WO2016153211A2 - 감귤류 과피 추출물의 제조방법 및 간 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

감귤류 과피 추출물의 제조방법 및 간 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a citrus peel, and more particularly, to a method for preparing an extract having a high polymethoxyflavoid content from citrus peel.
  • the present invention also relates to the use of citrus peel extracts as pharmaceuticals or as nutraceuticals.
  • Citrus fruits are widely produced in Korea and various varieties of citrus fruits are grown on Jeju Island including citrus (Citrus sunki hort. Ex Tanaka).
  • citrus fruit it has been known as a synonym for vitamin C.
  • flavonoids which are polyphenols having a small molecular weight, are one of these functional substances, and there are about 60 kinds of citrus fruits.
  • Most flavonoid materials have hydroxyl groups (-OH), which seem to be related to antioxidants and other functions.
  • nobiletin belongs to the flavone group having a large number of methoxy groups (CH3O-) among the flavonoids, which is known to have a higher biological activity than the flavone having a hydroxyl group.
  • Polymethoxy flavonoids (PMF) which are found only in citrus fruits, include nobiletin, tangeretin, and sinensitin, indicating the usefulness of citrus fruits as a natural material.
  • the polymethoxy flavonoids (PMF) is extracted or fractionated from the citrus peel, citrus peel extract because most of the organic solvent such as acetic acid, hexane, etc. in the fractionation step to increase the content of polymethoxy flavonoids (PMF) Is limited to use as a drug or food ingredient.
  • PMF polymethoxyflavonoids
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 10-2015-0020001 discloses one hydroxy group polymethoxyflavone compound and the pharmaceutical Disclosed is a pharmaceutical composition for treating fatty liver, comprising a salt which can be accommodated in the above, or a substance prepared in any ratio in the above form, or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition for treating fatty liver comprising a salt which can be accommodated in the above, or a substance prepared in any ratio in the above form, or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • fatty liver improver pharmaceutical composition comprising, 7,8,3 ', 4'-pentamethoxyflavone as an active ingredient is disclosed.
  • Prior Art 1 and Prior Art 2 only mention fatty liver caused by obesity or lipid metabolism due to the effects of polymethoxyflavonoids (PMF), but do not mention liver damage caused by other factors.
  • prior art 3 (Satomi Onoue, et al., 2013.
  • the present invention has been derived under such a conventional background, and an object of the present invention is to provide a method for producing an extract having a high specific polymethoxyflavoid content from citrus peels economically and conforming to food standards.
  • Another object of the present invention is to provide a medicinal use or equivalent use of the citrus peel extract containing a specific polymethoxyflavonoid.
  • an example of the present invention is the step of obtaining an extract containing the extract by adding and extracting a water-containing lower alcohol having an alcohol concentration of 50 to 80% by weight to the citrus peel; Filtering the extract and concentrating the filtered extract to obtain a concentrated extract; And adding a lower alcohol aqueous solution having a water or alcohol concentration of 30% by weight or less to the concentrated extract and standing still to precipitate the extract, and separating the obtained extract to obtain an extract in the form of a precipitate. do.
  • the lower alcohol is an alcohol having 1 to 4 carbon atoms.
  • the extract of the precipitate form in the method for producing a citrus peel extract according to an embodiment of the present invention comprises nobiletin (nobiletin) and tangeretin (tangeretin).
  • one embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a citrus peel extract as an active ingredient.
  • the citrus peel extract includes nobiletin and tangeretin.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention may be used for the purpose of preventing or treating liver damage caused by alcohol, drugs, bile secretion abnormalities or bile congestion.
  • one embodiment of the present invention provides a food composition comprising a citrus peel extract as an active ingredient.
  • the citrus peel extract includes nobiletin and tangeretin.
  • the food composition according to an embodiment of the present invention may be used for the purpose of preventing or ameliorating liver damage caused by alcohol, drugs, bile secretion abnormalities or bile congestion.
  • the manufacturing method of the citrus peel extract according to the present invention is economical because the energy consumption is minimized during the concentration process is suitable for food standards because it uses water or lower alcohol as the extraction solvent or precipitation solvent.
  • nobiletin and tangeretin included in the citrus peel extract according to the present invention can effectively inhibit or improve liver damage caused by alcohol, drug or stagnation of bile secretion by organic synergism. have. Therefore, the citrus peel extract according to the present invention can be used as a useful food material.
  • 1 is a graph showing the effect of citrus peel extract on the cell viability of liver damage cells.
  • Figure 2 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on fat accumulation of liver tissue in a model animal experiment in which liver damage was induced by alcohol.
  • Figure 3 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on apoptosis of liver tissue in a model animal experiment in which liver damage was induced by alcohol.
  • Figure 4 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on liver fibrosis in model animal experiments in which chronic liver damage was induced by carbon tetrachloride.
  • Figure 5 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on liver fat accumulation in a model animal experiment in which liver damage was induced by bile duct ligation (BDL).
  • Figure 6 is a photograph showing the effect of citrus peel extract on liver tissue fibrosis in a model animal experiment in which liver damage was induced by bile duct ligation.
  • prevention means any action that inhibits the symptoms or delays the progression of a particular disease by administration of a composition of the present invention.
  • treatment means any action that improves or beneficially alters the symptoms of a particular disease by administration of a composition of the present invention.
  • improvement refers to any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, for example, the extent of symptoms.
  • the term "administration" means providing a subject with a composition of the present invention in any suitable manner.
  • the subject refers to all animals, such as humans, monkeys, dogs, goats, pigs or mice having a disease that can improve the symptoms of a particular disease by administering the composition of the present invention.
  • the term "pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit or risk ratio applicable to medical treatment, which refers to the type of disease, the severity, the activity of the drug, the drug, and the like. Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drug used concurrently, and other factors well known in the medical arts.
  • One aspect of the present invention relates to a method for producing an extract having high specific polymethoxyflavoid content from citrus peels economically and conforming to food standards.
  • the method for preparing a citrus peel extract according to an embodiment of the present invention includes obtaining an extract containing the extract, obtaining a concentrated extract and obtaining an extract in the form of a precipitate.
  • a method for preparing citrus peel extract according to an embodiment of the present invention will be described by dividing each step.
  • an extract containing the extract in the method for producing a citrus peel consists of adding and extracting a lower hydrated alcohol to the citrus peel.
  • the extract is a concept including all of the components extracted from the citrus peel, the extraction solvent and the citrus peel.
  • the citrus fruits are not limited in kind as long as they contain nobiletin and tangeretin in the skin.
  • It is preferable that at least one selected from the group consisting of citrus (Citrus tangerina), Hana (Citrus hanaya), tangerine (Citrus nippokoreana), tangerine (Citrus sunki hort.ex Tanaka) and Hallabong (Citrus hybrid Shiranuhi), (Citrus aurantium) or tangerine (Citrus sunki hort. Ex Tanaka) is more preferable.
  • the alcohol concentration of the water-containing lower alcohol is an extraction yield of polymethoxy flavonoids (PMF), particularly nobiletin and tangeretin contained in citrus peel and economic efficiency in the concentration process described later
  • PMF polymethoxy flavonoids
  • the alcohol concentration of the hydrous lower alcohol is less than 50% by weight, the energy consumption and concentration time increase in the subsequent concentration process, there is a fear that the economic efficiency of the entire process.
  • the extraction yield of polymethoxy flavonoids (PMF) may be significantly decreased.
  • the lower alcohol is an alcohol having 1 to 4 carbon atoms (for example, methanol, ethanol, in consideration of the extraction yield, the distribution of polymethoxy flavonoids (PMF) contained in the citrus peel extract, and food standards) Propanol, butanol), and more preferably ethanol.
  • the amount of the lower alcohol content in the step of obtaining the extract containing the extract is preferably 5 to 20 times, and 8 to 20 times the weight of the citrus peel in consideration of uniform extraction and economic efficiency of the entire process. More preferably 8 to 15 times.
  • the extraction temperature in the step of obtaining the extract containing the extract is preferably 10 ⁇ 30 °C and more preferably 15 ⁇ 25 °C considering the extraction yield and economic efficiency of the entire process.
  • the extraction time in the step of obtaining the extract containing the extract is preferably 2 to 10 days, more preferably 3 to 7 days in consideration of the extraction yield and economic efficiency of the entire process.
  • Obtaining the concentrated extract in the method for producing a citrus peel extract according to an embodiment of the present invention consists of filtering the extract containing the extract and concentrating the filtered extract.
