KR20110134742A - 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물은 높은 항산화 활성을 보이고, 염증반응과 관련하여 NO, ROS 생성을 억제하고, iNOX, COX-2 단백질 발현을 억제하는 효과가 있어 염증을 억제 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 iNOX 및 COX-2 단백질 발현을 억제하고, 항산화 효과를 나타내는 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물의 용도에 관한 것이다.
염증이란 특정 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로 조직 변질, 순환장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 유발하는 복잡한 병변을 일컫는다. 중이염 등과 같이 끝자가 염(炎)으로 되어 있는 것 외에, 전염성 질환(결핵 ·매독 ·이질 ·디프테리아 등) 등에서 볼 수 있는 병변의 총칭으로, 많은 질병의 원인으로 알려져 있다.
면역부전증과 같이 면역계에 결함이 생겨 나타나는 불충분한 면역반응은 감염과 암을 유도할 수 있다. 반면 과도한 염증 반응은 류마티스성 관절염, 동맥경화, 당뇨, 알츠하이머 질환과 같은 질환에서 병적상태와 죽음의 원인이 된다(Tracey, 2002).
체내 염증과정에서는 과량의 산화질소 및 PGE2 등의 염증인자가 형성된다 (Posadas et al., 2000; Tsatsanis et al., 2006). NO는 체내에서 염증반응에 관여할 뿐만 아니라 체내 방어기능, 신호전달기능, 혈관확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있으며(Nathan 1997; Palmer et al., 1987) NOSs(nitric oxide synthases)에 의해 L-아르기닌으로부터 형성된다 (Knowles and Moncada, 1994).
감귤류는 생과와 주스로 즐겨먹는 과일 중 하나이며 전통의학에도 사용되었고, 일부 감귤류의 경우 중국과 일본의 전통의학에서 기관지 천식 또는 심장혈류 순환을 개선시키는데 사용되어왔다(Choi et al., 2007; Cha and Cho, 2001). 이러한 감귤의 과피에는 다양한 플라보노이드가 존재하며 현재까지 약 60여종이 알려져 있고, 이들 플라보노이드는 감귤의 수확시기에 따라 함량이 다르다고 보고되었다 (Kim et al., 2009). 감귤류 플라보노이드의 생리활성에 대한 연구로는 항산화 작용 (Choi et al., 2007; Kim et al., 2009), 항염증작용 (Choi et al., 2007), 지질대사 개선 효과 (Monforte et al., 1995; Cha et al., 2001) 등이 보고되고 있다.
현재 제주도에서 대표적인 과실로 재배되고 있는 감귤은 20세기 초 일본으로부터 도입된 온주밀감류가 대부분이며, 재래종 감귤로는12종이 자생하고 있는 것으로 확인되었다. 제주자생 재래귤 중 진귤(Citrus sunki Hort. Tanaka)은 제주지역에서 산물로 불리는 것으로 다른 이름으로는 산귤로 불리기도 한다. 진귤의 과피를 건조시킨 것을 진피라고 부르는데 한의학에서는 필수적인 한약재로 사용하여 왔다. 진귤에 대한 다양한 생리적 효과가 보고되고 있기는 하나 과실의 성숙정도에 따른 접근은 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 제주 재래귤인 진귤의 미성숙한 과피와 성숙한 과피 유래 추출물의 산화 억제 효과와 염증반응 억제효과의 차이를 분자 수준에서 확인하고, 진귤 과피 유래 폴리메톡시플라본의 염증반응 억제 기전을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 진귤 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진귤 과피 추출물로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미성숙 진귤 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미성숙 진귤 과피는 녹색 계열의 색을 띄는 과피일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미성숙 진귤 과피 추출물은 항산화 활성, ROS 생성 억제활성 또는 NO 생성 억제활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미성숙 진귤 과피 추출물은 대식세포에서 iNOX, COX-2, IL-1β, IL-6 또는 TNF-α의 발현을 억제하는 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 폴리메톡시플라본 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리메톡시플라본 화합물은 미성숙 진귤 과피로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리메톡시플라본 화합물은 항산화 활성, ROS 생성 억제활성 또는 NO 생성 억제활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리메톡시플라본 화합물은 대식세포에서 LPS에 의한 염증 신호전달 초기에 ERK, JNK, p38의 인산화를 감소시킴으로써 iNOX 및 COX-2의 발현을 억제하는 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리메톡시 플라본 화합물은 NF-kB 또는 MAP 키나아제 경로를 통해 iNOX 및 COX-2의 발현을 억제하는 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 염증 억제용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본 을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물은 높은 항산화 활성을 보이고, 염증반응과 관련하여 NO, ROS 생성을 억제하고, iNOX, COX-2 단백질 발현을 억제하는 효과가 있어 염증을 억제 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 진귤 과피 추출물의 DPPH 자유유리기 소거활성을 분석한 결과이다. 여기서, △는 미성숙한 진귤 과피 추출물, ■는 성숙한 진귤 과피 추출물을 나타낸다.
