of ethyl acetate were added to the remaining distilled water layer to obtain an ethyl acetate layer, and a butanol layer and a distilled water layer were obtained in the same manner.
  • Nurr1 activity experiments were performed on the fractions of the solvent layers obtained by the separation, and it was confirmed that the hexane and ethyl acetate fractions had high activity.
  • Nurr1 activity was observed in 32 to 38 fractions (268 mg) eluted at 1: 2 solvent condition of hexane: ethyl acetate. Therefore, the 32 to 38 fractions were collected, concentrated under reduced pressure, and subjected to reverse phase silica gel prep TLC under 85% acetonitrile to obtain a total of 11 bands.
  • the active material was extracted from the two bands with methanol and concentrated under reduced pressure to obtain two compounds, B6 and B8, respectively.
  • ODS HPLC was performed using 80% acetonitrile (0.025% trifluoroacetic acid; TFA) as an eluent, and two active ingredients, genkwanine N and Yuanhuacine was successfully isolated as a single substance.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Figure 1 is a graph showing the change of Nurr1 protein activity according to the concentration of methanol extract of Azalea through Luciferase analysis. 0.1% DMSO was used as a control, and the activity was increased in multiples of the activity at this time. When the sorbus extract was treated with a concentration of 20 ppm, the maximum activity was shown, and the value reached about three times that of the control group. As shown in Figure 1, it was confirmed that the activity of Nurr1 protein by the sorbus extract in BE (2) C cells, which are human-derived neuroblasts (neuroblast).
  • Human-derived neuroblastoma SH-SY5Y cells were dispensed in 24-well plates at a cell concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / well and incubated in a carbon dioxide incubator for 24 hours.
  • the cultured cells were treated with 6-OHDA (6-hydroxydopamine) (50 ⁇ M) which induces apoptosis alone or with different concentrations (5-20 ppm) of S. aureus extracts, and again at 37 ° C. for 24 hours. , 5% carbon dioxide incubator.
  • MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) solution was treated in each well at a concentration of 1 mg / ml, followed by a 5% carbon dioxide incubator for 1 hour. After storage in MTT extraction solution (extraction solution) was added. Then stored at 37 °C for 24 hours, the absorbance was measured at 570 nm (Fig. 2).
  • Figure 2 is a graph showing the effect of the concentration of sorbus extract on neuronal cell death induced by 6-OHDA. As shown in Figure 2, 6-OHDA-induced neuronal cell death was inhibited by the sorbus extract so that the cell viability of the sorbus extract treatment group recovered to 70% or more of the control group.
  • the rats were fed with the feed mixed with the extract for 2 weeks so that the daily dose of the red bean flower extract became 500 mg / kg.
  • the control rats were used to feed the feed is not mixed with the extract.
  • a stepping test was performed, which is a non-pharmacological test method to reinforce the error of the pharmacological test. Specifically, while controlling the three legs of the rat by hand on the table 90 cm in length for 15 seconds while moving on the table surface, the number of uncontrolled legs hit the table surface was repeated three times for each leg.
  • the measurement time point of the step test was 3 days before 6-OHDA injection, 2 weeks, 4 weeks and 6 weeks after the 6-OHDA injection (Fig. 3).
  • Figure 3 is a graph showing the results of confirming the effect of the Red Bean Extract on the rats in which dopaminergic neurons were killed through a step test. As shown in FIG. 3, the rats to which the sorbus extract was administered were found to increase the number of steps compared to the rats not administered.
  • Example 2 The effect on the Nurr1 protein activity of the fraction of the red bean flower extract obtained using the various solvents in Example 2 was confirmed according to a method similar to that described in Example 3. Hexane (hexane), ethyl acetate (EtOAc), distilled water (dH 2 O), and butanol (BuOH) were used as the solvent.
  • Hexane hexane
  • EtOAc ethyl acetate
  • dH 2 O distilled water
  • BuOH butanol
  • Genkwanine N and Yuanhuaicine showed more than 300% activity at both compounds at 0.3 ppm, especially at low nanomolar levels of 16 nM and 15 nM for 0.01 ppm, respectively.
  • the activity was improved by 60 and 70%, respectively.