  • Means for filtering the extract containing the extract in the method for producing a citrus peel extract according to an embodiment of the present invention is not particularly limited if the type used in the food field or the extraction field, for example, filter cloth, filter paper, ceramic Filters, membranes and the like.
  • the extract containing the extract is separated into a filter cake and an extract filtered by filtration. Thereafter, the filtered extract is concentrated to a predetermined concentration through atmospheric pressure concentration or reduced pressure concentration.
  • Obtaining an extract in the form of a precipitate in the method of preparing a citrus peel extract according to an embodiment of the present invention comprises adding water or a lower alcohol aqueous solution to the concentrated extract and allowing the extract to settle and separating the precipitated extract. do.
  • the alcohol concentration of the lower alcohol aqueous solution in the step of obtaining the extract in the form of precipitate is 30% by weight or less (for example, 1 to 30% by weight) in consideration of the precipitation rate, precipitation yield, purity of the precipitate, etc., It is preferable that it is 5-25 weight%, and it is more preferable that it is 10-25 weight%.
  • the lower alcohol is an alcohol having a carbon number of 1 to 4 (for example, considering the precipitation rate, the yield of precipitation, the purity of the precipitate, the distribution of polymethoxy flavonoids (PMF) contained in the precipitate, and food specifications) , Methanol, ethanol, propanol, butanol), and more preferably ethanol.
  • the addition amount of water or lower alcohol aqueous solution is preferably 3 to 12 times the weight of the concentrated extract, in consideration of precipitation rate, precipitation yield, purity of the precipitate, 4 times It is more preferable that it is 10 times, and it is most preferable that it is 4 times-8 times.
  • the extract in the form of a precipitate may include nobiletin and tangeretin, and may further include other polymethoxy flavonoids (PMF).
  • PMF polymethoxy flavonoids
  • the content of nobililet (nobiletin) in the extract of the precipitate form is preferably 25 to 30% by weight based on the dry weight of the extract in the precipitate form.
  • the content of tangeretin in the extract in the form of precipitate is preferably 20 to 25% by weight based on the dry weight of the extract in the form of precipitate.
  • the content of polymethoxy flavonoids (PMF) combined with nobiletin and tangeretin in the extract of the precipitate form is preferably 45 to 55 based on the dry weight of the extract in the precipitate form. Weight percent.
  • the extract in the form of precipitate may include other polymethoxy flavonoids (PMF) other than nobiletin and tangeretin, all polymethoxy flavonoids in the extract of the precipitate form (
  • the content of Polymethoxy flavonoids (PMF) may exceed 55% by weight based on the dry weight of the extract in the form of precipitate, for example, may be 55 to 65% by weight.
  • the weight ratio of nobiletin to tangeretin in the extract of the precipitate form may have various ranges depending on the type of citrus fruits, the type of the extraction solvent, the type of the precipitation solvent, the extraction temperature, etc.
  • the ratio is preferably 1: 0.5 to 1: 1, and more preferably 1: 0.7 to 1: 0.9.
  • the precipitate precipitate is separated from the precipitation solvent and impurities by various separation means such as centrifugation.
  • the separated precipitate extract is then converted to a solid extract such as powder form or granule form through a drying process.
  • Another aspect of the present invention relates to a medicinal use or equivalent use thereof (eg, as a dietary supplement) of a citrus peel extract.
  • the present invention prevents liver damage caused by alcohol, drugs, bile secretion abnormalities or bile congestion comprising citrus peel extract as an active ingredient for one use of citrus peel extract.
  • compositions for use in improving or treating are provided.
  • the citrus peel extract in the composition of the present invention comprises nobiletin and tangeretin (tangeretin), preferably is prepared by the method for producing a citrus peel extract.
  • the weight ratio of nobiletin to tangeretin present in the citrus peel extract may improve the organic interaction and synergistic effects of nobililet and anthracnotin on liver damage inhibition or liver function improvement. In consideration, it is preferable that it is 1: 0.5-1: 1, and it is more preferable that it is 1: 0.7-1: 0.9.
  • the content of nobililet (nobiletin) is 25 to 30% by weight based on the dry weight of the citrus peel extract and the content of tangeretin is 20 to 25% by weight.
  • the alcohol causing the liver damage in the composition of the present invention includes alcohol containing ethanol.
  • the type is not limited to a large amount, for example, hyperthyroidism treatment (Prophylthiouracil component), athlete's foot athlete's foot (Ketoconazole Family), anti-tuberculosis (Isoniazid family), antibiotics (Amoxacillin family), and Chinese medicine.
  • the bile secretion abnormality is a concept that includes both bile is secreted excessively, bile is secreted too little or bile flow is disturbed, preferably bile secretion stagnation.
  • the liver damage in the composition of the present invention includes hepatocellular necrosis, fatty liver, liver disorders, hepatitis, liver fibrosis or cirrhosis, for example alcoholic fatty liver, alcoholic chronic infection, toxic liver damage, biliary cirrhosis and the like.
  • composition of the present invention may be embodied as a pharmaceutical composition, a food additive, a food composition (particularly a functional food composition), or a feed additive, etc., depending on the purpose of use and the aspect, and the content of citrus peel extract, etc. which is an active ingredient in the composition.
  • the composition may be adjusted in various ranges according to the specific form of the composition, the purpose of use, and the aspect.
  • the content of the citrus peel extract as an active ingredient in the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, for example, 0.01 to 99% by weight, preferably 0.5 to 50% by weight, more preferably 1 based on the total weight of the composition. It may be 30% by weight.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include an additive such as a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain at least one known active ingredient having the effect of inhibiting liver damage or improving liver function in addition to citrus peel extract.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a formulation for oral administration or a parenteral administration by a conventional method, and when formulated, such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. Diluents or excipients may be used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in active ingredients. ), Lactose (Lactose) or gelatin can be prepared by mixing.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals including humans according to a desired method, and parenteral administration methods include external skin, intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, muscle Intra-injection or intrathoracic injection;
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically effective amount, and the range thereof depends on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, excretion rate and severity of the disease. Varies.
  • Typical daily dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are not particularly limited, for example 1 to 3000 mg / kg, preferably 10 to 2000 mg / kg and more preferably based on active ingredients. 20-1000 mg / kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once or divided into several times daily.
  • the content of the citrus peel extract of the active ingredient in the food composition according to the present invention is 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 25% by weight, more preferably 0.5 to 10% by weight, based on the total weight of the composition, It is not limited to this.
  • the food composition of the present invention includes the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules, or liquids, and examples of specific foods include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, Other noodles, gums, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, tea, functional water, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all of the health food in the usual sense.
  • the food composition of the present invention may contain, as an additional component, a food acceptable carrier, various flavors, or natural carbohydrates.
  • a food acceptable carrier various flavors, or natural carbohydrates.
  • the food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols And carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the food composition of the present invention may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural flavoring agents such as taumartin, stevia extract, synthetic flavoring agents such as saccharin, aspartame, etc. may be used.
  • Analytical sample prepared by dissolving the citrus peel extract in methanol to a concentration of 10 mg / mL.
  • Two-component mobile phase A mixture of distilled water and methanol in a volume ratio of 50:50 was used as the first phase, 100% methanol was used as the second phase, and the volume ratio of the first phase to the second phase was 100: 0. Start with a linear gradient solvent composition that changes to 0: 100 over 50 minutes and then holds for 10 minutes
  • nobiletin and tangeretin standard reagents (Wako, JP) were analyzed for each concentration, and standard calibration curves were prepared based on peak area values. Thereafter, the standard calibration curve was used to calculate the content of nobiletin and tangeretin present in the analytical sample.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 showed a higher nobiletin content and angerettin content than other citrus peel extracts.
  • 100% ethanol was used as the extraction solvent
  • the nobiletin and tangeretin contents of the citrus peel extracts were significantly decreased (see the results of Comparative Preparation Example 3), and hot water was used as the extraction solvent.
  • the nobiletin and tangertin contents of citrus peel extracts were similar to 70% hydrous ethanol as the extraction solvent, but the energy consumption and concentration time increased during the concentration process. It was.
  • HepG2 cells were cultured in Hankuk cell line banks were cultured in DMEM medium containing 10% FBS. After inoculating HepG2 cells in an amount of 1 ⁇ 10 4 in a 96-well plate, and after 24 hours, the samples (nobililet, anthracretin, citrus peel extract of Preparation Example 1, and citrus peel extract of Comparative Preparation Example 1) were 3 ⁇ The solution was treated at a concentration of 30 ⁇ g / ml, and after 6 hours, 2% ethanol and the sample were simultaneously treated. On the other hand, the normal group was not treated with the sample and ethanol, the negative control was treated only with ethanol.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of citrus peel extract on the cell viability of liver damage cells.