도 2 및 도 3은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 미성숙한 진귤 과피 추출물(도 2)과 성숙한 진귤 과피 추출물(도 3)의 세포독성을 측정하기 위한 MTT 및 LDH 분석 결과이다.
도 4는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 진귤 과피 추출물의 일산화질소 생성 억제 활성 분석결과이다.
도 5는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 진귤 과피 추출물의 ROS 생성 억제 활성 분석 결과이다.
도 6은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 진귤 과피 추출물을 처리한 경우 iNOS의 발현 분석결과이다.
도 7은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 진귤 과피 추출물을 처리한 경우 COX-2의 발현 분석결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 진귤 과피 추출물을 처리한 경우 RT-PCR을 이용한 TNF-α(8a), IL-1β(8b) 및 IL-6(8c)의 mRNA 발현 분석결과이다.
도 9는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 PMF의 세포독성을 측정하기 위한 MTT 및 LDH 분석 결과이다.
도 10은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 PMF의 일산화질소 생성 억제 활성 분석결과이다.
도 11은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 PMF를 처리한 경우 iNOS의 발현 분석결과이다.
도 12는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 PMF를 처리한 경우 COX-2의 발현 분석결과이다.
도 13은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서 PMF가 IkB-α 분해에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 14는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서 PMF가 MAP 키나아제 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 2 및 도 3은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 미성숙한 진귤 과피 추출물(도 2)과 성숙한 진귤 과피 추출물(도 3)의 세포독성을 측정하기 위한 MTT 및 LDH 분석 결과이다.
도 4는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 진귤 과피 추출물의 일산화질소 생성 억제 활성 분석결과이다.
도 5는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 진귤 과피 추출물의 ROS 생성 억제 활성 분석 결과이다.
도 6은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 진귤 과피 추출물을 처리한 경우 iNOS의 발현 분석결과이다.
도 7은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 진귤 과피 추출물을 처리한 경우 COX-2의 발현 분석결과이다.
도 8a 내지 도 8c는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 진귤 과피 추출물을 처리한 경우 RT-PCR을 이용한 TNF-α(8a), IL-1β(8b) 및 IL-6(8c)의 mRNA 발현 분석결과이다.
도 9는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 PMF의 세포독성을 측정하기 위한 MTT 및 LDH 분석 결과이다.
도 10은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서의 PMF의 일산화질소 생성 억제 활성 분석결과이다.
도 11은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 PMF를 처리한 경우 iNOS의 발현 분석결과이다.
도 12는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에 PMF를 처리한 경우 COX-2의 발현 분석결과이다.
도 13은 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서 PMF가 IkB-α 분해에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
도 14는 LPS에 의해 자극된 대식세포(RAW264.7)에서 PMF가 MAP 키나아제 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 분석한 결과이다.
본 발명은 진귤 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 “진귤(Citrus sunki Hort. Tanaka)”은 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과에 속하는 귤나무이며, 제주도 내에서 재배되었던 자생 재래종으로서, 흔히 산물 또는 진귤로 불리워지며 분포가 넓고 재배 본수도 많다. 수세는 왕성하고 가지가 밀생하며 가지의 마디가 짧다. 잎은 좁은 타원형으로 작으며, 잎날개가 없다. 잎의 길이는 4.5~7.5㎝, 너비 2~3㎝이며, 잎자루의 길이는 0.5~1㎝이다. 열매는 둥글고 편평하며, 열매 껍질에는 약간의 돌기가 있다. 열매의 지름은 세로 3~4㎝, 가로 3.5~4.5㎝이며, 내과피는 9실 내외로 되어있으며, 씨앗의 수는 20개 내외이고 열매의 무게는 약 25~30g이다. 주로 감기로 인한 기침, 가래 등의 약재로 이용된다.
현재까지 진귤의 과피가 항산화, 항염증 및 세포사멸 유도활성과 (Kang et al., 2005) 알콜대사의 촉진과 지방축적 억제효과가 있는 것으로 보고되었으며(Cui et al., 2007), 진귤에 대한 다양한 생리적 효과가 보고되고 있기는 하나 과실의 성숙정도에 따른 접근은 미흡한 실정이다.
진귤 과피는 제주도의 다양한 재래귤 중에서 항산화 활성과 밀접한 연관이 있는 폴리메톡시플라본(Polymethoxy Flavonoid, 이하, ‘PMF’라고 함)을 비교적 많이 함유하며, 대식세포에서 NO 소거능 역시 다른 감귤 종과 비교해 높은 소거능을 갖는다. 이에 본 발명에서는 진귤의 미성숙 과피 추출물과 성숙한 과피 추출물에 대해 항산화, 항염활성을 비교하고, 나아가 진귤의 과피에 함유되어 있는 PMF가 어떠한 기전으로 염증 억제 활성을 나타내는지를 최초로 규명하였다.
