WO2017111429A1 - 들쭉 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료용 조성물 - Google Patents

들쭉 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료용 조성물 Download PDF

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WO2017111429A1
WO2017111429A1 PCT/KR2016/014935 KR2016014935W WO2017111429A1 WO 2017111429 A1 WO2017111429 A1 WO 2017111429A1 KR 2016014935 W KR2016014935 W KR 2016014935W WO 2017111429 A1 WO2017111429 A1 WO 2017111429A1
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extract
blueberry
dry eye
resin
carbon atoms
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PCT/KR2016/014935
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손미원
이태호
백남준
권용삼
이상진
이봉경
김효명
정세영
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동아제약 주식회사
고려대학교 산학협력단
경희대학교 산학협력단
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/45—Ericaceae or Vacciniaceae (Heath or Blueberry family), e.g. blueberry, cranberry or bilberry

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, treating or ameliorating dry eye, comprising a blueberry extract and / or a blueberry fraction extract.
  • Dry eye syndrome is a general term for disorders in the tear film due to damage to one or all of the tear film itself or structures on the eye surface responsible for the production of the tear film (cornea, conjunctiva, goblet cells, lacrimal glands, etc.). .
  • This is a disorder of the tear film due to lack of tear production or excessive evaporation, and is a disease that causes damage to the eye surface and causes discomfort.
  • a disease of tear and eye surface caused by various causes it is defined as a disease that causes discomfort, vision impairment, destabilization of tear film along with eye surface damage, and is accompanied by increased osmotic pressure of tear film and inflammation of eye surface.
  • Dry eye syndrome is a major cause of tear gland dysfunction, such as lacrimal occlusion, changes in tear film stability and composition, inflammation of the eye surface and apoptosis.
  • Systemic factors include age, sex, hormonal changes, autoimmune diseases, and contact lens wear.
  • Environmental factors include dry living conditions, computers, video, and mobile devices. Dry eye syndrome is a disease with increasing prevalence with age and higher incidence of female than male. It is characterized by the high prevalence of 20s, and is not related to the increase in the use of smartphones.
  • Dry eye syndrome is a multifactorial disease caused by various causes, and approaches to treatment have also been studied in various ways. Among them, research on inflammation and apoptosis of the eye surface has been actively conducted. In particular, it has been reported that dry stress causes activation of NF- ⁇ b and AP-1 and elevated IL-1 ⁇ , resulting in corneal barrier damage with inflammation of the ocular surface (Ophthalmology, 154 (1): 63-71, 2012 , Mol Vis, 17: 533-42, 2011). against this background, there is a need for the development of therapeutic methods through inhibition of inflammation of the ocular surface and recovery of corneal barrier damage thereby.
  • blueberries (Bog bilberry, vaccinium uliginosum L) is a deciduous broad-leaved small shrub ( Vaccinium uliginosum ) of the Ericaceae family, the stem is about 1 meter high and dark brown. Fruits are round berry and ripen in autumn. Blueberries are edible. It is common in cold regions of high mountains and plateaus, and is distributed in Korea, Manchuria, Mongolia, Japan, Europe, and North America. Blueberry components include flavonoids and anthocyanins.
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2011-0102246 discloses a blueberry extract or a fraction extract for treating macular degeneration.
  • the method of fractionation of the patent is a method of fractionating by solid phase extraction (SPE), so it is not suitable as a health functional food material because it uses an organic solvent such as ethyl acetate, C18 Sep-Pak cartridge and the like in the manufacturing process Fractionation method is used which is not suitable for mass production process.
  • macular degeneration is a disease that occurs in the nerve tissue located in the center of the inner retina of the eye, a disease that is completely different from the treatment of the disease compared to dry eye.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome comprising blueberry extract and / or blueberry fraction extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health food for preventing or improving dry eye syndrome comprising blueberry extract and / or blueberry fraction extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating dry eye syndrome, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a blueberry extract and / or a blueberry fraction extract as an active ingredient.
  • the present inventors are conducting research and development on the use of the blueberry extract and the blueberry fraction extract that can be commercially mass-produced in humans, and the blueberry extract and the blueberry fraction extract express NF- ⁇ b and activating protein-1 (AP-1). Inhibition of inflammation through the action effect, such as inhibiting, and confirmed that the effect of inhibiting the ocular surface damage is excellent, accordingly confirmed that blueberry extract and blueberry fraction extract can be used as a treatment for dry eye syndrome Was completed.
  • AP-1 activating protein-1
  • the blueberry extract, the blueberry fraction extract of the present invention or all of them exhibit excellent therapeutic effects in the inhibition of corneal inflammation, corneal damage, etc. can be used as a pharmaceutical composition and health functional food useful for the prevention or treatment of dry eye syndrome.
  • Figure 1 shows a graph scoring the degree of corneal damage treatment of the blueberry fraction extract against Scopolamine induced dessicating stress. (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 vs control)
  • Figure 2 shows a photograph taken with a slit-lamp microscope to determine the extent of corneal damage treatment of the blueberry fraction extract against Scopolamine induced dessicating stress.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome comprising blueberry extract, blueberry fraction extract or both as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating dry eye syndrome according to the present invention shows an excellent effect on the prevention or treatment of dry eye syndrome through inhibition of inflammation through the inhibition of expression of NF- ⁇ b and AP-1, recovery of eye surface damage, and the like.
  • oral administration also shows an excellent effect of the medication compliance is very high.
  • fraction extract in the present invention means the result obtained by the fractionation method of separating a specific component or a specific group from a mixture comprising various components.
  • the blueberry extract and the blueberry fraction extract according to the present invention are not limited thereto.
  • the blueberry extract and the blueberry fraction extract may be free of impurities such as sugar and have a high total polyphenol content as an indicator component.
  • the blueberry extract and the blueberry fraction extract according to the present invention may contain 1% to 60% by weight of polyphenols based on the total weight.
  • the blueberry fraction extract may contain a high content of polyphenols 2 to 60% by weight, more preferably 3 to 15% by weight, even more preferably 4 to 12% by weight relative to the total weight.
  • dry eye syndrome refers to eye dryness caused by dry eye such as keratitis sicca, xerophthalmia, keratoconjunctivitis sicca (KCS), or cornea sicca. Includes all diseases.