  • control of the X axis represents a normal group not treated with the sample and ethanol
  • EtOH represents a negative control treated with ethanol only
  • EtOH + N represents an experimental group treated with nobilete and ethanol.
  • EtOH + T represents an experimental group treated with anthrax and ethanol
  • 70% EtOH represents an experimental group treated with citrus peel extract and ethanol prepared in Comparative Preparation Example 1
  • Precipitate in Preparation Example 1
  • the experimental group treated with the prepared citrus peel extract and ethanol is shown.
  • the value of the Y-axis in FIG. 1 shows the cell survival rate (%).
  • the cell viability is set to 100 as a normal group, and is expressed as a relative value.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 effectively inhibited liver cell death by alcohol compared to the citrus peel extract prepared in Comparative Preparation Example 1 based on the same treatment concentration.
  • the total content of nobiletein and anthrax in the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 is about 50% by weight, hepatic apoptosis is inhibited when the citrus peel extract is treated with the same concentration as pure nobililet or pure anthrax. The effect was expected to fall.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 was treated in the same manner due to the synergistic action of nobililet and anthrax in the citrus peel extract and the influence of other polymethoxy flavonoids (PMF) included in the citrus peel extract.
  • PMF polymethoxy flavonoids
  • hepatic cell death was similar to or superior to that of pure nobiliretin or pure anthrax.
  • mice 6-7 week old male C57BL / 6 mice were allowed to acclimate for 1 week before being used in the experiment. During the acclimation process, the mice were reared in a room environment at 22 ° C, 55% humidity, and a 12-hour light-dark cycle. Feed and drinking water were provided freely. The purified mice were divided into six groups of five animals each. Thereafter, the normal group was orally administered with distilled water in an amount of 5 ml / kg once daily for 3 days, and then was not treated with ethanol.
  • distilled water was orally administered in an amount of 5 ml / kg once daily for 3 days, and 20 g (v / v) aqueous solution of 5 g / kg three times at 12 hour intervals after 3 hours.
  • the experiment was terminated after 6 hours.
  • the ethanol + silymarin (Silymarin) treated group was orally administered silymarin (Silymarin) in an amount of 200 mg / kg once daily for 3 days, and then treated the same as the ethanol treated group.
  • the ethanol + extract (50) treatment group was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 in an amount of 50 mg / kg once a day for 3 days, and then treated the same as the ethanol treatment group.
  • the 'ethanol + extract 100' treatment group was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 in an amount of 100 mg / kg once a day for 3 days, and then treated the same as the ethanol treatment group.
  • the 'ethanol + extract 200' treatment group was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 in an amount of 200 mg / kg once a day for 3 days, and then treated the same as the ethanol treatment group.
  • An autopsy was performed after the experiment. An autopsy was performed after anesthetizing mice using carbon dioxide. Thereafter, blood was collected through posterior vena cava, and liver tissues were fixed with formalin or quenched with liquid nitrogen and stored for later experiments.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST anaspartate aminotransferase
  • TG using a blood analyzer (Model: FuJk Dri-Chem 4000i; manufacturer: Fujifilm, JP)).
  • triglyceride content was measured. Table 2 shows the results of the blood analysis.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 of the present invention is used as an adjuvant therapeutic agent for liver damage such as toxic liver disease, chronic hepatitis, and cirrhosis in a model animal experiment in which liver damage is induced by alcohol. It showed a similar effect of inhibiting liver damage or improving liver function similar to silymarin.
  • FIG. 2 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on fat accumulation of liver tissue in a model animal experiment in which liver damage was induced by alcohol.
  • "A” represents a normal group
  • "B” represents an ethanol alone treatment group
  • "C” represents a “ethanol + silymarin” treatment group
  • “D” represents an "ethanol + extract (50).
  • "Treatment group” E “represents the” ethanol + extract 100 "treatment group”
  • F represents the” ethanol + extract 200 "treatment group.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 of the present invention showed an effect of inhibiting fat accumulation in liver tissue similar to silymarin.
  • FIG. 1 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on apoptosis of liver tissue in a model animal experiment in which liver damage was induced by alcohol.
  • FIG. 1 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on apoptosis of liver tissue in a model animal experiment in which liver damage was induced by alcohol.
  • mice 6-7 week old male ICR mice were used for the experiment after 1 week of acclimation. During the acclimation process, the mice were reared in a room environment at 22 ° C, 55% humidity, and a 12-hour light-dark cycle. Feed and drinking water were provided freely. The purified mice were divided into 5 groups of 6 animals each. Thereafter, 20% carbon tetrachloride (vehicle: olive oil) was intraperitoneally administered at a dose of 1 ml / kg for a total of 4 weeks at a frequency of twice a week to the other groups except the normal group, thereby inducing liver toxicity.
  • 20% carbon tetrachloride vehicle: olive oil
  • the normal group and carbon tetrachloride alone group were orally administered once a day for 4 weeks with distilled water, and the experiment was terminated after 6 hours.
  • the carbon tetrachloride + silymarin treatment group was orally administered with Silymarin in an amount of 200 mg / kg once daily for 4 weeks, and the experiment was terminated after 6 hours.
  • the carbon tetrachloride + extract (50) treatment group was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 once a day for 4 weeks per day, and the experiment was terminated after 6 hours.
  • the treatment group 'carbon tetrachloride + extract 200' was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 once a day for four weeks, and the experiment was terminated after 6 hours.
  • An autopsy was performed after the experiment.
  • An autopsy was performed after anesthetizing mice using carbon dioxide. Thereafter, blood was collected through posterior vena cava, and liver tissues were fixed with formalin or quenched with liquid nitrogen and stored for later experiments.
  • ALT alanine aminotransferase
  • AST aspartate aminotransferase
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 of the present invention inhibited liver damage in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 4 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on liver fibrosis in model animal experiments in which chronic liver damage was induced by carbon tetrachloride.
  • mice 6-7 week old male ICR mice were used for the experiment after 1 week of acclimation. During the acclimation process, the mice were reared in a room environment at 22 ° C, 55% humidity, and a 12-hour light-dark cycle. Feed and drinking water were provided freely. The purified mice were divided into five groups of seven animals each. Subsequently, all groups of individuals were anesthetized with Zoletil. Thereafter, the normal group was sutured only after exploratory laparotomy after midline incision. On the other hand, for the other groups except the normal group, the biliary tract was secured by opening the stomach after opening, and the bile duct was cut after the double ligation.
  • the normal group and bile duct ligation alone were treated with oral distilled water once a day for 4 weeks, and the experiment was terminated after 3 hours.
  • the bile ligature ligation + silymarin (Silymarin) treated group was administered orally in an amount of 200 mg / kg once daily for 4 weeks, and the experiment was terminated after 3 hours.
  • the bile ligature ligation + extract (50) treatment group was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 once a day for 4 weeks, and the experiment was terminated after 3 hours.
  • the bile ligature ligation + extract (200) treatment group was orally administered to the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 once a day for 4 weeks, and the experiment was terminated after 3 hours.
  • An autopsy was performed after the experiment. An autopsy was performed after anesthetizing mice using carbon dioxide. Thereafter, blood was collected through posterior vena cava, and liver tissues were fixed with formalin or quenched with liquid nitrogen and stored for later experiments.
  • ALT aminotransferase
  • AST aminotransferase
  • GGT ⁇ - The activity of glutamyl transferase (TCAM) and total cholesterol (TCHO) and total bilirubin (TBIL) were measured. Table 4 shows the results of the blood analysis.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 of the present invention is similar to or better than that of silymarin in liver damage-induced liver damage induced by bile duct ligation (BDL). Or it showed an effect of improving liver function.
  • FIG. 5 is a photograph showing the effect of citrus rind extract on liver fat accumulation in a model animal experiment in which liver damage was induced by bile duct ligation (BDL).
  • BDL bile duct ligation
  • A represents a normal group
  • B represents a bile duct ligation alone treatment group
  • C represents a bile duct ligation + extract 50 treatment group
  • D represents a "biliary duct ligation +” Extract 200 'treatment group.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 of the present invention inhibited fat accumulation of liver tissue in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 6 is a photograph showing the effect of citrus peel extract on liver tissue fibrosis in a model animal experiment in which liver damage was induced by bile duct ligation.