따라서, 본 발명은 미성숙 진귤 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물을 제공한다. 여기서 미성숙한 진귤 과피는 녹색 계열의 색을 띄는 것을 특징으로 하는데, 이와 비교하여 성숙한 진귤 과피는 노란색 또는 주화색 계열의 색을 띄는 차이가 있다. 본 발명에서 상기 “미성숙한 진귤”은 과피의 모든 색이 노랗게 되기 전의 진귤로 정의된다. 성숙한 개체보다 미성숙한 개체에 PMF의 함량이 많아 더 우수한 항염증, 항산화 효과를 나타낸다.
본 발명에서 정의되는 “추출물”은 진귤 과피, 바람직하게는 미성숙 진귤 과피의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.
본 발명에서 정의되는 “조추출물”은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 이소프로판올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물일 수 있다.
본원에서 정의되는 “극성용매 가용 추출물”은 물, 메탄올, 부탄올, 아세톤 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물일 수 있다.
본원에서 정의되는 “비극성용매 가용 추출물”은 아세톤, 에테르, 벤젠, 헥산, 시클로헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물일 수 있다.
본 발명의 진귤 과피의 조추출물을 수득하는 방법을 구체적으로 설명하면, 우선 진귤의 과피를 벗겨 건조시킨 다음 세절하여 마쇄기로 갈아 미세분말화한 후, 과피 시료 중량의 약 1 ~ 30배, 바람직하게는 약 1 ~ 10배에 달하는 부피(w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 아세톤 등과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 증류수를 가하여, 10 내지 100℃, 바람직하게는 40 ~ 90℃에서 1 ~ 48 시간, 바람직하게는 20 내지 30시간 동안 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출법 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 약 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 3회 추출한 후 여과하여 상층액을 모으고 감압 농축하여 본 발명의 진귤 과피 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5 회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 또는 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.
한편, 진귤 과피 추출물로부터 폴리메톡시플라본(PMF)을 분리하는 방법으로는 일반적으로 메탄올, 에탄올, 아세톤, 클로로포름 등과 같은 탄소수 1내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출법을 사용할 수 있다. 그러나 이러한 추출법은 PMF와 유사한 비극성 혹은 극성 성질을 갖는 화합물들이 분리단계를 거칠 때 마다 분리되지 않고 PMF와 계손 잔존하여 존재하므로, 추출, 농축, 분획, 크로마토그래피와 같은 많은 진행 과정들이 요구되므로, PMF를 분리하기 위해 많은 시간과 인력이 소요된다. 따라서, 본 발명에서는 물을 사용하여 PMF를 분리하기 위한 연구를 진행하였으며, 일반적으로 비극성 화합물들이 열수추출법에 의한 추출 효율은 크게 떨어지는 편이지만, PMF인 경우 열수추출물에서도 추출되는 것으로 확인되었다.
그러므로, 본 발명에서는 진귤 과피 추출물로부터 PMF를 분리하기 위해 열수추출법을 사용하는 것이 바람직하며, 열수추출물에 추출된 비극성인 PMF를 분리하기 위해 다양한 용매(n-헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트, n-뷰탄올 등)에 분획한다. 또한, 본 발명에서는 PMF를 다량 함유하는 조성물을 분취용-LC를 이용하여 PMF를 분리할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 미성숙 진귤 과피 추출물은 이하와 같은 활성을 가진다.
첫째, 본 발명의 미성숙 진귤 과피 추출물은 항산화활성을 나타낸다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 미성숙한 진귤 과피 추출물과 성숙한 과피 과치 추출물이 항산화 활성을 갖고 있는지를 확인하기 위하여, DPPH 자유유리기 소거활성을 분석하였다(실시예 1 참조). 그 결과, 미성숙한 진귤 과피 추출물이 성숙한 진귤 과피 추출물에 비해 비교적 높은 자유유리기 소거 활성을 보였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 진귤 과피 추출물이 항산화 활성을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
상기 “DPPH”는 안정한 유리기로 시스테인, 글루타티온과 같은 아미노산과 아스코르브산, 방향족 아민 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 능력 측정이 많이 이용되고 있다.
둘째, 본 발명의 미성숙 진귤 과피 추출물은 염증 억제 효과를 나타내어 뛰어난 항염 활성을 나타낸다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 추출물의 염증 억제 효과를 확인하기 위하여 대식세포 모델을 사용하였다. 이를 위해 MTT 및 LDH 분석을 통해 세포독성이 있는지를 확인하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 진귤 과피 추출물은 세포독성도 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3참조).
본 발명의 미성숙 진귤 과피 추출물은 대식세포에서 일산화질소(NO)와 활성산소종(ROS)의 생성을 현저하게 저해하는 활성을 나타낸다.
상기 “일산화질소(NO)”는 인터루킨(interleukin)과 같은 염증 촉진성 사이토카인, 프로스타글란딘(prostaglandin) 등과 함께 염증 유발 물질로 작용하여, 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래한다. 그러므로 대식세포의 일산화질소 생성을 저해하는 활성은 염증의 억제 또는 치료와 밀접한 관련이 있다고 할 수 있다.