  • the blueberry ( vaccinium uliginosum L) may be extracted from the flowers, fruits, leaves or bark of the blueberry, preferably from the fruit of the blueberry. Moreover, what was harvested, what was cultivated, or what is marketed can be used without limitation.
  • the blueberry extract may be prepared by extracting the blueberry extract under water, anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a hydrous lower alcohol solvent having 1 to 4 carbon atoms.
  • Anhydrous lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms are lower alcohols that do not contain water, such as, but not limited to, methanol, ethanol, propanol, butanol, isobutanol.
  • the lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms is a lower alcohol mixed with water, for example, a mixed solvent of methanol, ethanol, propanol, butanol, isobutanol and water, but is not limited thereto.
  • the solvent may be water.
  • the extraction method it is preferable to use shaking extraction, Soxhlet extraction or reflux extraction, but is not limited thereto.
  • the blueberry extract according to the present invention may be prepared by treating and heating the enzyme with blueberry under water, anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms.
  • the enzyme can be treated on the blueberry to enhance the polyphenol content of the blueberry.
  • the enzyme is amylase, glugoamylase, protease, oxidase, polymethylgalacturonase, polygalacturonase, glucosidase, cellulose, and cellulose.
  • pectinase and more preferably, pectinase may be used.
  • Heating after the enzyme treatment may be carried out for 1 hour to 10 hours, preferably 1 hour to 4 hours, the reaction temperature may be carried out at 40 to 65 °C, preferably 45 to 60 °C.
  • Preparation of the blueberry extract of the present invention may further comprise the step of filtering, concentrating and drying the extract after extracting the blueberry extract.
  • the filtration can obtain a filtrate or supernatant by filtering the solution or by centrifugation according to conventional methods in the art.
  • the concentration is reduced pressure concentration
  • the reduced pressure concentration is preferably a vacuum reduced pressure concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the blueberry fraction extract can be prepared by extracting the blueberry extract under water, anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a hydrous lower alcohol solvent having 1 to 4 carbon atoms, and passing it through a resin.
  • the preparation step of the blueberry extract is as described above.
  • the blueberry fraction extract according to the present invention comprises the steps of: (a) treating the enzyme with blueberry under water, anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms; (b) can be prepared by passing the extract of step (a) through the resin.
  • the enzyme may be treated in the blueberry to enhance the polyphenol content of the blueberry.
  • the enzyme is amylase, glugoamylase, protease, oxidase, polymethylgalacturonase, polygalacturonase, glucosidase, cellulose, and cellulose.
  • pectinase and more preferably, pectinase may be used.
  • Heating after the enzyme treatment may be carried out for 1 hour to 10 hours, preferably 1 hour to 4 hours, the reaction temperature may be carried out at 40 to 65 °C, preferably 45 to 60 °C.
  • Passing the blueberry extract of the step (b) through the resin is preferably a resin filtration method or a resin column using the adsorption resin.
  • the resin can be XRD resin, XDA resin, Amberlite XAD resin, Dow X resin, Superlite, DAX resin, Diaion HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 and HP-50 resin.
  • XDA resin, XRD resin, HP-20 resin or a mixed resin thereof may be used.
  • Preparation of the blueberry fraction extract of the present invention may further comprise the step of filtering, concentrating and drying the extract after extracting the blueberry extract.
  • the filtration can obtain a filtrate or supernatant by filtering the solution or by centrifugation according to conventional methods in the art.
  • the concentration is reduced pressure concentration
  • the reduced pressure concentration is preferably a vacuum reduced pressure concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the blueberry fraction extract filtered or eluted with the anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or the hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may be concentrated and dried.
  • the concentration may be concentrated under reduced pressure, and the concentration under reduced pressure may be a vacuum reduced pressure concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the blueberry fraction By passing the extracted blueberry extract through the resin, the blueberry fraction can be prepared by removing the sugar component of the blueberry extract and greatly increased the total polyphenol content. This is preferable in that it does not use an organic solvent harmful to the human body can exhibit an excellent effect on human application.
  • blueberry extract may be prepared by treating pectinase and heating the blueberry extract.
  • the resin of the step (a) is loaded on the resin, anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or lower water-containing 1 to 4 carbon atoms
  • the blueberry fraction extract can be prepared by filtering 1 to 3 times with alcohol, preferably 20 to 99% methanol or 20 to 99% ethanol.
  • the anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or the hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may further include 0.01% to 1% acetic acid.
  • the lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may be filtered with water before filtration to remove various impurities including sugars.
  • the extract of the step (a) to the resin in the column tube (loading) and anhydrous lower alcohol or carbon number of 1 to 4 carbon atoms can be prepared by eluting with 1-3 hydrous lower alcohols, preferably 20-99% methanol or 20-99% ethanol one to three times.
  • the anhydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or the hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may further include 0.01% to 1% acetic acid.
  • impurities may be removed by filtration with water before filtration with the lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms.
  • the blueberry extract, the blueberry fraction extract, or both, prepared according to the above-mentioned preferred production method, have large amounts of components such as sugars removed as impurities, and have a high total polyphenol content.
  • Blueberry extract and blueberry fraction extract according to the present invention may contain from 1% to 60% by weight of total polyphenols relative to the total weight.
  • the content of polyphenol is preferably 2 to 60% by weight, even more preferably 3 to 15% by weight, and most preferably 4 to 12% by weight, based on the total weight, to prevent and improve dry eye syndrome. And a marked effect on treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to blueberry extract, blueberry fraction extract or both.
  • pharmaceutically acceptable carriers are those commonly used in the art, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may include diluents or excipients, such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • compositions of the present invention may be oral or parenteral (eg, applied or intravenous, subcutaneous, intraperitoneal), but oral administration is preferred.
  • Solid preparations for oral administration include powders, granules, tablets, capsules, soft capsules, pills and the like.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and aerosols.In addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. Can be.
  • Formulations for parenteral administration may be formulated in the form of sterile aqueous solutions, solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, eye drops, ophthalmic ointments, syrups, suppositories, aerosols and the like, and sterile injectables, respectively, according to conventional methods. It can be used, preferably a pharmaceutical composition of creams, gels, patches, sprays, ointments, warnings, lotions, linings, eye ointments, eye drops, pasta or cataplasma may be prepared and used, It is not limited to this. Compositions of topical administration may be anhydrous or aqueous, depending on the clinical prescription.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 99.9 parts by weight based on the composition.