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Abstract

본 발명은 겐콰닌 N(Genkwanine N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine), 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 Nurr1 활성화 조성물, 겐콰닌 N(Genkwanine N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine), 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 첨가물, 및 상기 약학적 조성물들을 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

팥꽃나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 겐콰닌 N(Genkwanine N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine), 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 Nurr1 활성화 조성물, 겐콰닌 N(Genkwanine N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine), 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 첨가물, 및 상기 약학적 조성물들을 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)은 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 종종 사멸하는 경우의 증상들과 관련된다. 이들은 주로 진행성이기 때문에, 신경퇴행성 질환의 결과는 종종 대단히 파괴적이다. 신경퇴행성 질환을 가진 환자들은 인지(cognitive) 또는 운동(motor) 능력에 있어서의 극심한 퇴화를 겪을 수 있다. 결과적으로, 그들의 삶의 질 및 삶에 대한 기대는 현저히 감소될 수 있다. 인간에게 있어서, 이들 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP), 및 다른 질병들을 포함한다.
한편 상당수의 신경퇴행성 질환에는 Nurr1(nuclear receptor related 1) 단백질이 관련된 것으로 알려져 있다. 상기 Nurr1은 NR4A2(nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2)라고도 알려져 있는 핵수용체 관련 1 단백질을 의미하며, 이는 사람의 NR4A2 유전자에 의해 암호화되는 것으로 알려져 있다. 비록, 상기 Nurr1 단백질은 고아 핵 수용체(orphan nuclear receptor)로서, 아직까지는 상기 단백질에 대한 리간드가 규명되어 있지 않지만, 상기 Nurr1은 세포 내 전사인자의 핵 수용체 패밀리에 속하는 단백질로서, 뇌에서 도파민 시스템(dopaminergic system)을 유지하는 핵심적인 역할을 수행함이 규명되었다. 상기 Nurr1 또는 NR4A2 유전자에 이상이 발생하면, 도파민 시스템의 기능이 손상되어 파킨슨병을 유발시킬 뿐만 아니라, 류마티스 관절염, 정신분열증, 조울증 등의 광범위한 염증성 및 신경성 질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
상기 Nurr1의 기능장애에 의하여 유발되는 대표적인 신경퇴행성 질환인 파킨슨병은 근육운동을 통제하는 뇌신경세포에 영향을 미치는 만성 진행성 신경질환으로서, 중뇌의 흑질(substantia nigra) 부위에 신경전달물질인 도파민을 만들어내는 세포가 갑자기 손상되거나, 퇴화되거나 또는 그 수가 크게 감소할 경우에 발생하는데, 상기 도파민은 신체의 운동을 용이하게 하기 위해 세포 사이에서 신호를 전달하기 위한 중요한 화학물질이기 때문에, 전형적으로 나타나는 떨림증(tremor), 경직(rigidity), 운동완서(bradykinesia), 자세의 불안정(postural instability) 및 언어능력 손상과 같은 운동성 질환 증상이 야기된다. 이처럼 도파민 생성세포가 손상되는 원인은 명확히 밝혀져 있지 않으나, 뇌의 동맥경화증, 일산화탄소 중독, 약물, 부갑상선 기능저하증 등에 의한 대사성, 외상성 뇌염 후유증 등이 관여하는 것으로 연구되고 있다.
이같은 파킨슨병의 치료를 위한 약물로서, 엘도파(l-dopa) 제제, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 엘데프릴(Eldepryl=depreyl) 등이 알려져 있으며, 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것이며, 따라서 꾸준하게 지속적인 약물의 복용을 필요로 한다. 그러나, 이러한 약물들의 장기 투여는 약물 부작용의 문제점을 야기하게 된다. 예를 들어, 항콜린 약제들은 자율신경계 이상이나 정신기능의 이상 등이 나타날 수 있어 고령의 환자들에게 지속적으로 투여하는 것에 한계가 있다. 또한, 엘도파 제제의 경우 장기간 동안의 복용에 따라 점차적으로 효과가 떨어지고, 몸이 뒤틀리고 손이나 발이 저절로 움직이는 이상운동이 생기는 등의 부작용이 발생하게 된다.