상기 “활성산소종(ROS)”은 대식세포에 LPS 처리함으로 인해 생성되는 세포 상해 매개인자이며, 내독소 혈증에서 세포 손상징후와 깊이 관련되어 있다. LPS로 유도된 활성산소종의 생성을 억제하는 것을 통해 염증반응시 세포 상해를 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 미성숙 진귤 과피 추출물은 염증매개 단백질로 보고된 iNOX와 COX-2 단백질의 발현을 억제하는 활성이 있다.
상기 “iNOX”는 NOS(nitric oxide synthases) 중의 하나로 인터페론-γ, LPS(lipopolysaccharide), 사이토카인과 같은 자극에 노출되는 경우에만 발현된다. iNOX 외에도 NOS는 세포 내에 항상 존재하는 nNOS(neuronal NOS)와 eNOS(endothelial NOS) 형태가 존재한다. 이들 NOS 중에서 염증반응과 밀접한 iNOS는 일반적으로 박테리아를 죽이고 종양을 제거하는 목적으로 NO를 생성하지만 병리적인 원인에 의해 과잉 생성될 경우 염증과 종양을 유발하며(Nathan, 1992; McCartney-Francis et al., 1993), 조직손상, 유전자의 변이 및 신경손상을 일으킨다(Stuehr et al., 1991; Weisz et al., 1996). iNOX는 L-아르기닌으로부터 NO를 생성하며, NO가 과도하게 생성되면 염증을 유발하게 되는데, 본 발명의 진귤 과피 추출물은 iNOS 단백질 발현을 억제하는 활성이 있어, 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS에 의한 일산화질소의 생성을 저해할 수 있다.
“COX”는 COX-1과 COX-2, 두 가지 형태로 존재하며, 이들의 분자량은 모두 70kDa 정도로 60%의 아미노산 유사성을 갖는다(Tsatsanis et al., 2006). COX-1은 거의 모든 세포에서 발현되며 위 점막 보호, 신장혈류량 조절, 혈소판 응집 제어와 같은 생리학적 기능 유지에 관여한다. 반면, COX-2는 생리학적으로 정상상태에서는 아주 드물게 검출되지만 섬유아세포, 내피세포, 단핵구와 같은 일부 세포에서 사이토카인, 호르몬, 성장인자 등에 의해 빠르고 순간적으로 발현된다(Posadas et al., 2000; Surh et al., 2001; Tsatsanis et al., 2006; Eibl G et al., 2003; DeWitt and Smith, 1995). COX-2의 발현은 염증반응에서 매우 중요한데, COX-2가 염증의 주요 매개인자인 PGs의 생성을 조절하며, 류마티스성 관절염과 같은 만성염증과 대장암, 유방암, 폐암 등과 관련되어 있기 때문이다. 염증부위에서는 단핵구와 대식세포가 LPS 또는 인터루킨-1(IL-1)에 의해 자극되었을 때 발현되며 이로 인해 생성된 PGs에 의해 발열과 통증을 동반한 염증 반응이 지속된다(DeWitt and Smith, 1995). 본 발명의 진귤 과피 추출물은 이러한 COX-2 발현을 억제하는 활성이 있으며, 이로 인해 진귤 과치 추출물이 PGs의 생성에도 영향을 줄 것으로 예상된다.
“대식세포”는 거의 모든 조직에 존재하는 면역계 세포로 단핵구와 함께 선천성 면역 반응 뿐만 아니라 후천선 면역반응에도 관여하여 생체방어에 중요한 역할을 한다. 체내로 침입한 미생물의 LPS, lipophosphoglycan, 적혈구 응집소와 같은 다양한 미생물 세포 표면 분자를 인지하여 이들을 섭취하거나 죽임으로써 1차 방어 체계를 유지하고, 이후 신호전달 단백질을 분비하여 또 다른 면역계 세포와 새로운 대식세포를 감염부위로 유도, 활성화시키는 역할을 한다(Parham, 2006; Murphy et al., 2008).
“LPS”는 살모넬라와 같은 그람 음성균 세포외막을 구성하는 성분으로 세균의 감염에 의해 체내에서 분비될 경우, 패혈증의 가장 심각한 결과인 순환계와 호흡계가 붕괴되는 패혈성 쇼크 상태를 야기하는 내독소로 알려져 있다(Parham, 2006). RAW 264.7 세포와 같은 대식세포에서 인터루킨-1β(IL-1β대식세인터루킨-6 (IL-6대식세상태괴사인자-α(TNF-α대식세인터루킨-12 (IL-12대와 같은 전염증성 사이토카인의 합성을 증가시키는 Lee et al., 2004; Mukaida터루킨-12 (IL-12; Murphy et al., 2008), iNOS와 COX-2와 같은 염증 매개 단백질의 발현Muk도한다(Liu and Malik, 2006). 이러한 전염증성 사이토카인L-1염증 매개 단백질의 발현은 핵전사인자 카파B(NFκB대와 MAP(mitogen activated protein) 키나아제의 활성화에 의해 일어나게 된다 (Liu and Malik, 2006; Aga et al., 2004).