  • Preferred dosages of the compositions of the present invention vary depending on the degree of absorption of the active ingredient in the body, the age, sex and obesity of the patient, but may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, oral dosages are generally administered to adults in an amount of 0.0001 to 100 mg / kg per day, preferably 0.001 to 100 mg / kg, per kg body weight per day. It is good. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • composition for preventing or treating dry eye syndrome of the present invention may contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to blueberry extract, blueberry fraction extract or both.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving dry eye syndrome including blueberry extract, blueberry fraction extract, or both as an active ingredient.
  • the health functional food for preventing or improving dry eye syndrome according to the present invention shows an excellent effect on the prevention or treatment of dry eye syndrome through inhibition of inflammation through the inhibition of expression of NF- ⁇ b and AP-1, recovery of eye surface damage, and the like.
  • oral administration also shows an excellent effect of the medication compliance is very high.
  • the blueberry extract, blueberry fraction extract, or both of the present invention When used as a nutraceutical food or nutraceutical additive, the blueberry extract, blueberry fraction extract, or both are added as is or used together with other food or food ingredients, and It may be appropriately used depending on the method.
  • the amount of the blueberry extract, the blueberry fraction extract, or both may be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or improvement, therapeutic treatment). In the case of long-term intake for health and hygiene or for health control, the blueberry extract and the blueberry fraction extract have no problem in terms of safety, and therefore, long-term intake can be achieved.
  • the blueberry extract and / or blueberry fraction extract may be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, ice products including ice cream, various Soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, and vitamin complexes.
  • the blueberry extract, the blueberry fraction extract, or a liquid component added in addition to all of them are not limited thereto, and may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in general beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates include monosaccharides (e.g. glucose, fructose, etc.), disaccharides (e.g.
  • sweeteners such as taumarin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic sweeteners e.g., saccharin, aspartame, etc.
  • the nutraceuticals of the present invention may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, colorants and enhancers (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof. , Organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the food composition of the present invention may also contain pulp for the production of fruit and vegetable drinks. These components may be used alone or in combination, and the proportion of such additives is generally selected in the range of 0.001 to 50 parts by weight per total weight of the composition.
  • the blueberry extract, blueberry fraction extract, or both of the present invention may be powders, granules, tablets, capsules, syrups or beverages.
  • the present invention provides a method for preventing or treating dry eye syndrome, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a blueberry extract and / or a blueberry fraction extract as an active ingredient.
  • blueberry extract In the present invention, the terms “blueberry extract”, “blueberry fraction extract”, and “dry eye syndrome” are the same as described above.
  • the term "individual" in the present invention may refer to all animals, including humans that have or is likely to develop dry eye.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present invention may specifically include administering the composition in a pharmaceutically effective dose to an individual with or at risk of developing dry eye syndrome.
  • 600 kg of frozen blueberry raw material (origin: Heilongjiang, China) was dissolved at room temperature. 1,200 L of water was added, 0.6 kg of pectinase was added, and the mixture was heated and stirred at 50 to 55 ° C. for 2 hours. The stirred solution was filtered and the supernatant was separated by centrifugation at 3,300-3,600 r / min. Then, 600 kg of resin (HP-20 resin) was placed in a column tube, and the separated supernatant was added, followed by flowing down at a flow rate of 10 to 12 L / min. Thereafter, 600 L of water was added thereto and flowed down at a flow rate of 10 to 12 L / min.
  • resin HP-20 resin
  • Example 5 Blueberry Extract Total Polyphenols (Total polyphenol A) concentration analysis
  • Tannin acid standard solution was prepared as a standard (solution) for the AOAC analysis.
  • the standard solution was precisely measured about 100 mg of tannic acid and placed in a 1,000 ml volumetric flask and mixed well by adding distilled water. Then, the standard solution was diluted to an appropriate concentration to prepare a standard solution of 0.1 ⁇ 0.5 mg / ml.
  • blueberry extract and blueberry fraction extract samples were precisely measured as a test solution for AOAC analysis, and the resultant was placed in a 10 ml volumetric flask and ultrasonically shaken for 20 minutes. The solution was lined with distilled water, shaken well, and used as a test solution.
  • a calibration curve of the standard material was prepared by using the difference between the absorbance of each standard and the absorbance of each blank test. The difference between the absorbance of the sample and the blank test absorbance of the sample was applied to the calibration curve. The concentration of phenol (total polyphenol) was obtained.
  • the inhibitory effect on dry eye was evaluated in the scopolamine-induced mouse dry eye model using the blueberry fraction extract obtained in Example 3.
  • 6-week-old male C57 / BL6 male mice (Dae Biolink, Korea) were fed with standard diet and water at 22-24 ° C and 60-80% humidity for 1 week.
  • 15 mg / kg of scopolamine was administered three times a day (10, 14, 16 o'clock) and the room humidity was maintained at 34% humidity and dry eye was induced for 2 weeks.
  • Each individual was weighed and the top 70% were selected as experimental animals and the bottom 30% were eliminated.
  • the above 70% of the selected mice were divided into 8 groups for each group, and each drug was orally administered at 10:00 AM daily for 2 weeks.
  • eye drops were applied twice a day using 0.05% of cyclosporine.
  • mice were subjected to corneal fluorescent staining after 2 weeks of drug administration. Stained with Fluorescein sodium (F6377, sigma Aldrich) for 1 minute, then washed with PBS, and photographed through a fluorescence filter of a slit-lamp microscope. Scoring was performed using a 15-point grading system set by the National Eye Institute (NEI).
  • NKI National Eye Institute
  • the blueberry fraction extract group compared with the negative control group had a low corneal staining score in a dose-dependent manner.
  • the 100 mg / kg administration group showed 82.64% lower corneal staining score than the negative control group, and showed similar treatment efficacy to cyclosporin, an eyedrop medication.
  • the oral administration of the blueberry fraction extract can show more efficacy than the topical administration drug.
  • pNF- ⁇ b-luc, or pAP1-luc reporter plasmid was introduced into the cells. Transfection was performed by mixing each plasmid (4 ug) in a liquid of lipofector Q (APTABIO) and OptiMem (Invitrogen) and left at room temperature for 20 minutes to form a DNA complex for transfection. This was completed by adding the cells in culture and incubating at 37 ° C. for 6 hours. PMA (phorbol myristate acetate) was treated with transfected cells at a concentration of 10 ng / ml for 6 hours to activate the respective NF- ⁇ b and AP-1 pathways.