  • A represents a normal group
  • B represents a bile duct ligation alone treatment group
  • C represents a bile duct ligation + extract 50 treatment group
  • D represents a "biliary duct ligation + Extract 200 'treatment group.
  • the citrus peel extract prepared in Preparation Example 1 of the present invention inhibited fibrosis of liver tissue in a concentration-dependent manner.

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Abstract

본 발명의 일 예는 감귤류 과피로부터 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 함량이 높은 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법은 농축 과정에서 에너지의 소모가 최소화되므로 경제적이고 추출 용매 내지 침전 용매로 물 또는 저급 알코올을 사용하기 때문에 식품 규격에 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물에 포함된 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)은 유기적인 상승 작용에 의해 알코올, 약물 또는 담즙 분비 정체에 의해 유발되는 간 손상을 효과적으로 억제하거나 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물은 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.

Description

감귤류 과피 추출물의 제조방법 및 간 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 감귤류 과피 추출물의 제조방법에 관한 것으로서 더 상세하게는 감귤류 과피로부터 폴리메톡시플라보이드 함량이 높은 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 감귤류 과피 추출물의 의약품으로의 용도 또는 기능성 식품(nutraceuticals)으로의 용도에 관한 것이다.
합성 화학물질을 식품이나 의약품으로 이용할 때 인체에 지나친 자극을 주거나 다양한 부작용을 발생하는 등의 문제가 꾸준히 제기되어 왔다. 합성 화학물질의 부작용과 지나친 자극을 줄이기 위해 최근 천연물을 사용한 식품 및 약품 조성물이 다양하게 개발되고 있다. 천연재료는 부작용이 적을 뿐만 아니라 소비자들의 호응이 높아 약품과 화장품의 원료로써 개발가치가 증가하고 있는 추세이다.
감귤류 과일은 우리나라에서 많이 생산되는 과일이며 제주도에는 토종 감귤인 진귤(Citrus sunki hort. ex Tanaka)을 비롯하여 다양한 품종의 감귤류 과일이 재배되고 있다. 감귤류 과일에 대해서 기존에는 비타민 C의 대명사로만 불리어 왔다. 하지만 감귤에는 몸에 이로운 다른 기능성 물질이 다양하게 있으며, 작은 분자량을 갖는 폴리페놀류 성분인 플라보노이드는 이러한 기능성 물질의 한 종류로서 감귤류 과일에는 60여 가지가 존재한다. 대부분의 플라보노이드 물질은 하이드록시기(-OH)를 가지며 이것이 항산화 등의 기능과 관련 있는 것으로 보인다. 반면, 노빌레틴(nobiletin)은 플라보노이드류 중 다수의 메톡시기(CH3O-)를 갖는 플라본 그룹에 속하며, 이는 하이드록시기를 갖는 플라본보다 생물학적 활성이 높은 것으로 알려져 있다. 감귤류에서만 발견되는 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)로는 노빌레틴(nobiletin), 탄저레틴(tangeretin), 시넨시틴(sinensitin) 등이 있으며, 이를 통해 천연재료로서 감귤류의 유용성을 알 수 있다.
Figure PCTKR2016002606-appb-I000001
<노빌레틴 화학 구조식>
Figure PCTKR2016002606-appb-I000002
<탄저레틴 화학 구조식>
Figure PCTKR2016002606-appb-I000003
<시넨시틴 화학 구조식>
한편, 상기 폴리메톡시플라보노이드(PMF)는 감귤류의 과피로부터 추출 또는 분획되는데, 폴리메톡시플라보노이드(PMF)의 함량을 높이기 위해 분획 단계에서 대부분 아세트산, 헥산 등과 같은 유기 용매를 사용하기 때문에 감귤류 과피 추출물을 의약품 또는 식품 소재로 사용하기에는 한계가 있다.
감귤류의 노빌레틴(nobiletin), 탄저레틴(tangeretin) 및 다른 폴리메톡시플라보노이드(PMF)의 생리화학적 활성과 관련하여 항암, 항염증, 면역조절, 신경보호, 기억력손상 회복 효과 작용(Li, R. W., Theriault, A. G., Au, K., Douglas, T. D., Casaschi, A., Kurowska, E. M. and Mukherjee, R., Citrus polymethoxylated flavones improve lipid and glucose homeostasis and modulate adipocytokines in fructose-induced insulin resistant hamsters., Life Sciences 79: 365-373, 2006) 등이 보고된 바 있다.
한편, 폴리메톡시플라보노이드(PMF)의 간 기능 개선 내지 간 손상 억제와 관련하여, 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0020001호(선행기술 1)에는 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 상기 약학적으로 수용할 수 있는 염류 또는 상기 형태에서 임의의 비율로 조제한 물질, 또는 약학적으로 수용할 수 있는 운반체를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0883356호(선행기술 2)에는 시넨세틴, 탄저레틴, 3,5,6,7,8,3'4'-헵타메톡시플라본, 또는 5-하이드록시-6,7,8,3',4'-펜타메톡시플라본을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선제 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 선행기술 1 및 선행기술 2에서는 폴리메톡시플라보노이드(PMF)의 효과로 비만 또는 지질대사 이상에 의해 유발되는 지방간에 대해서만 언급하고 있을 뿐 다른 인자에 의해 유발되는 간 손상에 대해서는 언급하고 있지 않다. 또한, 선행기술 3(Satomi Onoue, et al., 2013. Physicochemical and biopharmaceutical characterization of amorphous solid dispersion of nobiletin, a citrus polymethoxylated flavone, with improved hepatoprotective effects. European journal of pharmaceutical sciences. 49, 453-460.)에는 노빌레틴의 간 손상 억제 효과가 개시되어 있다. 그러나, 선행기술 3에는 노빌레틴과 다른 폴리메톡시플라보노이드(PMF)의 병용에 의한 간 손상 억제 효과의 상승에 대해서는 언급하고 있지 않다. 종합적으로 선행기술들에는 서로 다른 폴리메톡시플라보노이드(PMF)의 병용, 특히 노빌레틴과 탄저레틴의 병용이 비만 또는 지질대사 이상 이외의 요인에 의해 유발되는 간 손상에 어떠한 수준으로 작용하는지에 대해 전혀 제시되어 있지 않다.
본 발명은 이러한 종래 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 감귤류 과피로부터 특정 폴리메톡시플라보이드 함량이 높은 추출물을 경제적이고 식품 규격에 적합하게 제조하는 방법을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 특정 폴리메톡시플라보노이드를 함유하는 감귤류 과피 추출물의 의약적 용도 또는 이에 준하는 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 감귤류 과피에 알코올 농도가 50~80 중량%인 함수 저급 알코올을 첨가하고 추출하여 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계; 상기 추출액을 여과하고, 여과된 추출액을 농축하여 농축된 추출액을 수득하는 단계; 및 상기 농축된 추출액에 물 또는 알코올 농도가 30 중량% 이하인 저급 알코올 수용액을 첨가하고 정치하여 추출물을 침전시키고, 이를 분리하여 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 상기 저급 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 알코올이다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 상기 침전물 형태의 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함한다.
본 발명의 다른 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 감귤류 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 약학 조성물에서 상기 감귤류 과피 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 약학 조성물은 알코올, 약물, 담즙 분비 이상 또는 담즙 울혈에 의해 유발되는 간 손상을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 감귤류 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 식품 조성물에서 상기 감귤류 과피 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 식품 조성물은 알코올, 약물, 담즙 분비 이상 또는 담즙 울혈에 의해 유발되는 간 손상을 예방 또는 개선하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법을 사용하는 경우 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 함량이 높은 추출물을 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법은 농축 과정에서 에너지의 소모가 최소화되므로 경제적이고 추출 용매 내지 침전 용매로 물 또는 저급 알코올을 사용하기 때문에 식품 규격에 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물에 포함된 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)은 유기적인 상승 작용에 의해 알코올, 약물 또는 담즙 분비 정체에 의해 유발되는 간 손상을 효과적으로 억제하거나 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 감귤류 과피 추출물은 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 감귤류 과피 추출물이 간 손상 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 알코올에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 3은 알코올에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 세포 사멸에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 4는 사염화탄소에 의해 만성 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 섬유화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 5는 담관결찰(bile duct ligation, BDL)에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 6은 담관결찰에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 섬유화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 감귤류 과피로부터 특정 폴리메톡시플라보이드 함량이 높은 추출물을 경제적이고 식품 규격에 적합하게 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법은 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계, 농축된 추출액을 수득하는 단계 및 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계를 포함한다. 이하, 본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명한다.