또한, 본 발명의 진귤 과피 추출물은 LPS에 의해 자극된 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 유도를 전사단계에서 효과적으로 억제하는 활성이 있다. TNF-α, IL-1β와 IL-6은 전염증성 사이토카인의 일종으로, 이러한 전염증성 사이토카인의 발현을 억제함으로써 신경교종 세포 증식을 저해하고, T세포 증식 유도 등과 관련된 염증 관련 메카니즘에 영향을 미치게 된다.
“TNF-α”는 종양괴사인자(tumor necrosis factor)를 말하는 것으로, 대식세포에 의해 체내에서 생성되는 단백질이다. 인간을 포함해 동물 체내에서 만들어지는 제암효과를 가진 생물학적 응답조절물질(BRM)의 일종으로, 암이나 만성세균감염, 만성기생충감염 환자들에게 심한 체중감소를 일으키거나 경우에 따라서는 내독소와 반응하여 패혈증성 쇼크를 일으키기도 한다.
“인터루킨(IL)”은 몸 안에 들어온 세균이나 해로운 물질을 면역계가 맞서 싸우도록 자극하는 단백질로, 백혈구에서 만들어지며 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6 등이 있다. 이러한 인터루킨들은 백혈구의 일종인 T세포를 활성화시켜 질병에 대항하도록 연쇄적으로 반응한다.
한편, 본 발명은 진귤 과피에서 분리한 폴리메톡시플라본 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
진귤 과피에서 분리한 폴리메톡시플라본 화합물은 대식세포에서 일산화질소(NO)의 생성을 현저하게 저해하는 활성을 나타내고, NO 생성을 조절하는 iNOX와 염증매개인자인 PGs 생성을 조절하는 COX-2 단백질의 발현을 억제하는 활성이 있다.
iNOX와 COX-2 단백질은 세포내에서 염증과 증식반응에 관여하는 다양한 유전자를 조절하는 NFkB에 의해 조절된다고 알려져 있다(Lee et al., 2004; Kang et al., 2006).
“NFκB”는 세포 성장, 분화, 염증반응, 세포부착 등에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 가장 흔한 전사인자 중 하나이다. 세포가 유사분열물질, 염증성 cytokine, 자외선, 바이러스성 단백질, LPS, 활성산소종과 같은 자극에 노출되면 빠르게 인산화되고, 이렇게 활성화된 NFκB는 핵내로 전좌(translocation)되어 세포부착분자, 성장인자, 전염증성 사이토카인 및 iNOS, COX-2와 같은 염증 매개 단백질의 전사를 촉진한다(Liu and Malik, 2006; Surh et al., 2001; Murphy et al., 2008).
따라서 본 발명에서는 iNOS와 COX-2의 발현 조절이 NFκB 신호전달 경로와 연관이 있음을 확인하기 위해 NFκB를 구성하는 IκB-α의 분해를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면, LPS로 자극시킨 대식세포에 PMF를 처리한 경우 IκB-α의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 PMF가 IκB-α의 회복에 영향을 줌으로써 NFκB 경로에 의한 염증 매개 단백질의 생성을 저해하는 것으로 사료된다.
한편, 대식세포인 RAW 264.7 세포는 LPS에 의해 MAP 키나아제가 활성화된다고 알려져 있다(Kang et al., 2006). ERK의 활성화는 NFκB의 소단위체인 p65의 Ser536을 인산화 시키며, COX-2의 발현을 유도하고(Hu et al., 2004), JNK는 인산화된 c-jun에 의해 iNOS와 COX-2의 또 다른 전사인자인 AP-1의 전사활성을 촉진한다고 알려져 있고(Eferl and Wagner, 2003), p38은 COX-2의 mRNA 안정성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Wilnzen et al., 1999).
“MAP 키나아제”는 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase)로 extracellular signal-regulated kinases ERK1/2(ERK), c-Jun NH2-terminal kinases JNK1/2(JNK)와 p38 stress-activated protein kinases(p38)가 포함되어 있다. 이들 키나아제는 자외선, 사이토카인, NO 및 LPS와 같은 특정 자극에 의해 사이토카인과 염증매개 인자의 발현을 조절하는 다양한 전사인자의 핵내 축적과 활성화를 유발한다(Aga et al., 2004; Tsatsanis et al., 2006).
따라서, 본 발명에서는 PMF가 LPS로 활성화되는 MAP 키나아제 경로에 어떠한 영향을 주는지 확인하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 진귤 과피에서 분리한 폴리메톡시플라본을 처리한 후 LPS를 다양한 시간동안 처리한 후 단백질을 회수하여, ERK, JNK와 p38의 인산화가 감소되는 것을 확인하였다(도 14 참조). 이는 PMF가 LPS에 의한 염증 신호전달 초기에 ERK, JNK, p38의 인산화를 감소시킴으로 iNOS와 COX-2의 발현을 저해하는 것이라 사료된다.