  • API lipofector Q
  • Luciferase activity induced by PMA treatment was measured using a luminometer (luminometer, Victor X3. PerkinElmer) in the presence of luciferase substrate.
  • Cell lines transformed by transfection for the activity measurement of the blueberry fraction extract or component were treated with the blueberry fraction extract or component at a predetermined concentration 1 hour before the PMA.
  • the expression inhibition rate of the reporter gene was calculated as the reduction rate of luciferase activity compared to DMSO treatment and the experimental results are shown in Table 3.
  • Blueberry Extract or Blueberry Fraction Extract of the Present Invention 100 mg
  • the above ingredients were mixed and made into 2 ml by a conventional method, and then filled into 2 ml ampoules and sterilized to prepare an injection.
  • the tablets were prepared by mixing the above components and tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • Blueberry Extract or Blueberry Fraction Extract of the Present Invention 100 mg
  • Magnesium stearate appropriate amount
  • the capsules were prepared by mixing the above components and filling the gelatin capsules according to a conventional method for preparing capsules.
  • the above ingredients were mixed according to a conventional method for preparing a liquid, filled into 100 ml brown bottles, and sterilized to prepare a liquid.

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Abstract

본 발명은 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 포함하는 안구건조증 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 각막 염증 억제, 각막 손상 억제 등에 있어 우수한 치료 효과를 나타내어 안구건조증의 예방 또는 치료에 유용한 약제학적 조성물 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

Description

들쭉 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 치료용 조성물
본 발명은 들쭉 추출물 및/또는 들쭉 분획 추출물을 포함하는 안구 건조증의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
안구건조증(dry eye syndrome)은 눈물막 자체 혹은 눈물막 생산을 담당하는 안구표면의 구조물(각막, 결막, 배상 세포, 눈물샘 등) 중 하나 혹은 전부의 손상때문에 눈물막에 이상이 나타나는 질환을 총칭한다. 이는 눈물의 생성 부족이나 과도한 증발에 기인한 눈물막의 장애로서, 안구표면의 손상이 초래되어 불쾌감을 유발하는 질환이다. 최근에는 다양한 원인에 의한 눈물 및 안구표면의 질환으로서 안구표면 손상을 수반하여 불쾌감, 시력장애, 눈물막의 불안정화 등을 야기하고 또한 눈물막의 삼투압 증가와 안구표면의 염증을 동반하는 질환으로 정의 내리고 있다.
이러한 안구 건조증은 눈물샘 폐색과 같은 눈물샘 기능장애, 눈물막 안정성 및 구성의 변화, 안구표면의 염증과 세포사멸이 주요한 병인이라고 할 수 있다. 전신적인 요인으로는 연령, 성별, 호르몬 변화, 자가면역질환, 콘택트렌즈의 착용 등이 있으며, 환경적인 요인으로는 건조한 생활환경, 컴퓨터, 비디오, 휴대기기 사용 등이 있다. 안구건조증은 나이가 들수록 유병율이 증가하며, 남성보다는 여성의 발병율이 높은 질환이다. 최근 20대의 유병율이 높은 것이 특징이며, 스마트폰 사용의 증가와 무관하지 않음을 알 수 있다.
현재 시판 중인 안구건조증 전문치료제는 면역조절제인 레스타시스 점안액(cyclosporine 0.05%)이 유일하나 항염증 작용을 통하여 약효를 나타내기 때문에 환자가 만족할만한 약효를 나타내기 위해서는 수개월 동안 반복하여 사용하여야 하고, 작열감 등의 부작용이 있다는 단점을 가지고 있다 (Ophthalmology, 107:631-9, 2000: Thomson Pharma, www.thomson-pharma.com). 그 이외에 부족한 눈물을 일시적으로 보충해주는 인공 눈물 제제와 안구 건조증 등에 동반되어 나타나는 각막, 결막 상피 장애 치료제가 흔히 사용되고 있으나 이는 일시적 요법에 불과할 뿐 안구건조증의 실질적 치료제라고 할 수는 없다. 즉, 단순히 증상만을 완화시키는 대증요법제가 아니면서 부작용이 없는 안전하면서도 보다 근본적으로 안구건조증을 치료할 수 있는 안구건조증에 대한 치료제의 개발이 여전히 이루어지지 않은 상태이다.
이러한 안구건조증은 다양한 원인에 의하여 발병하는 다인성 질환이며, 치료에 대한 접근법 역시 다양하게 연구되고 있다. 그 중에서도 안구표면의 염증과 세포사멸에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 건조 스트레스에 의해 NF-κb 및 AP-1이 활성화되고 IL-1β가 높아지면서 안구표면의 염증과 함께 각막 장벽 손상을 일으킨다는 보고가 있다 (Ophthalmology, 154(1):63-71, 2012, Mol Vis, 17:533-42, 2011). 이러한 배경하에, 안구 표면의 염증 억제와 이로 인한 각막 장벽 손상에 대한 회복을 통한 치료 방법의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 들쭉(Bog bilberry, vaccinium uliginosum L)은 진달래과(Ericaceae)의 낙엽 활엽 작은 관목(Vaccinium uliginosum), 줄기는 높이가 1미터 정도이고 암갈색이다. 열매는 둥근장과로 가을에 검게 익으며, 들쭉이라고 하여 식용한다. 높은 산과 고원의 추운 지역에 흔히 나며, 한국, 만주, 몽고, 일본, 유럽, 북미 등지에 분포한다. 들쭉의 성분으로는 플라보노이드류, 안토시아닌류를 함유하고 있다.
대한민국 공개특허공보 제2011-0102246호에는 들쭉 추출물 또는 분획 추출물이 황반변성증의 치료 효과를 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허의 분획방법은 고체상 추출법(Solid Phase Extrcation:SPE)으로 분획하는 방법으로써 에틸아세테이트와 같은 유기용매를 사용하므로 건강기능식품 소재로서 적합하지 못하며, C18 Sep-Pak 카트리지 등을 제조 공정에 사용하여 대량생산공정에 적합하지 않는 분획방법을 사용하고 있다. 또한, 황반변성증은 눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직에 서 발병하는 질환으로, 안구 건조증과 대비하여 질환의 치료법이 전혀 상이한 질환이다.