추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계
본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계는 감귤류 과피에 함수 저급 알코올을 첨가하고 추출하는 것으로 구성된다. 상기 추출액은 감귤류 과피로부터 추출된 성분, 추출 용매 및 감귤류 과피 잔사를 모두 포함하는 개념이다.
상기 감귤류는 과피에 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)이 포함된 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 감귤류는 과피에 포함된 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 양을 고려할 때 광귤(Citrus aurantium), 시쿠와사(Citrus depressa), 홍귤(Citrus tachibana), 빈귤(Citrus leiocarpa), 기리귤(Citrus tardiva), 지미강(Citrus succosa), 기주밀감(Citrus kinokuni), 동정귤(Citrus erythrosa), 치츄우카이만다린(Citrus deliciosa), 킹(Citrus nobilis), 병감(Citrus reticulata), 편귤(Citrus tangerina), 하나유모(Citrus hanaya), 청귤(Citrus nippokoreana), 진귤(Citrus sunki hort. ex Tanaka) 및 한라봉(Citrus hybrid Shiranuhi)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하고, 광귤(Citrus aurantium) 또는 진귤(Citrus sunki hort. ex Tanaka)인 것이 더 바람직하다.
또한, 상기 함수 저급 알코올의 알코올 농도는 감귤류 과피에 포함된 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF), 특히 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 추출 수율 및 후술하는 농축 과정에서의 경제성을 고려할 때 50~80 중량%인 것이 바람직하고, 60~80 중량%인 것이 더 바람직하고, 65~75 중량%인 것이 가장 바람직하다. 함수 저급 알코올의 알코올 농도가 50 중량% 미만인 경우 이후의 농축 과정에서 에너지 소모 및 농축 시간이 증가하여 전체 공정의 경제성이 떨어질 염려가 있다. 또한, 함수 저급 알코올의 알코올 농도가 80 중량%를 초과하는 경우 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)의 추출 수율이 현저하게 떨어질 염려가 있다.
또한, 상기 저급 알코올은 추출 수율, 감귤류 과피 추출물에 포함된 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)의 분포 및 식품 규격 등을 고려할 때 탄소 수가 1 내지 4인 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)인 것이 바람직하고, 에탄올인 것이 더 바람직하다.
또한, 상기 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계에서 함수 저급 알코올의 첨가량은 균일한 추출 및 전체 공정의 경제성을 고려할 때 감귤류 과피의 중량 대비 5배 내지 20배인 것이 바람직하고, 8배 내지 20배인 것이 더 바람직하고 8배 내지 15배인 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계에서 추출 온도는 추출 수율 및 전체 공정의 경제성을 고려할 때 바람직하게는 10~30℃이고 더 바람직하게는 15~25℃이다.
또한, 상기 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계에서 추출 시간은 추출 수율 및 전체 공정의 경제성을 고려할 때 바람직하게는 2~10일이고, 더 바람직하게는 3~7일이다.
농축된 추출액을 수득하는 단계
본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 농축된 추출액을 수득하는 단계는 추출물이 함유된 추출액을 여과하고, 여과된 추출액을 농축하는 것으로 구성된다.
본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 추출물이 함유된 추출액을 여과하기 위단 수단은 식품 분야 내지 추출 분야에서 사용되는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 여과포, 여과지, 세라믹 필터, 멤브레인 등이 있다. 추출물이 함유된 추출액은 여과에 의해 여과된 추출액과 여과 케이크로 분리된다. 이후 여과된 추출액은 상압 농축 또는 감압 농축 등을 통해 소정의 농도로 농축된다.
침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계
본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계는 농축된 추출액에 물 또는 저급 알코올 수용액을 첨가하고 정치하여 추출물을 침전시키고, 침전된 추출물을 분리하는 것으로 구성된다.
상기 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계에서 저급 알코올 수용액의 알코올 농도는 농축된 추출액의 침전 속도, 침전 수율, 침전물의 순도 등을 고려할 때 30 중량% 이하(예를 들어 1~30 중량%)이고, 5~25 중량%인 것이 바람직하고, 10~25 중량%인 것이 더 바람직하다.
또한, 상기 저급 알코올은 침전 속도, 침전 수율, 침전물의 순도, 침전물에 포함된 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)의 분포 및 식품 규격 등을 고려할 때 탄소 수가 1 내지 4인 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)인 것이 바람직하고, 에탄올인 것이 더 바람직하다.
또한, 상기 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계에서 물 또는 저급 알코올 수용액의 첨가량은 침전 속도, 침전 수율, 침전물의 순도 등을 고려할 때 농축된 추출액의 중량 대비 3배 내지 12배인 것이 바람직하고, 4배 내지 10배인 것이 더 바람직하고, 4배 내지 8배인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 침전물 형태의 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함하고, 다른 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 침전물 형태의 추출물 내에서 노빌레틴(nobiletin)의 함량은 침전물 형태의 추출물 건조 중량을 기준으로 바람직하게는 25~30 중량%이다. 또한, 상기 침전물 형태의 추출물 내에서 탄저레틴(tangeretin)의 함량은 침전물 형태의 추출물 건조 중량을 기준으로 바람직하게는 20~25 중량%이다. 또한, 상기 침전물 형태의 추출물 내에서 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 합한 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)의 함량은 침전물 형태의 추출물 건조 중량을 기준으로 바람직하게는 45~55 중량%이다. 다만, 상기 침전물 형태의 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin) 외의 다른 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)를 포함할 수 있으므로, 상기 침전물 형태의 추출물 내에서 모든 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)의 함량은 침전물 형태의 추출물 건조 중량을 기준으로 55 중량%를 초과할 수 있고, 예를 들어 55~65 중량%일 수 있다. 또한, 침전물 형태의 추출물 내에서 노빌레틴(nobiletin) 대 탄저레틴(tangeretin)의 중량비는 추출 원료로 사용한 감귤류의 종류, 추출 용매의 종류, 침전 용매의 종류, 추출 온도 등에 따라 다양한 범위를 가질 수 있으며, 간 손상 억제 내지 간 기능 개선에 대한 노빌레틴과 탄저레틴의 유기적 상호작용 및 상승 효과를 고려할 때 1:0.5 내지 1:1인 것이 바람직하고, 1:0.7 내지 1:0.9인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 감귤류 과피 추출물의 제조방법에서 침전된 추출물은 원심분리 등과 같은 다양한 분리 수단에 의해 침전 용매 및 불순물과 분리된다. 이후, 분리된 침전물 형태의 추출물은 건조 과정을 거쳐 분말 형태 또는 과립 형태와 같은 고상의 추출물로 전환된다.
본 발명의 다른 측면은 감귤류 과피 추출물의 의약적 용도 또는 이에 준하는 용도(예를 들어, 건강기능식품으로의 용도)에 관한 것이다. 본 발명은 감귤류 과피 추출물의 일 용도로 감귤류 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올, 약물, 담즙 분비 이상 또는 담즙 울혈에 의해 유발되는 간 손상을 예방. 개선 또는 치료하기 위한 용도의 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에서 상기 감귤류 과피 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함하고, 바람직하게는 전술한 감귤류 과피 추출물의 제조방법에 의해 제조된다. 또한, 본 발명의 조성물에서 상기 감귤류 과피 추출물에 존재하는 노빌레틴(nobiletin) 대 탄저레틴(tangeretin)의 중량비는 간 손상 억제 내지 간 기능 개선에 대한 노빌레틴과 탄저레틴의 유기적 상호작용 및 상승 효과를 고려할 때 1:0.5 내지 1:1인 것이 바람직하고, 1:0.7 내지 1:0.9인 것이 더 바람직하다. 또한, 본 발명의 조성물에서 감귤류 과피 추출물 건조 중량을 기준으로 노빌레틴(nobiletin)의 함량은 25~30 중량%이고 탄저레틴(tangeretin)의 함량은 20~25 중량%인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물에서 상기 간 손상을 유발하는 알코올은 에탄올이 함유된 주류를 포함한다. 또한, 상기 약물은 간에서 해독하기 어려운 성분을 포함하거나 간 세포의 사멸을 유도하는 성분을 포함하는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 갑상선기능항진증 치료제(Prophylthiouracil 성분), 무좀약(Ketoconazole 계열), 항결핵제(Isoniazid 계열), 항생제(Amoxacillin 계열), 한약 등을 들 수 있다. 또한, 상기 담즙 분비 이상은 담즙이 과다하게 분비되거나 담즙이 너무 적게 분비되거나 담즙의 흐름이 방해되는 것을 모두 포함하는 개념이며, 바람직하게는 담즙 분비 정체이다. 또한, 본 발명의 조성물에서 상기 간 손상은 간세포 괴사, 지방간, 간 장애, 간염, 간 섬유화 또는 간경변증을 포함하며, 예를 들어 알코올성 지방간, 알코올성 만성 감염, 독성 간 손상, 담즙성 간경변증 등이 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 기능성 식품 조성물), 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서 유효성분인 감귤류 과피 추출물 등의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 감귤류 과피 추출물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 감귤류 과피 추출물 외에 간 손상을 억제하거나 간 기능을 개선하는 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 유효성분을 기준으로 할 때 1 내지 3000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 10 내지 2000 ㎎/㎏이고 더 바람직하게는 20~1000 ㎎/㎏이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 식품 조성물에서 유효성분인 감귤류 과피 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 식품학적으로 허용 가능한 담체, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 감귤류 과피 추출물의 제조
제조예 1.