이러한 부작용을 방지하기 위하여, 천연물로부터 유래한 파킨슨병의 치료제를 개발하려는 노력이 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 특허공개 제2001-0081188호에는 신경보호작용을 갖는 황금(Scutellariae Radix) 추출물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 및 노인성 치매를 포함하는 뇌질환 등의 신경계 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 특허공개 제2004-0012396호에는 백강잠 101A(Beauveria Bassiana 101A)의 추출물을 포함하는 파킨슨병 및 중풍과 같은 퇴행성 뇌질환 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 특허공개 제2004-0029072호에는 웽구앙구오(wenguanguo) 껍질로부터 얻은 추출물을 포함하는 파킨슨병 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있고, 특허공개 제2010-0060123호에는 생강 추출물 또는 쇼가올을 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있으며, 특허공개 제2010-0060949호에는 복숭아 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 등의 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 신경세포 보호용 조성물이 개시되어 있고, 특허공개 제2011-0013466호에는 포도씨 추출물 또는 이로부터 유래되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이들 천연물로부터 유래된 성분은 부작용이 없는 대신 파킨슨병의 치료효율이 낮다는 단점이 있었다.
본 발명자들은 팥꽃나무(Daphne genkwa)의 줄기 및 뿌리로부터 유래된 추출물이 천연물로부터 유래되어 부작용이 없으면서도, Nurr1을 활성화시킴으로써, 도파민성 신경세포의 분화, 성장 및 유지를 증진시키고, 그 결과 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 파킨슨병을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환에 대한 치료효과가 우수함을 확인하였다. 나아가, 상기 팥꽃나무 추출물의 활성성분을 분석하여 추출물 중 Genkwanine N 및 Yuanhuacine 화합물이 Nurr1 단백질 활성화에 우수한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 Nurr1 활성화 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 첨가물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 팥꽃나무 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물은 천연물 유래 화합물로서 별다른 부작용을 나타내지 않으면서도, 신경손상에 의한 Nurr1 단백질 활성 억제를 회복시키는데 우수한 효과를 나타냄으로써 Nurr1 단백질의 활성 억제로 인해 유발되는 파킨슨병을 비롯한 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 팥꽃나무 메탄올 추출물의 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도의 변화를 루시퍼라제 분석을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 6-OHDA(6-hydroxydopamine)에 의해 유도되는 신경세포 사멸에 대한 팥꽃나무 추출물의 농도에 따른 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 팥꽃나무 메탄올 추출물의 파킨슨 동물모델에서의 치료효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 팥꽃나무의 다양한 용매 추출물에 의한 Nurr1 단백질 활성도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 팥꽃나무 추출물로부터 분리된 Genkwanine N과 Yuanhuacine 화합물의 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도 증가를 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2011009110-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2011009110-appb-C000002
본 발명의 Genkwanine N은 상기 화학식 1로 표시되는 테르페노이드, 구체적으로는 다이테르펜 에스테르 화합물로서, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, Genkwanine N이 포함되어 있는 것으로 당업계에 공지된 식물로부터 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 분리 정제할 수 있다. 또는 상업적으로 시판되는 화합물을 구입하거나 합성하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 팥꽃나무로부터 추출, 분리할 수 있다.
본 발명의 Yuanhuacine은 상기 화학식 2로 표시되는 테르페노이드, 구체적으로는 다이테르펜 에스테르 화합물로서, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, Yuanhuacine이 포함되어 있는 것으로 당업계에 공지된 식물로부터 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 분리 정제할 수 있다. 또는 상업적으로 시판되는 화합물을 구입하거나 합성하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 팥꽃나무로부터 추출, 분리할 수 있다.
본 발명의 용어 "팥꽃나무(Daphne genkwa)"는 쌍떡잎식물 도금양목 팥꽃나무과의 낙엽관목을 의미한다. 조기꽃나무, 이팥나무라고도 하며, 주로 바닷가 근처에서 성장하며, 한의학에서는 이뇨, 수종, 신장염 등의 증상을 치료하는데 사용한다.