이러한 배경하에, 근본적으로 안구 건조증을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 치료제가 개발될 필요성이 있다.
본 발명은 들쭉 추출물 및/또는 들쭉 분획 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 들쭉 추출물 및/또는 들쭉 분획 추출물을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명은 또한 들쭉 추출물 및/또는 들쭉 분획 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명자들은 인체 적합하게 상업적으로 대량생산 가능한 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물의 용도에 관한 연구 개발을 수행하던 중, 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물이 NF-κb와 활성화 단백질-1(AP-1)의 발현을 저해하는 등의 작용 효과를 통해 염증 억제 작용을 보이며, 안구표면 손상을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였으며, 이에 따라 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물이 안구 건조증 치료제로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두는 각막 염증 억제, 각막 손상 억제 등에 있어 우수한 치료 효과를 나타내어 안구건조증의 예방 또는 치료에 유용한 약제학적 조성물 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
도 1은 스코폴라민 유발 건조스트레스(Scopolamine induced dessicating stress)에 대한 들쭉 분획 추출물의 각막 손상 치료 정도를 점수화한 그래프를 나타낸다. (* p<0.05, ** p<0.01 vs control)
도 2는 스코폴라민 유발 건조스트레스(Scopolamine induced dessicating stress)에 대한 들쭉 분획 추출물의 각막 손상 치료 정도를 확인하기 위해 세극등현미경(Slit-lamp microscope)로 촬영한 사진을 나타낸다.
본 발명은 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 안구건조증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 NF-κb 및 AP-1의 발현 저해 등을 통한 염증 억제, 안구 표면 손상 회복 등을 통해서 안구건조증 예방 또는 치료에 우수한 효과를 보인다. 또한, 경구 투여를 통해서도 우수한 작용 효과를 보여 복약 순응도가 매우 높다.
본 발명에서 용어 "분획 추출물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획 방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에 따른 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 이에 한정되지는 않지만, 바람직하게 당 등의 불순물이 제거되고 지표성분으로 높은 총 폴리페놀 함량을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 총 중량에 대하여 폴리페놀을 1 중량% 내지 60 중량%로 함유할 수 있다. 특히, 들쭉 분획추출물은 총중량에 대하여 바람직하게 폴리페놀을 2 내지 60 중량%, 보다 바람직하게 3 내지 15 중량%, 보다 더 바람직하게 4 내지 12 중량%의 높은 함량으로 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "안구 건조증(DES)"은 각막염(keratitis sicca), 안구 건조증(xerophthalmia), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca)(KCS) 또는 각막건성(cornea sicca) 등의 안구 건조에 의해 유발되는 안질환을 모두 포함한다.
본 발명에 있어서 들쭉(vaccinium uliginosum L)은 들쭉나무의 꽃, 열매, 잎 또는 수피 등으로부터 추출될 수 있으며, 바람직하게는 들쭉나무의 열매로부터 추출될 수 있다. 또한, 채취한 것이나 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다.
들쭉 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 용매 하의 들쭉 추출물을 추출함으로써 제조될 수 있다.
탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올은 물을 함유하지 않은 저급 알코올로써 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올은 물과 혼합된 저급 알코올로 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올과 물의 혼합용매이며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 용매는 물일 수 있다.
추출방법으로는 진탕추출, 속슬렛(Soxhlet) 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게, 본 발명에 따른 들쭉 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 하의 들쭉에 효소를 처리하고 가열하여 추출하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
상기 효소는 들쭉의 폴리페놀 함량 증진을 위해 들쭉에 처리될 수 있다. 바람직하게, 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 글루고아밀라제, 프로테아제, 옥시다아제, 폴리메틸갈락투로나아제(polymethylgalacturonase), 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 글루코시다아제(glucosidase), 셀룰라아제(cellulose) 또는 펙티나아제(pectinase)로부터 선택된 어느 하나 일 수 있으며, 보다 바람직하게 펙티나아제가 사용될 수 있다. 상기 효소 처리 후 가열은 1시간 내지 10시간, 바람직하게는 1시간 내지 4시간 동안 수행될 수 있으며, 반응 온도는 40 내지 65℃, 바람직하게 45 내지 60℃로 반응이 수행될 수 있다.
본 발명의 들쭉 추출물의 제조는 상기 들쭉 추출물을 추출한 후에 추출물을 여과, 농축 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 여과는 당업계의 통상의 방법에 따라 용액을 여과하거나 원심분리를 통해 여액 또는 상등액을 수득할 수 있다. 상기 농축은 바람직하게 감압 농축이며, 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
들쭉 분획 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 용매 하의 들쭉 추출물을 추출하고, 이를 레진에 통과시킴으로써 제조될 수 있다. 들쭉 분획 추출물 제조에 있어 들쭉 추출물의 제조 단계는 앞서 살핀 바와 같다.
바람직하게, 본 발명에 따른 들쭉 분획 추출물은 (a) 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 하의 들쭉에 효소를 처리하고 가열하여 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 추출물을 레진에 통과시키는 단계에 의해 제조될 수 있다.
상기 (a) 단계에서 상기 효소는 들쭉의 폴리페놀 함량 증진을 위해 들쭉에 처리될 수 있다. 바람직하게, 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 글루고아밀라제, 프로테아제, 옥시다아제, 폴리메틸갈락투로나아제(polymethylgalacturonase), 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase), 글루코시다아제(glucosidase), 셀룰라아제(cellulose) 또는 펙티나아제(pectinase)로부터 선택된 어느 하나 일 수 있으며, 보다 바람직하게 펙티나아제가 사용될 수 있다. 상기 효소 처리 후 가열은 1시간 내지 10시간, 바람직하게는 1시간 내지 4시간 동안 수행될 수 있으며, 반응 온도는 40 내지 65℃, 바람직하게 45 내지 60℃로 반응이 수행될 수 있다.
상기 (b) 단계의 들쭉 추출물을 레진에 통과시키는 단계는 흡착수지를 이용하여 레진 여과 방식 또는 레진 컬럼 이용 방식이 바람직하다. 상기 레진은 XRD 레진, XDA 레진, 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트, DAX 레진, 다이아이온 HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 및 HP-50 레진 등이 이용 가능하며, 바람직하게 XDA 레진, XRD 레진, HP-20 레진 또는 이의 혼합 레진을 사용할 수 있다.