광귤(Citrus aurantium) 과피 분말 20g에 함수 에탄올(에탄올 농도 : 70 중량%) 200㎖를 첨가하고 실온(약 20±5℃)에서 3일 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 여과하여 불용성 성분인 잔사를 제거하였다. 이후, 여과된 추출액을 실온(약 20±5℃) 및 감압 조건하에서 농축하였다. 이후, 농축된 추출액에 물을 농축된 추출액의 약 5배에 해당하는 중량으로 첨가하고 약 24시간 동안 정치하여 추출물을 침전시켰다. 이후, 3000rpm에서 약 3분간 원심분리하여 침전물 형태의 추출물을 수득하였다. 이후, 침전물 형태의 추출물을 건조하여 고상의 감귤류 과피 추출물을 수득하였다.
비교제조예 1.
광귤(Citrus aurantium) 과피 분말 20g에 함수 에탄올(에탄올 농도 : 70 중량%) 200㎖를 첨가하고 실온(약 20±5℃)에서 3일 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 여과하여 불용성 성분인 잔사를 제거하였다. 이후, 여과된 추출액을 실온(약 20±5℃) 및 감압 조건하에서 농축하였다. 이후, 농축된 추출액을 동결건조하여 고상의 감귤류 과피 추출물을 수득하였다.
비교제조예 2.
광귤(Citrus aurantium) 과피 분말 20g에 함수 에탄올(에탄올 농도 : 50 중량%) 200㎖를 첨가하고 실온(약 20±5℃)에서 3일 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 여과하여 불용성 성분인 잔사를 제거하였다. 이후, 여과된 추출액을 실온(약 20±5℃) 및 감압 조건하에서 농축하였다. 이후, 농축된 추출액을 동결건조하여 고상의 감귤류 과피 추출물을 수득하였다.
비교제조예 3.
광귤(Citrus aurantium) 과피 분말 20g에 100% 에탄올 200㎖를 첨가하고 실온(약 20±5℃)에서 3일 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 여과하여 불용성 성분인 잔사를 제거하였다. 이후, 여과된 추출액을 실온(약 20±5℃) 및 감압 조건하에서 농축하였다. 이후, 농축된 추출액을 동결건조하여 고상의 감귤류 과피 추출물을 수득하였다.
비교제조예 4.
광귤(Citrus aurantium) 과피 분말 20g에 물 200㎖를 첨가하고 약 60℃의 수욕 상에서 3일 동안 추출하였다. 이후, 추출액을 여과하여 불용성 성분인 잔사를 제거하였다. 이후, 여과된 추출액을 실온(약 20±5℃) 및 감압 조건하에서 농축하였다. 이후, 농축된 추출액을 동결건조하여 고상의 감귤류 과피 추출물을 수득하였다.
2. 감귤류 과피 추출물에 함유된 폴리메톡시플라보노이드( Polymethoxy flavonoids, PMF )의 함량 분석
제조예 1 및 비교제조예 1 내지 비교제조예 4에서 제조한 고상의 감귤류 과피 추출물에 함유된 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 함량을 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였다. 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 조건은 다음과 같다.
* 분석 시료 : 감귤류 과피 추출물을 10㎎/㎖의 농도가 되게 메탄올에 용해하여 준비함
* 2성분계 이동상 : 제1상으로 증류수와 메탄올을 50:50의 부피비로 혼합한 용액을 사용하였고, 제2상으로 100% 메탄올을 사용하였고, 제1상 대 제2상의 부피비를 100:0으로 시작하여 50분에 걸쳐 0:100으로 변화시킨 후 10분간 유지하는 선형 구배 용매 조성법을 사용함
* 검출기 : 215㎚ 파장으로 고정된 UV detector
이후, 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin) 표준시약(Wako, JP)을 농도별로 분석하고 피크 면적 값을 기준으로 표준 검량선을 작성하였다. 이후, 표준 검량선을 이용하여 분석 시료에 존재하는 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 함량을 계산하였다.
하기 표 1에 감귤류 과피 추출물에 함유된 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)의 함량을 감귤류 과피 추출물 건조 중량을 기준으로 나타내었다.
감귤류 과피 추출물 구분 PMF 함량(%, 감귤류 과피 추출물 건조 중량 기준)
노빌레틴 탄저레틴 노빌레틴+탄저레틴
제조예 1 27.5 22 49.5
비교제조예 1 10.3 7.8 18.1
비교제조예 2 12.9 9.7 22.6
비교제조예 3 1.1 0.7 1.8
비교제조예 4 10.7 7.5 18.2
상기 표 1에서 보이는 바와 같이 제조예 1에서 제조된 감귤류 과피 추출물은 다른 감귤류 과피 추출물에 비해 높은 노빌레틴(nobiletin) 함량 및 탄저레틴(tangeretin) 함량을 보였다. 한편, 100% 에탄올을 추출 용매로 사용하는 경우 감귤류 과피 추출물의 노빌레틴(nobiletin) 함량 및 탄저레틴(tangeretin) 함량이 현저하게 떨어졌고(비교제조예 3의 결과 참조), 열수를 추출 용매로 사용하는 경우 감귤류 과피 추출물의 노빌레틴(nobiletin) 함량 및 탄저레틴(tangeretin) 함량은 70% 함수 에탄올을 추출 용매로 사용하는 경우와 유사하였으나, 농축 과정 시 에너지 소모가 크고 농축 시간도 증가하는 문제점이 발생하였다.
3. 간 손상 세포 실험을 통한 감귤류 과피 추출물의 효능 평가
(1) 실험방법
한구 세포주은행에서 분양받은 HepG2 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 이후, 96-well plate에 HepG2 세포를 1x104의 양으로 접종하고 24시간이 지난 후 시료(노빌레틴, 탄저레틴, 제조예 1의 감귤류 과피 추출물, 비교제조예 1의 감귤류 과피 추출물)를 3~30 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 6시간이 지난 후 2% 에탄올과 시료를 동시에 처리하였다. 한편, 정상군에는 시료 및 에탄올을 처리하지 않았고, 음성 대조군에는 에탄올만 처리하였다. 에탄올과 시료를 동시에 처리하고 24시간이 지난 후 각 웰에 MTT 시약을 20㎖ 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰에서 배지를 제거하고 세포에 DMSO 용액을 150㎖ 첨가하여 세포를 용해시켰다. 이후, ELISA reader를 이용하여 570㎚에서의 흡광도를 측정하고, 세포 생존율을 계산하였다.
(2) 실험결과
도 1은 감귤류 과피 추출물이 간 손상 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 도 1에서 X축의 "control"은 시료 및 에탄올을 처리하지 않은 정상군을 나타내고, "EtOH"는 에탄올만을 처리한 음성 대조군을 나타내고, "EtOH+N"은 노빌레틴과 에탄올을 처리한 실험군을 나타내고, "EtOH+T"는 탄저레틴과 에탄올을 처리한 실험군을 나타내고, "70% EtOH"는 비교제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물과 에탄올을 처리한 실험군을 나타내고 "침전물"은 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물과 에탄올을 처리한 실험군을 나타낸다. 또한, 도 1에서 Y 축의 값은 세포 생존율(%)를 나타낸다. 또한, 도 1에서 세포 생존율은 정상군을 100으로 하고, 이에 대한 상대적인 값으로 나타내었다. 도 1에서 보이는 바와 같이 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 동일 처리 농도를 기준으로 하였을 때 비교제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물에 비해 알코올에 의한 간 세포 사멸을 효과적으로 억제하였다. 한편, 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물에 포함된 노빌레틴과 탄저레틴의 총 함량은 약 50 중량%이므로 감귤류 과피 추출물을 순수한 노빌레틴 또는 순수한 탄저레틴과 동일 농도로 처리하였을 때 간 세포 사멸 억제 효과는 떨어질 것으로 예상되었다. 그러나, 감귤류 과피 추출물에 포함된 노빌레틴과 탄저레틴의 상승 작용 내지 감귤류 과피 추출물에 포함된 다른 폴리메톡시플라보노이드(Polymethoxy flavonoids, PMF)의 영향으로 인해 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 동일 처리 농도를 기준으로 하였을 때 순수한 노빌레틴 또는 순수한 탄저레틴과 유사하거나 우수한 간 세포 사멸 억제 효과를 보였다.