따라서, 본 발명에 따르면 미성숙한 진귤의 과피 추출물은 자유유리기 소거활성이 뛰어나고, iNOS 및 COX-2 등의 염증 매개 단백질의 생성을 강하게 억제함으로써 뛰어난 항산화, 항염 효과를 나타낸다는 사실을 규명하였다. 또한, 미성숙 진귤 과피에서 분리한 PMF가 NF-κB 경로와 MAP kinase 경로를 통해 iNOS, COX-2, NO의 생성을 억제한다는 사실을 규명하였다.
그러므로 본 발명에 따른 진귤 과피 추출물 및 진귤 과피로부터 분리한 폴리메톡시플라본 화합물은 우수한 항산화 활성, 항염 활성을 나타내므로 염증과 관련된 증상들을 예방, 개선 및 치료하는데 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 염증의 증상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 염증 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 진귤 과피 추출물 또는 폴리메톡시플라본 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 염증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 미성숙 진귤 과피 추출물 또는 폴리메톡시플라본 화합물의 약학적으로 유효한 양은 0.01 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.1 ~ 10 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 염증 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 염증 예방 또는 치료용 조성물은 염증의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
따라서 본 발명은 진귤 과피 추출물, 폴리메톡시플라본 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 염증 예방 또는 치료용 조성물은 염증의 예방 또는 개선 효과를 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으며, 따라서 상기 본 발명의 조성물은 항염증 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물로 사용할 수 있다.
본 발명의 염증 예방 또는 치료 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물은 염증 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.
본원에서 상기 “식품”이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.
본원발명에 따른 항염증, 항산화 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 “기능성 식품”이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본원발명에서 상기“음료”란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 암 증상의 예방 및 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 항염증, 항산화 증진 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본원발명의 항염증, 항산화 효과를 갖는 기능성 건강식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100㎖를 기준으로 0.01g 내지 20g, 바람직하게는 0.3g 내지 10g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
제조예
1>
<1-1> 실험 준비
본 발명자들은 진귤의 과피 추출물을 수득하기 위해 제주지역에서 재배된 성숙한 진귤과 미성숙한 진귤을 이용하였으며, 과피 추출물을 제조하기 위하여 과피를 벗겨낸 후 충분히 건조시키고 분쇄하여 분말시료를 획득하였다. 분말시료 50g을 80% 에탄올 500㎖를 이용하여 실온에서 3일간 2회 추출하고 또한 동일한 양의 분말시료를 증류수 500㎖를 이용하여 100℃에서 1시간 추출하였다. 이렇게 얻은 추출물은 여과지를 이용하여 여과한 후 회전농축기로 농축하고 동결건조하여 사용하였다. 시료는 실험에 사용하기 전 밀봉하여 냉동보관(-20℃)하였다.
<1-2>
폴리메톡시플라본
(
PMFs
)의 분리
본 발명자들은 진귤 과피로부터 폴리메톡시플라본(PMFs)을 분리하기 위해 물을 용매로 하여 열수추출법을 사용하였다. 일반적으로 비극성 화합물들이 열수추출법에 의한 추출 효율은 크게 떨어지는 편이지만, PMFs인 경우 열수추출물에서도 추출되는 것으로 확인되었다. 열수추출물에 추출된 비극성인 PMFs를 분리하기 위해 다양한 용매분획(n-헥산, 클로로포름(CHCl3), 에틸 아세테이트, 그리고 n-부탄올)을 수행하였다. 그 결과, n-헥산 분획물의 PMFs의 함량은 시넨시틴(sinensetin), 노빌레틴(nobiletin), 탄제레틴(tangeretin)에 대한 함량을 살펴본 결과 75.8 % 이상의 PMFs를 함유하는 것으로 확인되었다. 또한, 클로로포름 분획물은 58.0 % 이상의 PMFs를 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 이러한, PMFs 함량은 다양한 분리 과정을 통해 얻어지는 분리 방법에 비해 아주 간단하면서도 높은 효율을 보이는 것이다.
또한, 본 발명에서는 PMFs를 다량 함유하는 조성물을 분취용-LC를 이용하여 PMFs를 분리하였다. 그 결과, 분석된 시넨시틴(sinensetin), 노빌레틴(nobiletin) 및 탄제레틴(tangeretin) 외에도 다양한 PMFs가 함유되어 있는 것으로 확인되었고, 분리된 PMFs의 구조를 하기 화학식 1 및 표 1에 나타내었다.
| 종류 | 화합물명 | R1 | R2 | R3 | R4 | R5 | R6 |
| PMF1 | 5,7,4'-trimethoxyflavone | OCH3 | H | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 |
| PMF2 | Tetra-O-methylisosutellarein | OCH3 | OCH3 | OCH3 | H | OCH3 | OCH3 |
| PMF3 | Sinensetin | OCH3 | H | OCH3 | OCH3 | H | OCH3 |
| PMF4 | Nobiletin | OCH3 | H | OCH3 | H | H | OCH3 |
| PMF5 | Tangeretin | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 |
| PMF6 | Isosinensetin | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 | H | OCH3 |
| PMF7 | 5-Demehtylnobiletin | OH | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OCH3 |
| PMF8 | 5-Demehtyltangretin | OH | OCH3 | OCH3 | OCH3 | H | OCH3 |
<1-2> 세포 배양
마우스 RAW 264.7 대식세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 구입하였다. 세포는 10% 소태아혈청(FBS; Gibco, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S; Gibco, USA)이 포함된 DMEM(Dulbeccos’s Modified Eagle Medium; Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2를 유지하는 항온기에서 배양하였다.