본 발명의 들쭉 분획 추출물의 제조는 상기 들쭉 추출물을 추출한 후에 추출물을 여과, 농축 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 여과는 당업계의 통상의 방법에 따라 용액을 여과하거나 원심분리를 통해 여액 또는 상등액을 수득할 수 있다. 상기 농축은 바람직하게 감압 농축이며, 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올로 여과 또는 용출된 들쭉 분획 추출물은 농축 및 건조될 수 있다. 바람직하게 감압 농축될 수 있으며, 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 추출된 들쭉 추출물은 레진에 통과시킴으로써, 들쭉 추출물의 당 성분을 제거하고 총 폴리페놀 함량을 크게 증가시킨 들쭉 분획물이 제조될 수 있다. 이는 인체에 유해한 유기 용매를 사용하지 않아 인체 적용에 우수한 작용효과를 보일 수 있는 점에서 바람직하다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 들쭉 추출물 제조 방법에 따르면, 들쭉 추출물에 펙티나아제를 처리하고 가열하여 들쭉 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 들쭉 분획 추출물의 제조 방법 중 레진 여과 방식에 따르면, 레진에 상기 (a) 단계의 추출물을 loading하고, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올, 바람직하게 20 내지 99% 메탄올 또는 20 내지 99% 에탄올로 1 내지 3회 여과하여 들쭉 분획 추출물을 제조할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올은 0.01% 내지 1% 아세트산을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 여과 전 물로 여과하여 당을 비롯한 다양한 불순물을 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 들쭉 분획 추출물의 제조 방법 중 레진 컬럼 이용 방식에 따르면, 컬럼관 내 레진에 상기 (a) 단계의 추출물을 주입(loading)하고 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올, 바람직하게 20 내지 99% 메탄올 또는 20 내지 99% 에탄올로 1 내지 3회 용출하여 들쭉 분획 추출물을 제조할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올은 0.01% 내지 1% 아세트산을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 여과 전 물로 여과하여 불순물을 제거할 수 있다.
상기 바람직한 제조 방법에 따라 제조된 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두는 불순물로 예컨대 당 등의 성분이 다량 제거되고, 높은 총 폴리페놀 함량을 가진다.
본 발명에 따른 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 총 중량에 대하여 총 폴리페놀을 1 중량% 내지 60 중량%로 함유할 수 있다. 들쭉 분획 추출물의 경우, 총 중량에 대하여 폴리페놀을 바람직하게 2 내지 60 중량%, 보다 더 바람직하게 3 내지 15 중량%, 가장 바람직하게 4 내지 12 중량%의 함량을 가짐으로써 안구 건조증의 예방, 개선 및 치료에 현저한 효과를 보인다.
본 발명의 약제학적 조성물은 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로 필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 약제학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~99.9 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별 및 비만의 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 안구건조증 예방 또는 치료용 조성물은 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명은 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 안구 건조증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 안구건조증 예방 또는 개선용 건강기능식품은 NF-κb 및 AP-1의 발현 저해를 통한 염증 억제, 안구 표면 손상 회복 등을 통해서 안구건조증 예방 또는 치료에 우수한 효과를 보인다. 또한, 경구 투여를 통해서도 우수한 작용 효과를 보여 복약 순응도가 매우 높다.
본 발명의 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 건강 기능 식품 또는 건강 기능 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두의 혼합량은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우, 상기 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 장기간 복용이 가능하다.
상기 건강 기능 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 들쭉 추출물 및 /또는 들쭉 분획 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올이다. 이외에도 감미제로서 천연 감미제[타우마린, 스테비아 추출물(예, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 감미제(예, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
다른 실시양태로서, 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
다른 실시양태로서, 본 발명의 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료일 수 있다.
본 발명은 들쭉 추출물 및/또는 들쭉 분획 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 “들쭉 추출물”, “들쭉 분획 추출물”, 및 “안구건조증” 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 용어 “개체”는 안구건조증이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 안구건조증이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 투여량으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “투여량”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
이하, 하기 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이들 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 들쭉 추출물의 제조
냉동된 들쭉 원재료(열매, 원산지: 중국 흑룡강성) 600 kg를 상온에서 녹였다. 물 1,200 L를 넣고, 펙티나아제(Nanning Longbo (China, No.50126)) 0.6 kg를 넣은 후, 50~55℃에서 2시간 동안 가열 교반하였다. 그리고 나서, 여과하고, 여과액을 65 brix까지 농축하여 들쭉 추출물을 45 kg을 수득하였다.
< 실시예 2> 레진 컬럼을 이용한 들쭉 분획 추출물의 제조
에탄올 10 L로 레진 (HP-20 레진) 10 kg을 세척하고, 컬럼관에 넣었다. 물 10 L로 레진을 다시 세척하고, 실시예1에서 얻은 들쭉 추출물 1 kg를 주입(loading)하였다. 물 10 L를 용출(elution)하고, 50% 에탄올 (0.1% Acetic acid 용액) 25 L를 elution 한 후. 에탄올 10 L를 용출(elution)하였다, 50% 에탄올(0.1% Acetic acid 용액) 분획에 해당하는 들쭉 분획 추출물 용액을 45~60℃로 감압 농축한 후, 말토덱스트린를 첨가하고 분무건조하여, 들쭉 분획 추출물 180 g을 얻었다.
< 실시예 3> 레진 여과를 이용한 들쭉 분획 추출물의 제조
레진 (HP-20 레진) 10 kg를 여과기에 넣고 물로 세척하고, 실시예 1에서 얻은 들쭉 추출물 4 kg를 loading 한 후. 물 35 L로 여과하여 폐기하였다. 50% 에탄올 (0.1% Acetic acid 용액) 50 L를 가하여 여과하고, 여과액을 45~60℃로 감압농축한 후, 말토덱스트린를 첨가하고 분무건조하여, 들쭉 분획 추출물 790 g을 얻었다.