본 발명의 용어 "팥꽃나무 추출물"은 팥꽃나무로부터 수득한 추출물을 의미하는데, 바람직하게는 팥꽃나무의 줄기 또는 뿌리로부터 수득한 추출물을 의미하며, 보다 바람직하게는 팥꽃나무의 줄기 또는 뿌리를 유기용매 추출하여 수득한 추출물을 의미하고, 구체적으로는 팥꽃나무의 줄기 또는 뿌리를 C1 내지 C5의 저급 알킬알콜로 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 공지된 바에 의하면, 팥꽃나무 추출물은 크게 쿠마린(coumarins)류, 플라보노이드(flavonoids)류, 리그난(lignans)류, 테르페노이드(terpenoids)류 및 이 외 화합물의 크게 5가지 종류의 화합물을 포함하며 총 화합물의 수는 수백 가지에 이른다[Xu, W.-C. et al., Chem. Biodiversity, 2011, 8: 1215-1233].
본 발명의 일실시예에 의하면, 팥꽃나무의 줄기 및/또는 뿌리 분쇄물을 건조중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C1 내지 C5의 저급 알킬알콜 등의 유기용매를 용매로 사용하여 3 내지 5시간 동안 침지하고 여과하여 고형분과 1차 액상성분을 분리하고, 상기 고형분을 동일한 방법으로 침지하고 여과하여 2차 액상성분을 수득하여 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 감압 농축시키고 잔사를 동결건조하여 팥꽃나무 추출물을 수득하였다. 상기 팥꽃나무 추출물은 상기 Genkwanine N 또는 Yuanhuacine 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 수득한 팥꽃나무 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올, 또는 증류수 등의 유기용매의 혼합용매를 이용하여 각 용매의 분획층을 분리하여 수득하고, 크로마토그래피 등의 당업계에 공지된 분리방법을 이용하여 각각의 분획으로부터 활성성분을 고순도로 분리 정제할 수 있다. 상기 팥꽃나무 추출물의 헥산 분획은 본 발명의 Genkwanine N 또는 Yuanhuacine 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 부작용이 없으면서도, Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 파킨슨병을 비롯한 다양한 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 우수한 천연물 유래의 성분을 규명하기 위하여, 다양한 천연물로부터 수득한 다양한 형태의 추출물을 대상으로 연구를 수행한 결과, 팥꽃나무(Daphne genkwa)의 유기용매 추출물이 Nurr1 활성도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 1).
또한, 본 발명자들은 상기 Nurr1 활성도를 증가시키는 팥꽃나무 추출물이 신경세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 화합물(예를 들어, 6-OHDA 등)에 의한 신경세포 손상을 예방하는 효과를 나타냄을 확인하였다(도 2). 뿐만 아니라, 랫트 뇌의 도파민성 신경세포를 사멸시킨 동물모델에 팥꽃나무 추출물을 혼합한 사료로 급이시킨 결과, 사멸된 도파민성 신경세포에 의해 손상된 신경기능이 서서히 개선됨을 확인할 수 있었다(도 3).
이와 같이, 본 발명자는 팥꽃나무 추출물이 Nurr1 단백질 활성도를 증가시킴으로써, Nurr1 단백질의 활성에 의하여 직접적으로 영향을 받는 도파민성 신경세포의 손상에 의하여 유발되는 다양한 질환, 예를 들어, 파킨슨병 및 파킨슨병 이외의 Nurr1의 기능장애에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명자들은 팥꽃나무 추출물 중 Nurr1 단백질을 활성화 하는 활성분획 및 활성성분을 분석한 결과, 팥꽃나무의 헥산 또는 에틸 아세테이트 분획물이 Nurr1 단백질 활성화에 효과를 보임을 확인하였고(도 4), 그 중 Genkwanine N 및 Yuanhuacine 화합물이 Nurr1 단백질 활성화에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5). Nurr1 단백질은 중추신경계의 특정한 신경세포군에서 도파민성 표현형의 확립과 유지에 관여하며, Nurr1의 발현 감소가 파킨슨병을 비롯한 신경퇴행성 질환에 관여한다는 것이 밝혀졌는 바[Chu, Y. et al., J. Comp. Neurol., 2006, 494(3): 495-514], 상기 팥꽃나무의 헥산 또는 에틸 아세테이트 분획물 및 Genkwanine N 또는 Yuanhuacine이 Nurr1 단백질 활성도를 증가시킴으로써, Nurr1 단백질의 활성에 의하여 직접적으로 영향을 받는 도파민성 신경세포의 손상에 의하여 유발되는 다양한 질환, 예를 들어, 파킨슨병 및 파킨슨병 이외의 Nurr1의 기능장애에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타냄을 알 수 있다.