<1-3> 통계학적 분석
실험결과는 mean±S.D.으로 나타냈으며, student's t-test로 통계학적 유의성을 검증하였다.
<
실시예
1>
진귤
과피
추출물의
DPPH
자유유리기 소거 활성
본 발명자들은 미성숙한 진귤 과피와 성숙한 진귤 과피 추출물의 DPPH의 자유유리기 소거 활성을 측정함으로써 진귤 과피 추출물의 항산화 활성을 살펴보았다. 진귤 과피 추출물 시료의 전자공여능 측정은 Blosis 방법(Blois, 1958)에 따라 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; Sigma, USA)를 이용하여 측정하였다. 먼저 메탄올에 희석시킨 80% 에탄올 추출물을 0, 63, 125, 250, 500, 1000㎍/㎖의 농도로 100㎕씩 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 0.4mM DPPH 용액을 동량 첨가하였다. 이후 96 웰 플레이트를 차광상태에서 20분간 반응시킨 후 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값은 시료의 흡광도를 기준으로 표준화하였고, 대조군으로는 아스코르브산(Sigma, USA)을 사용하였다.
소거능(scavenging activity)은 다음과 같은 식으로 산출하였다.
- DPPH 라디칼 소거능(%) = 100× (Acontrol-Asample)/Acontrol
Acontrol = 메탄올만 첨가한 반응액의 흡광도
Asample = 시료를 첨가한 반응액의 흡광도
DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도를 IC50으로 표시하였으며, 각 시료에 대해 3회 반복 실험하여 평균값으로 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 미성숙한 진귤 과피 추출물의 IC50 값은 882.6±51.4 ㎍/㎖로 산출되었고 성숙한 진귤 과피 추출물의 경우 농도 의존적으로 자유유리기를 소거하는 경향은 보이나 IC50 값은 실험 농도 범위 내에서 산출되지 않았다. 이들의 활성은 대조군으로 사용된 아스코르브산과 비교할 때 낮은 IC50 값이지만 미성숙한 진귤 과피 추출물과 성숙한 진귤 과피 추출물의 활성을 비교한 결과 250㎍/㎖ 농도부터 유의적인 차이를 보이며 미성숙한 진귤 과피 추출물이 비교적 높은 자유유리기 소거 활성을 보이는 것으로 확인되었다.
그러므로 상기 결과를 통해 본 발명의 진귤 과피 추출물이 항산화 활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
2>
진귤
과피
추출물의 세포독성 측정
본 발명자들은 미성숙한 진귤 과피와 성숙한 진귤 과피 추출물의 RAW 264.7 대식세포에 대한 독성평가를 MTT와 LDH 분석을 통해 확인하였다.
<2-1>
MTT
분석
본 발명의 진귤 과피 추출물이 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위해 미토콘드리아의 환원력을 측정하는 MTT 분석을 사용하였다(Ferrari et al., 1990). RAW 264.7세포를 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 세포배양 플레이트(well cell culture plate)에 3×104 cells/well로 넣고 24시간 배양한 후, 0, 9.4, 18.8, 37.5, 75, 150, 300㎍/㎖ 농도의 추출물을 각각 넣고 1시간 배양하고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS; Sigma, USA)를 100ng/㎖이 되도록 첨가한 후 24시간 배양하였다. 이후, MTT(3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Amresco, USA)를 최종 0.4㎎/㎖이 되도록 넣고 1시간 배양한 후 배지를 제거하였다. 200㎕의 DMSO(dimethylsulfoxide; Amresco, USA)를 가하여 포마잔(formazan) 침전물을 용해시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Bio-tek, USA)로 595㎚파장을 이용해 흡광도를 측정하였다. 추출물을 처리한 군의 세포독성은 추출물을 처리하지 않은 군과 흡광도 값을 비교하여 평가하였으며 세포독성은 다음과 같은 식에 의해 산출되었다. 시료는 3-4회 반복 실험하였으며 아래 식에 의해 산출된 값의 평균으로 나타내었다.