< 실시예 4> 들쭉 분획 추출물의 대량 제조
냉동된 들쭉 원재료(원산지: 중국 흑룡강성) 600 kg를 상온에서 녹였다. 물 1,200 L를 넣고, 펙티나아제 0.6 kg를 넣은 후, 50~55℃에서 2시간 동안 가열 교반한다. 교반액을 여과하고, 3,300-3,600 r/min에서 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 그리고 나서, 레진(HP-20 레진) 600 kg을 컬럼관에 넣고 상기 분리된 상층액을 넣은 후, 10~12 L/min의 유속으로 흘러내렸다. 그 후, 물 600 L를 넣고 10~12 L/min의 유속으로 흘러내렸다. 마지막으로 50~55% 에탄올 (0.1% Acetic acid 용액) 1,800 L를 넣고 5~6 L/min의 유속으로 흘러내리며 상기 분획액을 수득하였다. 또한 90~95% 에탄올를 넣고, 5~6 L/min의 유속으로 흘러내리며 95% 에탄올 분획을 수득하였다, 상기에 수득된 50% 에탄올 분획액과 95% 에탄올 분획액을 모아 45~55℃로 감압농축한 후, 말토덱스트린를 첨가하고 분무건조하여 들쭉 분획 추출물 30 kg을 얻었다.
< 실시예 5> 들쭉추출물의 총폴리페놀 (Total polyphenol ) 농도 분석
상기 <실시예 1> 내지 <실시예 4>에서 제조된 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물의 총폴리페놀(Total polyphenol) 농도를 분석하기 위하여 자외선분광광도계(UV/visible Spectrophotometer) 분석을 수행하였으며, 표준물질로는 탄닌산(Tannic acid)을 사용하는 국제분석화학자협회(Association of Official Analytical Chemists, AOAC) 법을 따라 분석을 진행하였다.
상기 AOAC 분석을 위하여 표준물질(용액)로 탄닌산 표준용액을 제조하였다. 상기 표준 용액은 탄닌산 약 100 mg을 정밀하게 측정하여 1,000 ml의 용량플라스크에 넣고 증류수를 가하여 잘 섞은 후 정용하였다. 그리고 나서, 상기 표준용액을 적정농도로 희석하여 0.1 ~ 0.5 mg/ml의 표준용액을 조제하였다.
또한, AOAC 분석을 위하여 시험용액으로 들쭉추출물 및 들쭉 분획 추출물 시료 약 30 mg을 정밀하게 측정하여 10 ml 용량플라스크에 넣고 증류수를 넣어 20분간 초음파 진탕하였다. 상기 용액에 증류수로 표선을 맞추고 잘 흔들어 시험용액으로 사용하였다.
분석을 위해 증류수 75 ml를 용량플라스크에 넣고, 상기에서 제조된 표준용액 및 시험용액을 각각 1 ml씩 가하였다. 상기 시험관에 폴린-데니스(Folin-denis) 시약 5 ml와 35% 탄산나트륨 10 ml를 가하여 혼합하고 증류수로 정용하였다. 그리고 나서, 실온에서 30분간 방치 후 760 nm에서 흡광도를 SPECTRAmax PLUS (Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
함량 농도 계산을 위하여, 표준물질의 농도별 흡광도와 각 공시험의 흡광도의 차를 이용하여 표준물질의 검량선을 작성하였고, 시료의 흡광도와 시료의 공시험 흡광도의 차를 검량선에 적용시켜 시험용액의 총 폴리페놀(total polyphenol)의 농도를 구하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1] 들쭉추출물 및 분획 추출물의 총폴리페놀의 함량
Figure PCTKR2016014935-appb-I000001
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 제조방법에 따라 제조된 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 크게 증가된 것이 확인되었다. 즉, 제조된 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물에서 높은 총 폴리페놀 함량이 확인되었다. 특히, 제조된 들쭉 분획 추출물에서 5% 이상의 높은 총 폴리페놀 함량이 확인되었다.
< 실시예 6> 들쭉 분획 추출물의 스코폴라민 유발 마우스 모델(High fat diet-induced obese mouse model)에서의 효과
상기 <실시예 3>에서 수득한 들쭉 분획 추출물을 이용하여 스코폴라민으로 유발된 마우스 안구건조 모델에서 안구건조에 대한 억제 효과를 평가하였다. 스코폴라민 유발 안구건조 마우스 모델의 제조를 위해, 6주령 수컷 C57/BL6 웅성 마우스(대한바이오링크, 한국)를 22~24℃, 습도 60~80% 상태에서 표준 식이와 물을 공급하며 1주간 순화사육한 후, 스코폴라민 15 mg/kg을 1일 3회 (10시, 14시, 16시) 투여하고 사육실 습도를 습도 34%로 유지시키고 2주간 안구 건조를 유발하였다. 각 개체의 무게를 측정하여 상위 70%를 실험동물로 선정하고 하위 30%는 탈락시켰다. 상기 선정된 상위 70%의 마우스를 각 군당 8마리씩으로 하여 체중을 기준으로 각 군으로 분리한 후 2주간 매일 오전 10:00 에 각 약물을 경구 투여하였다. 양성대조군으로는 사이클로스포린(cyclosporine) 0.05 %를 사용하여 1일 2회 점안하였다.
상기 마우스들에 대하여 2주간 약물 투여 후 각막 형광 염색이 수행되었다. 플루오레세인나트륨(Fluorescein sodium, F6377, sigma Aldrich)로 1분간 염색한 다음 PBS로 세척(washing)하고, 세극등현미경(slit-lamp microscope)의 형광 필터(filter)를 통해 사진을 촬영하였다. 염색점수의 계산(scoring)은 NEI (national eye institute)에서 설정한 15점 채점 시스템(grading system)을 사용하였다.
그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.
[표 2] 각막염색 점수 (N=8)
Figure PCTKR2016014935-appb-I000002
도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 대비 들쭉분획 추출물 투여군은 용량의존적으로 각막염색점수가 낮았다. 특히, 100 mg/kg 투여군에서는 음성대조군 대비 82.64% 낮은 각막염색점수가 나타났으며, 점안 투여 약물인 사이클로스포린과 유사한 수준의 치료 효능을 나타내었다.
또한, 도 2에 나타낸 염색 결과에서 확인되는 바와 같이, 들쭉 분획 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 각막 회복이 현저하게 이루어지는 것이 확인되었다.
즉, 들쭉 분획 추출물의 경구 투여를 통해서도 점안 투여 약물 이상의 효능을 나타낼 수 있음이 확인되었다.