따라서, Nurr1의 활성화에 효과를 가지는 본 발명의 Genkwanine N 및 Yuanhuacine 화합물은 파킨슨병을 비롯한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 용어 "신경퇴행성 질환"이란 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 사명하는 경우 나타나는 증상들과 관련된 질환을 의미한다. 주로 진행성이어서 그 결과는 매우 파괴적이고, 상기 질환을 가진 환자들은 인지 또는 운동 능력에 있어서 극심한 퇴화를 겪을 수 있다. 상기 신경퇴행성 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 Genkwanine N 또는 화학식 2의 Yuanhuacine, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 화학식 1의 Genkwanine N 또는 화학식 2의 Yuanhuacine 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, Genkwanine N 또는 Yuanhuacine 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 거의 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 Genkwanine N 또는 Yuanhuacine, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "Nurr1(nuclear receptor related 1)"은 NR4A2(nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2)라고도 알려져 있는 핵수용체 관련 1 단백질을 의미하며, 이는 사람의 NR4A2 유전자에 의해 암호화되는 것으로 알려져 있다. 또한 상당수의 신경퇴행성 질환에는 관련된 것으로 알려져 있다. 비록, 상기 Nurr1 단백질은 고아 핵 수용체(orphan nuclear receptor)로서, 아직까지는 상기 단백질에 대한 리간드가 규명되어 있지 않지만, 상기 Nurr1은 세포 내 전사인자의 핵 수용체 패밀리에 속하는 단백질로서, 뇌에서 도파민 시스템(dopaminergic system)을 유지하는 핵심적인 역할을 수행함이 규명되었다. 상기 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환은 이에 제한되지 않으나 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP) 등의 신경퇴행성 질환과 도파민 기능장애로 유발되는 류마티스 관절염, 정신분열증, 조울증 등의 광범위한 염증성 질환을 포함한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 Nurr1 활성화 조성물을 제공한다.
본 발명의 Nurr1 단백질은 고아 핵 수용체(orphan nuclear receptor)로서, 아직까지는 상기 단백질에 대한 리간드가 규명되어 있지 않지만, 상기 Nurr1은 세포 내 전사인자의 핵 수용체 패밀리에 속하는 단백질로서, 뇌에서 도파민 시스템(dopaminergic system)을 유지하는 핵심적인 역할을 수행함이 규명되었다. 또한 Nurr1 단백질의 이상에 의해 도파민 시스템의 장애를 유발하고 신경퇴행성 질환의 원인이 될 수 있음이 알려져 있어, Nurr1은 신경퇴행성 질환 관련 단백질 타겟으로 연구되고 있다. 따라서, 본 발명의 Genkwanine N 또는 Yuanhuacine 화합물은 Nurr1 기능 연구용 등으로 사용 가능하나 이에 제한되지는 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 첨가물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 천연물인 팥꽃나무 추출물, 또는 이로부터 분리된 화합물로 안정성이 이미 확인되었으므로, 평소의 식습관에 따라 장기간 동안 상식할 경우, 파킨슨병을 포함하는 다양한 신경퇴행성 질환을 예방함은 물론 발병된 상기 질환의 증상을 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 화학식 1의 Genkwanine N 또는 화학식 2의 Yuanhuacine 화합물, 또는 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 Nurr1 단백질을 활성화하여 신경퇴행성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 "개선"은 상기 화학식 1의 Genkwanine N 또는 화학식 2의 Yuanhuacine 화합물, 또는 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 Nurr1 단백질을 활성화하여 신경퇴행성 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 상기 화학식 1의 Genkwanine N 또는 화학식 2의 Yuanhuacine 화합물, 또는 상기 화합물을 하나 이상 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을을 식품 첨가물로 사용하는 경우, 식품 또는 음료에 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 또는 다른 식품 첨가물과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 첨가물을 식품 또는 음료의 제조시에 첨가할 경우, 이의 첨가량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종적인 식품의 중량에 대하여 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 1 내지 3 중량%의 첨가량으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 첨가량은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
아울러, 상기 식품 또는 음료의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 통상적인 의미에서의 식품 또는 음료를 모두 포함하고, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 포함한다.