3. 알코올에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험을 통한 감귤류 과피 추출물의 효능 평가
(1) 실험방법
6-7 주령 수컷 C57BL/6 생쥐를 1주간 순화한 후 실험에 사용하였다. 순화과정 동안 생쥐는 22℃의 온도, 55%의 습도, 명암 주기(light-dark cycle) 12시간 단위의 사육실 환경하에서 사육되었고, 사료와 식수는 자유롭게 제공되었다. 순화과정을 거친 생쥐를 5마리씩 6개의 군으로 나누었다. 이후, 정상군에는 증류수를 3일간 1일 1회 5㎖/㎏의 양으로 경구 투여하고, 이후 에탄올 처리를 하지 않았다. 또한, 에탄올 단독 처리군에는 증류수를 3일간 1일 1회 5㎖/㎏의 양으로 경구 투여하고, 3시간 후 20%(v/v) 에탄올 수용액을 12시간 간격으로 3회 5g/㎏의 양으로 경구 투여하고, 6시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '에탄올+실리마린(Silymarin)' 처리군에는 실리마린(Silymarin)을 3일간 1일 1회 200㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 이후 에탄올 처리군과 동일한 처리를 하였다. 또한, '에탄올+추출물(50)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 3일간 1일 1회 50㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 이후 에탄올 처리군과 동일한 처리를 하였다. 또한, '에탄올+추출물(100)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 3일간 1일 1회 100㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 이후 에탄올 처리군과 동일한 처리를 하였다. 또한, '에탄올+추출물(200)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 3일간 1일 1회 200㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 이후 에탄올 처리군과 동일한 처리를 하였다. 실험 종료 후 부검을 하였다. 부검은 이산화탄소를 이용하여 생쥐를 마취한 후 진행되었다. 이후, 후대정맥을 통해 혈액을 채취하였고, 간 조직은 검사방법에 맞게 포르말린으로 고정하거나 액체 질소로 급냉하여 추후 실험을 위해 보관하였다.
(2) 실험결과
1) 혈액 분석 결과
채취한 혈액을 원심분리하여 분석 시료를 준비하고, 혈액 분석 장치(모델명 : FuJk Dri-Chem 4000i; 제조사 : Fujifilm, JP)를 이용하여 ALT(alanine aminotransferase) 및 AST(aspartate aminotransferase)의 활성과 TG(triglyceride)의 함량을 측정하였다. 하기 표 2는 혈액 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험군 구분 ALT(U/L) AST(U/L) TG(㎎/dL)
정상군 13.6 62.2 95.2
에탄올 단독 처리군 101.6 208.8 184.6
'에탄올+실리마린(Silymarin)' 처리군 22.2 103.6 136.8
'에탄올+추출물(50)' 처리군 77.4 121.8 184.4
'에탄올+추출물(100)' 처리군 48.8 79.0 174.4
'에탄올+추출물(200)' 처리군 21.2 71.2 148.0
상기 표 2에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 알코올에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 독성 간질환, 만성 간염, 간경변과 같은 간 손상의 보조 치료제로 사용되는 실리마린과 유사한 간 손상 억제 효과 또는 간 기능 개선 효과를 나타내었다.
2) 간 조직의 지방 축적 수준 분석
간 조직을 10% 인산 완충 포르말린 용액으로 고정하고, 약 5㎛ 두께로 절편하여 시편을 제작하였다. 이후, 시편을 오일 레드 오(oil red O) 용액으로 염색하고 간 조직의 지방 축적 수준을 분석하였다. 도 2는 알코올에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. 도 2에서 "A"는 정상군을 나타내고, "B"는 에탄올 단독 처리군을 나타내고, "C"는 '에탄올+실리마린(Silymarin)' 처리군을 나타내고, "D"는 '에탄올+추출물(50)' 처리군을 나타내고, "E"는 '에탄올+추출물(100)' 처리군을 나타내고, "F"는 '에탄올+추출물(200)' 처리군을 나타낸다. 도 2에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 실리마린과 유사한 간 조직의 지방 축적 억제 효과를 나타내었다.
3) 간 조직의 세포 사멸 수준 분석
간 조직을 10% 인산 완충 포르말린 용액으로 고정하고, 약 5㎛ 두께로 절편하여 시편을 제작하였다. 이후, 세포 사멸 검출 키트(모델명 : ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit; 제조사 : Milipore, USA)를 이용하여 TUNEL assay로 간 조직의 세포 사멸 정도를 측정하였다. 도 3은 알코올에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 세포 사멸에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. 도 3에서 X축의 "Normal"은 정상군을 나타내고, "0"은 에탄올 단독 처리군을 나타내고, "50"은 '에탄올+추출물(50)' 처리군을 나타내고, "100"은 '에탄올+추출물(100)' 처리군을 나타내고, "200"은 '에탄올+추출물(200)' 처리군을 나타낸다. 도 3에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 농도 의존적으로 간 조직의 세포 사멸을 억제하였다.
4. 사염화탄소( CCl4 )에 의해 만성 간 손상이 유도된 모델동물 실험을 통한 감귤류 과피 추출물의 효능 평가
(1) 실험방법
6-7 주령 수컷 ICR 생쥐를 1주간 순화한 후 실험에 사용하였다. 순화과정 동안 생쥐는 22℃의 온도, 55%의 습도, 명암 주기(light-dark cycle) 12시간 단위의 사육실 환경하에서 사육되었고, 사료와 식수는 자유롭게 제공되었다. 순화과정을 거친 생쥐를 6마리씩 5개의 군으로 나누었다. 이후, 정상군을 제외한 나머지 군에 20% 사염화탄소(vehicle : olive oil)를 1주당 2회의 횟수로 총 4주간 1㎖/㎏의 용량으로 복강 내 투여하여 간 독성을 유발하였다. 이후, 정상군 및 사염화탄소 단독 처리군에는 증류수를 4주간 1일 1회 경구 투여하고, 6시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '사염화탄소+실리마린(Silymarin)' 처리군에는 실리마린(Silymarin)을 4주간 1일 1회 200㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 6시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '사염화탄소+추출물(50)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 4주간 1일 1회 50㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 6시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '사염화탄소+추출물(200)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 4주간 1일 1회 200㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 6시간 후에 실험을 종료하였다. 실험 종료 후 부검을 하였다. 부검은 이산화탄소를 이용하여 생쥐를 마취한 후 진행되었다. 이후, 후대정맥을 통해 혈액을 채취하였고, 간 조직은 검사방법에 맞게 포르말린으로 고정하거나 액체 질소로 급냉하여 추후 실험을 위해 보관하였다.
(2) 실험결과
1) 혈액 분석 결과
채취한 혈액을 원심분리하여 분석 시료를 준비하고, 혈액 분석 장치(모델명 : FuJk Dri-Chem 4000i; 제조사 : Fujifilm, JP)를 이용하여 ALT(alanine aminotransferase) 및 AST(aspartate aminotransferase)의 활성을 측정하였다. 하기 표 3은 혈액 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험군 구분 ALT(U/L) AST(U/L)
정상군 23 85
사염화탄소 단독 처리군 234 211
'사염화탄소+실리마린(Silymarin)' 처리군 24 97
'사염화탄소+추출물(50)' 처리군 87 184
'사염화탄소+추출물(200)' 처리군 65 144
상기 표 3에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 농도 의존적으로 간 손상을 억제하였다.
2) 간 조직의 섬유화 수준 분석
간 조직을 10% 인산 완충 포르말린 용액으로 고정하고, 약 5㎛ 두께로 절편하여 시편을 제작하였다. 이후, 시편을 Haematoxylin and eosin(H&E) 용액으로 염색하고 간 조직의 섬유화 수준을 분석하였다. 도 4는 사염화탄소에 의해 만성 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 섬유화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. 도 4에서 "A"는 정상군을 나타내고, "B"는 사염화탄소 단독 처리군을 나타내고, "C"는 '사염화탄소+실리마린(Silymarin)' 처리군을 나타내고, "D"는 '사염화탄소+추출물(50)' 처리군을 나타내고, "E"는 '사염화탄소+추출물(200)' 처리군을 나타낸다. 도 4에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 농도 의존적으로 간 조직의 섬유화를 억제하였다.