< 실시예 7> 들쭉 분획 추출물의 염증억제 기전 확인 실험
A549 세포주를 6-웰 플레이트(well plate)에 배양 후 pNF-κb-luc, 또는 pAP1-luc 리포터 플라스미드(plasmid)를 세포 속에 도입하였다. 형질주입(transfection)은 각 플라스미드(plasmid) (4 ug) 를 lipofector Q (APTABIO)과 OptiMem (Invitrogen) 액상에서 혼합 후 20분간 상온에서 방치하여 형질주입(transfection)을 위한 DNA complex를 형성하게 하였으며, 이를 배양중인 세포에 가하고 6시간 동안 37℃에서 배양하여 완료되었다. 각 NF-κb 및 AP-1 경로를 활성시키기 위하여 PMA(phorbol myristate acetate)를 10 ng/ml 농도로 형질주입(transfection)에 의하여 형질전환된 세포에 6시간 동안 처리하였다. PMA 처리에 의하여 유도된 루시페라아제(luciferase)의 활성은 루시페라아제 기질(luciferase substrate) 존재시에 발광 정도를 루미노미터(luminometer, Victor X3. PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다. 들쭉 분획 추출물 또는 성분의 활성 측정을 위하여 형질주입(transfection)에 의하여 형질전환된 세포주는 PMA를 넣기 1시간 전에 정해진 농도의 들쭉 분획 추출물 또는 성분으로 처리되었다. 리포터 유전자(Reporter gene)의 발현 억제율은 DMSO 처리 대비 루시페라아제(luciferase)의 활성 감소율로 계산되었으며 상기 실험 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3] 들쭉 분획물 투여에 따른 NF - κb 및 AP-1의 발현 억제율 (N=8)
Figure PCTKR2016014935-appb-I000003
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 들쭉 분획 추출물 처리에 따라 농도 의존적으로 NF-κb 및 AP-1의 발현이 억제되는 것이 확인되었다. 이는 NF-κb 및 AP-1의 활성화에 의해 IL-1b가 높아지면서 안구표면의 염증과 함께 각막 장벽 손상을 일으키는 작용을 억제할 수 있는 들쭉 분획 추출물의 현저한 치료 작용 효과를 보여준다.
< 제조예 1> 주사제제의 제조
본 발명의 들쭉 추출물 또는 들쭉 분획 추출 100 mg
일염기인산나트륨 6.0 mg
벤질알콜 0.002 mL
염화나트륨 15 mg
주사용 멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2 ㎖로 한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
< 제조예 2> 정제의 제조
본 발명의 들쭉 추출물 또는 들쭉 분획 추출 200 mg
유당수화물 100 mg
미결정셀룰로오스 50 mL
크로스포비돈 15 mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제조예 3> 캡슐제의 제조
본 발명의 들쭉 추출물 또는 들쭉 분획 추출 100 mg
유당 50 mg
치환도히드록시프로필셀룰로오스 20 mg
이산화규소 5 mg
탈크 2 mg
스테아린산마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제제예 4> 액상제의 제조
본 발명의 들쭉 추출물 또는 들쭉 분획 추출 1000 mg
백당 20 g
무수구연산 3 g
과당 20 g
체리향 적량
정제수를 가하여 전체 100 mL
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100 ml의 갈색병에 충전하고 멸균시켜서 액제를 제조하였다.

Claims (22)

  1. 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 추출물 총 중량에 대하여 폴리페놀을 1 내지 60 중량%로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 안구건조증의 예방 또는 치료는 각막의 염증 억제에 의한 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 염증 억제는 AP-1 및 NF-κb의 발현 억제에 의한 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 들쭉 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 하의 들쭉에 효소를 처리하고 가열하여 추출되는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 들쭉 분획 추출물은 (a) 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 하의 들쭉에 효소를 처리하고 가열하여 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 추출물을 레진에 통과시키는 단계에 의해 제조되는 들쭉 분획 추출물인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올 또는 이의 혼합용매인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 효소는 아밀라아제, 글루고아밀라제, 프로테아제, 옥시다아제, 폴리메틸갈락투로나아제, 폴리갈락투로나아제, 글루코시다아제, 셀룰라아제 또는 펙티나아제로부터 선택되는 어느 하나인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 추출은 40 내지 65℃에서 1시간 내지 10시간 동안 수행되는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 레진은 XRD 레진, XDA 레진, 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트, DAX 레진, 다이아이온 HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 또는 HP-50 레진으로부터 선택된 어느 하나인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 레진에 통과시키는 단계는 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올로 용출 또는 여과하는 것인 안구건조증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 들쭉 추출물, 들쭉 분획 추출물 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 제12항에 있어서, 상기 들쭉 추출물 및 들쭉 분획 추출물은 추출물 총 중량에 대하여 폴리페놀을 1 내지 60 중량%로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  14. 제12항에 있어서, 상기 안구건조증의 예방 또는 개선은 각막의 염증 억제에 의한 것인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 제14항에 있어서, 상기 염증 억제는 AP-1 및 NF-κb의 발현 억제에 의한 것인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  16. 제12항에 있어서, 상기 들쭉 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 하의 들쭉에 효소를 처리하고 가열하여 추출되는 것인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  17. 제12항에 있어서, 상기 들쭉 분획 추출물은 (a) 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올 하의 들쭉에 효소를 처리하고 가열하여 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 추출물을 레진에 통과시키는 단계에 의해 제조되는 들쭉 분획 추출물인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  18. 제17항에 있어서, 상기 (a) 단계의 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올 또는 이의 혼합용매인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  19. 제17항에 있어서, 상기 (a) 단계의 효소는 아밀라아제, 글루고아밀라제, 프로테아제, 옥시다아제, 폴리메틸갈락투로나아제, 폴리갈락투로나아제, 글루코시다아제, 셀룰라아제 또는 펙티나아제로부터 선택되는 어느 하나인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  20. 제17항에 있어서, 상기 (a) 단계의 추출은 추출은 40 내지 65℃에서 1시간 내지 10시간 동안 수행되는 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  21. 제17항에 있어서, 상기 (b) 단계의 레진은 XRD 레진, XDA 레진, 엠버라이트 XAD 레진, 다우엑스 레진, 수페라이트, DAX 레진, 다이아이온 HP-10, HP-20, HP-30, HP-40 또는 HP-50 레진으로부터 선택된 어느 하나인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  22. 제17항에 있어서, 상기 (b) 단계의 레진에 통과시키는 단계는 탄소수 1 내지 4의 무수 저급 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 함수 저급 알코올로 용출 또는 여과하는 것인 안구건조증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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