이때, 본 발명의 팥꽃나무 추출물로부터 분리한 화합물을 포함하는 식품 첨가물을 식품에 첨가할 경우에는, 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜 등의 보조성분과 함께 첨가될 수 있고, 상기 보조성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종적인 식품의 중량에 대하여 0.01 내지 0.1 중량%임이 바람직하다.
또한, 본 발명의 팥꽃나무 추출물로부터 분리한 화합물을 포함하는 식품 첨가물을 음료에 첨가할 경우에는, 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 감미제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있고, 상기 천연 탄수화물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 단당류(예를 들어, 포도당, 과당 등), 이당류(예를 들어, 말토스, 수크로스 등), 다당류(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등), 또는 당알콜(예를 들어, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등) 등을 사용할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 음료제품 100 ml 당 약 0.01 내지 0.04 g 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g의 비율로 포함됨이 바람직하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 신경퇴행성 질환 치료제 제조를 위하여 사용되는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환 치료제 제조를 위하여 사용되는 용도를 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 신경퇴행성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 신경퇴행성 질환 또는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 기존의 신경퇴행성 질환 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 천연물로부터 유래된 상기 팥꽃나무 추출물의 활성성분은 소화로 인하여 손실될 수 있으므로, 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 팥꽃나무 추출물의 제조
팥꽃나무(Daphne genkwa)의 줄기 1,260.93 g과 뿌리 1,487.17 g을 세절한 다음, 13 L 메탄올에 4시간 동안 침지하고, 여과하여 고형분과 1차 액상성분을 분리하였다. 상기 분리된 고형분을 다시 13 L 메탄올에 4시간 동안 침지하고, 여과하여 2차 액상성분을 수득하였다. 상기 수득한 1차 액상성분과 2차 액상성분을 혼합하고, 상기 혼합물을 감압하에서 농축시킨 다음, 잔사를 동결건조하여 172.71 g의 팥꽃나무 추출물을 제조하였다.
실시예 2: 팥꽃나무 추출물로부터 다양한 용매에 의한 활성성분의 분리
상기 실시예 1에서 수득한 팥꽃나무 뿌리 및 줄기를 메탄올 추출하여 감압농축하여 건조시킨 추출물에 다양한 용매를 차례로 가하여 각 용매에 대한 분획의 Nurr1 단백질 활성에 대한 효과를 확인하였다. 이때, 사용된 용매는 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate; EtOAc), 증류수(distilled water; dH2O), 및 부탄올(butanol; BuOH)이다.