5. 담관결찰(bile duct ligation, BDL )에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험을 통한 감귤류 과피 추출물의 효능 평가
(1) 실험방법
6-7 주령 수컷 ICR 생쥐를 1주간 순화한 후 실험에 사용하였다. 순화과정 동안 생쥐는 22℃의 온도, 55%의 습도, 명암 주기(light-dark cycle) 12시간 단위의 사육실 환경하에서 사육되었고, 사료와 식수는 자유롭게 제공되었다. 순화과정을 거친 생쥐를 7마리씩 5개의 군으로 나누었다. 이후, 모든 군의 개체를 졸레틸(Zoletil)로 마취하였다. 이후, 정상군의 개체에 대해서는 정중선 절개 후 탐색적 개복술만을 실시한 뒤 봉합하였다. 반면, 정상군을 제외한 나머지 군의 개체에 대해서는 개복 후 위를 견인하여 총담관을 확보하고 이중 결찰 후 총담관을 절단하였다. 수술에서 회복된 후, 정상군 및 담관결찰 단독 처리군에는 증류수를 4주간 1일 1회 경구 투여하고, 3시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '담관결찰+실리마린(Silymarin)' 처리군에는 실리마린(Silymarin)을 4주간 1일 1회 200㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 3시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '담관결찰+추출물(50)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 4주간 1일 1회 50㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 3시간 후에 실험을 종료하였다. 또한, '담관결찰+추출물(200)' 처리군에는 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물을 4주간 1일 1회 200㎎/㎏의 양으로 경구 투여하고, 3시간 후에 실험을 종료하였다. 실험 종료 후 부검을 하였다. 부검은 이산화탄소를 이용하여 생쥐를 마취한 후 진행되었다. 이후, 후대정맥을 통해 혈액을 채취하였고, 간 조직은 검사방법에 맞게 포르말린으로 고정하거나 액체 질소로 급냉하여 추후 실험을 위해 보관하였다.
(2) 실험결과
1) 혈액 분석 결과
채취한 혈액을 원심분리하여 분석 시료를 준비하고, 혈액 분석 장치(모델명 : FuJk Dri-Chem 4000i; 제조사 : Fujifilm, JP)를 이용하여 ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate aminotransferase) 및 GGT(γ-glutamyl transferase)의 활성과 TCHO(total cholesterol) 및 TBIL(total bilirubin)의 함량을 측정하였다. 하기 표 4는 혈액 분석 결과를 나타낸 것이다.
실험군 구분 ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) TCHO(㎎/dL) TBIL(㎎/dL)
정상군 23.0 84.8 11.1 139.0 1.14
BDL 단독 처리군 507.7 604.0 31.5 239.7 17.85
'BDL+실리마린' 처리군 375.2 452.2 22.5 134.1 15.5
'BDL+추출물(50)' 처리군 320.2 418.6 32.6 296.0 18.1
'BDL+추출물(200)' 처리군 310.4 391.6 19.4 174.8 14.6
* BDL : 담관결찰
상기 표 4에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 담관결찰(bile duct ligation, BDL)에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 실리마린과 유사하거나 더 우수한 간 손상 억제 효과 또는 간 기능 개선 효과를 나타내었다.
2) 간 조직의 지방 축적 수준 분석
간 조직을 10% 인산 완충 포르말린 용액으로 고정하고, 약 5㎛ 두께로 절편하여 시편을 제작하였다. 이후, 시편을 오일 레드 오(oil red O) 용액으로 염색하고 간 조직의 지방 축적 수준을 분석하였다. 도 5는 담관결찰(bile duct ligation, BDL)에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 지방 축적에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. 도 5에서 "A"는 정상군을 나타내고, "B"는 담관결찰 단독 처리군을 나타내고, "C"는 '담관결찰+추출물(50)' 처리군을 나타내고, "D"는 '담관결찰+추출물(200)' 처리군을 나타낸다. 도 5에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 농도 의존적으로 간 조직의 지방 축적을 억제하였다.
3) 간 조직의 섬유화 수준 분석
간 조직을 10% 인산 완충 포르말린 용액으로 고정하고, 약 5㎛ 두께로 절편하여 시편을 제작하였다. 이후, 시편을 Haematoxylin and eosin(H&E) 용액으로 염색하고 간 조직의 섬유화 수준을 분석하였다. 도 6은 담관결찰에 의해 간 손상이 유도된 모델동물 실험에서 감귤류 과피 추출물이 간 조직의 섬유화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다. 도 6에서 "A"는 정상군을 나타내고, "B"는 담관결찰 단독 처리군을 나타내고, "C"는 '담관결찰+추출물(50)' 처리군을 나타내고, "D"는 '담관결찰+추출물(200)' 처리군을 나타낸다. 도 6에서 보이는 바와 같이 본 발명의 제조예 1에서 제조한 감귤류 과피 추출물은 농도 의존적으로 간 조직의 섬유화를 억제하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 감귤류 과피에 알코올 농도가 50~80 중량%인 함수 저급 알코올을 첨가하고 추출하여 추출물이 함유된 추출액을 수득하는 단계;
    상기 추출액을 여과하고, 여과된 추출액을 농축하여 농축된 추출액을 수득하는 단계; 및
    상기 농축된 추출액에 물 또는 알코올 농도가 30 중량% 이하인 저급 알코올 수용액을 첨가하고 정치하여 추출물을 침전시키고, 이를 분리하여 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 저급 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 알코올이고,
    상기 침전물 형태의 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 감귤류는 광귤(Citrus aurantium), 시쿠와사(Citrus depressa), 홍귤(Citrus tachibana), 빈귤(Citrus leiocarpa), 기리귤(Citrus tardiva), 지미강(Citrus succosa), 기주밀감(Citrus kinokuni), 동정귤(Citrus erythrosa), 치츄우카이만다린(Citrus deliciosa), 킹(Citrus nobilis), 병감(Citrus reticulata), 편귤(Citrus tangerina), 하나유모(Citrus hanaya), 청귤(Citrus nippokoreana), 진귤(Citrus sunki hort. ex Tanaka) 및 한라봉(Citrus hybrid Shiranuhi)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 추출액을 수득하는 단계에서 함수 저급 알코올의 첨가량은 감귤류 과피의 중량 대비 5배 내지 20배인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 추출액을 수득하는 단계에서 추출 온도는 10~30℃이고 추출 시간은 2~10일인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 침전물 형태의 추출물을 수득하는 단계에서 물 또는 저급 알코올 수용액의 첨가량은 농축된 추출액의 중량 대비 3배 내지 12배인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 침전물 형태의 추출물 건조 중량을 기준으로 노빌레틴(nobiletin)의 함량은 25~30 중량%이고 탄저레틴(tangeretin)의 함량은 20~25 중량%인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 침전물 형태의 추출물 건조 중량을 기준으로 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 합한 함량은 45~55 중량%인 것을 특징으로 하는 감귤류 과피 추출물의 제조방법.
  9. 감귤류 과피 추출물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 감귤류 과피 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함하고,
    알코올, 약물, 담즙 분비 이상 또는 담즙 울혈에 의해 유발되는 간 손상을 예방 또는 치료하기 위한 용도의 약학 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 감귤류 과피 추출물에 존재하는 노빌레틴(nobiletin) 대 탄저레틴(tangeretin)의 중량비는 1:0.5 내지 1:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 감귤류 과피 추출물은 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 감귤류 과피 추출물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 감귤류 과피 추출물은 노빌레틴(nobiletin) 및 탄저레틴(tangeretin)을 포함하고,
    알코올, 약물, 담즙 분비 이상 또는 담즙 울혈에 의해 유발되는 간 손상을 예방 또는 개선하기 위한 용도의 식품 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 감귤류 과피 추출물에 존재하는 노빌레틴(nobiletin) 대 탄저레틴(tangeretin)의 중량비는 1:0.5 내지 1:1인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 감귤류 과피 추출물은 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 감귤류 과피 추출물 건조 중량을 기준으로 노빌레틴(nobiletin)의 함량은 25~30 중량%이고 탄저레틴(tangeretin)의 함량은 20~25 중량%인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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