먼저 건조 팥꽃나무 추출물을 2 L의 증류수와 헥산의 1:1 혼합용매에 녹여 분획하여 헥산 층을 얻었다. 남은 증류수 층에 다시 2 L의 증류수와 에틸 아세테이트의 1:1 혼합용매를 가하여 분획하여 에틸 아세테이트 층을 얻고, 동일한 방법으로 부탄올 층과 증류수 층을 수득하였다. 상기 분리 수득한 각 용매 층의 분획에 대하여 Nurr1 활성실험을 실시한 결과, 헥산 및 에틸 아세테이트 분획이 높은 활성을 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 해당 활성 분획에 대한 대량분리를 진행하기 위하여 실시예 1의 방법과 유사하게 팥꽃나무 뿌리, 줄기 건조시료 2.75 kg을 메탄올 용매에 13 L씩 2회 반복하여 냉침하고 농축하여 172.71 g의 메탄올 추출물을 수득하였다. 이 중 30.1 g을 증류수에 현탁하여 헥산, 에틸 아세테이트 순으로 분획하였다. 두 분획 중 더 높은 활성을 가진 것으로 확인된 헥산 분획물(3 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 헥산과 에틸 아세테이트의 구배(gradient) 혼합용매(10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10)로 용리시켜 총 50개의 분획을 얻었다. 이 중 헥산:에틸 아세테이트의 1:2 용매조건에서 용리된 32 내지 38 분획(268 mg)에서 Nurr1 활성이 관찰되었다. 따라서, 상기 32 내지 38 분획을 모아 감압 농축하고, 85% 아세토니트릴 조건으로 역상 실리카겔 프렙 TLC(reverse phase silica gel prep TLC)를 실시하여 총 11개의 밴드를 얻었다. 이 중 밴드 6(Rf=0.44)과 밴드 8(Rf=0.33)에서 Nurr1 활성화가 관찰되어, 상기 두 개의 밴드로부터 메탄올로 활성물질을 추출하고 감압 농축하여 각각 B6과 B8의 두 화합물을 얻었다. 최종적으로 80% 아세토니트릴(0.025% 트리플루오로아세트산; trifluoroacetic acid; TFA)을 용출액으로하여 ODS HPLC를 수행하여 이 두 화합물로부터 99% 이상의 순도로 두 가지의 활성성분 겐콰닌 N(Genkwanine N)과 유안후아신(Yuanhuacine)을 단일물질로 성공적으로 분리하였다.
실시예 3: Nurr1 단백질 활성에 대한 팥꽃나무 추출물의 효과
GLA4 유전자가 결합할 수 있는 염기서열(5'-CTCGGAGGACAGTACTCCG-3, 서열번호 1)이 8회 반복된 유전자를 리포터 유전자인 루시퍼라제에 결합시킨 벡터를 합성한 후, Nurr1-LBD를 포함한 DNA와 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)를 가진 DNA 등 3종의 플라스미드 DNA를 BE(2)C 세포에 주입(transfection)한 뒤 6시간 후, 팥꽃나무 추출물을 1 내지 200 ppm의 농도로 처리하였다. 이렇게 처리한 세포를 20시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 루시퍼라제 분석을 수행하였다(도 1).
도 1은 팥꽃나무 메탄올 추출물의 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도의 변화를 루시퍼라제 분석을 통하여 나타낸 그래프이다. 대조군으로는 0.1% DMSO를 사용하였고, 이때의 활성에 배수로 활성도의 증가를 나타내었다. 팥꽃나무 추출물을 20 ppm의 농도로 처리하였을 때, 최대의 활성을 나타내었고 이때의 값은 대조군의 약 3배에 달하였다. 도 1에서 보듯이, 인간 유래 신경모세포(neuroblast)인 BE(2)C 세포에서 팥꽃나무 추출물에 의한 Nurr1 단백질의 활성이 증가함을 확인하였다.
실시예 4: SH-SY5Y 세포에 대한 팥꽃나무 추출물의 효과
인간 유래 신경모세포종(neuroblastoma)인 SH-SY5Y 세포를 5×105 세포수/웰의 세포농도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 상기 배양된 세포에 세포사멸을 유도하는 6-OHDA(6-hydroxydopamine)(50 μM)를 단독으로 또는 서로 다른 농도(5 내지 20 ppm)의 팥꽃나무 추출물과 함께 처리하고, 다시 24시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 24시간 경과 후, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 1 mg/ml의 농도로 각 웰에 처리하고, 1시간 동안 5% 이산화탄소 배양기에 보관한 다음, MTT 추출용액(extraction solution)을 가하였다. 이어 37℃에 24시간 동안 보관하고, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2).
도 2는 6-OHDA에 의해 유도되는 신경세포 사멸에 대한 팥꽃나무 추출물의 농도에 따른 효과를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 6-OHDA에 의해 유도되는 신경세포 사멸이 팥꽃나무 추출물에 의해 저해되어 팥꽃나무 추출물 처리군의 세포 생존률이 대조군의 70% 이상의 수준까지 회복되는 것을 확인하였다.
실시예 5: 신경세포를 손상시킨 랫트에 대한 팥꽃나무 추출물의 효과
6주령 SD 랫트(코아텍 사)의 중뇌의 흑질 부위에 존재하는 도파민성 신경세포를 특이적으로 사멸시키기 위하여, 정위고정성 도구(stereotaxic tool)를 이용하여 뇌의 AP(-4.3), ML(-1.8), DV(-8.2) 부위와 AP(-5.0), ML(-1.8), DV(-8.2) 부위에 6-OHDA(1 μg/μl)를 1 μl/min의 속도로 4 μg을 직접 주입하였다. 이때, 데시프라민(desipramine)을 25 mg/kg의 용량으로 상기 6-OHDA 투여 30분 전에 투함으로써, 도파민성 신경세포 이외의 세포사는 억제시켰다.
이후, 팥꽃나무 추출물의 1일 투여량이 500 mg/kg이 되도록 상기 추출물이 혼합된 사료를 상기 랫트에게 2주일간 급이시켰다. 이때, 대조군으로는 상기 추출물이 혼합되지 않은 먹이를 급이시킨 랫트를 사용하였다.
약물학적 시험의 오차를 보강하기 위한 비약물학적 검사방법인 스텝 테스트(stepping test)를 수행하였다. 구체적으로, 길이 90 cm의 탁자 위에서 손으로 쥐의 세 다리를 제어한 상태에서 탁자면 위를 15초 동안 이동시키며 제어되지 않은 다리가 탁자 표면을 딛는 수를 각 다리별로 3회 반복하여 측정하였다. 상기 스텝 테스트의 측정 시점은 6-OHDA를 주입하기 3일 전, 6-OHDA 주입 후 2주, 4주 및 6주가 경과된 시점이었다(도 3).
도 3은 도파민성 신경세포가 사멸된 랫트에 대한 팥꽃나무 추출물의 효과를 스텝 테스트를 통하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 팥꽃나무 추출물이 투여된 랫트는 투여되지 않은 랫트에 비하여 스텝 수가 증가함을 알 수 있었다.
실시예 6: 다양한 용매에 의한 팥꽃나무 추출물의 효과
상기 실시예 2에서 다양한 용매를 이용하여 수득한 팥꽃나무 추출물의 분획물의 Nurr1 단백질 활성에 대한 효과를 실시예 3에 기재된 방법과 유사한 방법에 따라 확인하였다. 용매로는 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate; EtOAc), 증류수(distilled water; dH2O), 및 부탄올(butanol; BuOH)을 사용하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 헥산 분획물에서 강한 Nurr1 단백질 활성화 효과가 나타났으며, 1 ppm의 헥산 분획물은 Nurr1 단백질의 활성을 380%까지 증가시켰다.
실시예 7: 활성성분 Genkwanine N과 Yuanhuacine의 효과
실시예 3과 유사한 방법으로, Nurr1 단백질의 활성에 대한 Genkwanine N과 Yuanhuaicine 효과의 농도의존성을 실험하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Genkwanine N과 Yuanhuaicine은 두가지 화합물 모두 0.3 ppm에서 300%가 넘는 활성을 보였고, 특히 0.01 ppm 즉, 각각에 대하여 16 nM과 15 nM의 낮은 나노몰랄 수준의 농도에서도 Nurr1 단백질의 활성을 각각 60 및 70% 향상시켰다.

Claims (14)

  1. 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000001
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000002
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 겐콰닌 N(Genkwanine N) 또는 유안후아신(Yuanhuacine)은 팥꽃나무 추출물로부터 분리된 화합물인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 물, C1 내지 C5의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 분획물은 헥산 분획물 또는 에틸 아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물, 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000003
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000004
  9. 제8항에 있어서,
    상기 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP), 류마티스 관절염, 정신분열증(schizophrenia) 및 조울증(manic depression)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  10. 팥꽃나무 추출물, 이의 분획물, 또는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 Nurr1 활성화 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000005
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000006
  11. 화학식 1로 표시되는 겐콰닌 N(Genkwanine N) 및 화학식 2로 표시되는 유안후아신(Yuanhuacine)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 팥꽃나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 첨가물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000007
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2011009110-appb-I000008
  12. 제11항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 기능성 식품 첨가물.
  13. 제1항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  14. 제8항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료 방법.
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