세포독성(%) = 100-(Acontrol-Asample)/Acontrol×100
상기 식에서,
Acontrol = 추출물을 처리하지 않은 군의 흡광도,
Asample = 추출물을 처리한 군의 흡광도를 나타낸다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 농도범위(9.4 ~ 300㎍/㎖)에서 시료가 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
<2-2>
LDH
분석
세포 배양액을 이용하여 세포 손상을 측정하는 방법인 LDH 분석을 수행하였다(He et al., 2002). RAW 264.7세포를 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 세포배양 플레이트(well cell culture plate)에 3×104 cells/well로 넣고 24시간 배양한 후, 0, 9.4, 18.8, 37.5, 75, 150, 300㎍/㎖ 농도의 추출물을 넣고 1시간 배양하고 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS; Sigma, USA)를 100ng/㎖이 되도록 첨가한 후 22시간 배양하였다. 이후, 배양액 50㎕에 LDH 측정 혼합액(LDH Cytotoxicity Detection Kit; TaKaRa, Japan) 50㎕를 넣고 반응시키고 HCl을 최종 0.2N이 되도록 처리하여 반응을 정지시켰다. 이를 마이크로플레이트 리더로 490㎚파장을 이용해 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 세포에 Triton X-100(Sigma, USA)용액을 최종 1%가 되도록 처리한 세포 배양액을 사용하였으며, 세포 상해 비율(세포독성)은 다음과 같은 식에 의해 산출되었다. 시료는 3-4회 반복 실험하였으며 아래 식에 의해 산출된 값의 평균으로 나타내었다.
세포독성(%) = 100× (Asample-Alower control)/(Aupper control-Alower control)
상기 식에서,
Aupper control = Triton-X100 용액의 첨가로 최대로 방출되는 LDH 활성,
Alower control = 시료와 Triton-X100 용액의 미처리군에서 방출되는 LDH 활성,
Asample = 시료를 처리한 군에서 방출되는 LDH 활성을 나타낸다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 농도범위(9.4 ~ 300㎍/㎖)에서 시료가 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
<
실시예
3>
진귤
과피
추출물의 일산화질소(
NO
) 생성 억제 활성
본 발명자들은 상기 <실시예 2>의 세포독성 평가와 동일한 농도 범위(0, 9.4, 18.8, 37.5, 75, 150, 300㎍/㎖)에서 두 가지 추출물의 일산화질소 생성 억제활성을 비교하였다. LPS에 의해 유도된 RAW 264.7세포로부터 생성된 일산화질소(NO)는 세포 배양액에 Griess 시약을 첨가하는 방법으로 아질산염(nitrite) 형태의 일산화질소 양을 측정하였다. 세포배양액 100㎕와 Griess 시약[1%(w/v) 설파닐아미드(sulfanilamide), 0.1% N-1-나프틸에틸렌 디아민(N-1-napthylethylene diamine) in 2.5% (v/v) 인산(phosphoric acid)] 100㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분간 반응시킨 후 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(Sodium nitrite)을 이용해 표준곡선을 구하고 이를 이용해 생성된 일산화질소 값을 산출하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미성숙한 진귤 과피 추출물의 경우 37.5㎍/㎖ 농도에서부터 양성 대조군에 비해 일산화질소의 생성이 유의적으로 감소하였으며, 성숙한 진귤 과피 추출물의 경우 75㎍/㎖ 농도에서부터 일산화질소의 생성이 유의적으로 감소하였고, 두 가지 추출물 모두 농도 의존적인 경향을 나타내었다. 미성숙한 과피 추출물의 일산화질소 생성 억제 활성과 성숙한 과피 추출물의 일산화질소 생성 억제 활성을 동일농도 간 비교한 결과 37.5㎍/㎖ 농도에서부터 미성숙한 과피 추출물이 성숙한 과피 추출물에 비해 억제 활성이 좋은 것을 확인하였다.
그러므로 상기 결과를 통해, 진귤 과피 추출물이 대식세포에서 일산화질소의 생성을 저해하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었고, 특히 미성숙한 과피 추출물이 세포 독성이 없으면서 대식세포에서 일산화질소의 생성을 현저하게 저해하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
<
실시예
4>
진귤
과피
추출물의
ROS
생성 억제 활성
본 발명자들은 LPS 자극으로 인해 세포내에서 생성되는 H2O2 형태의 활성산소종(ROS)을 측정함으로써 진귤 과피 추출물이 갖는 세포내에서의 항산화 능력을 평가하였다.
ROS 측정을 위해 5-(6-)-chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester(CM-H2DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하였다 (Choi et al., 2007). RAW 264.7세포를 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 세포배양 플레이트에 3×104 cells/well로 넣고 24시간 배양하였다. 이후 세포가 들어있는 96 웰 플레이트에 CM-H2DCFDA를 최종 50μM이 되도록 넣고 차광 상태에서 30분간 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0, 37.5, 75, 150, 300㎍/㎖ 농도의 추출물을 넣고 1시간 배양하고 LPS를 500ng/㎖이 되도록 첨가하여 28시간 배양하였다. 형광측정장치를 이용하여 485㎚/520㎚의 파장에서 형광을 측정하였으며, 5회 반복 실험하여 평균값으로 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 미성숙한 과피 추출물과 성숙한 과피 추출물 모두 양성 대조군에 비해 시료를 처리한 군에서 활성산소종의 생성이 유의적으로 줄어들었으며 이는 농도 의존적인 양상을 보여주었다. 특히 미성숙한 진귤 과피 추출물을 성숙한 진귤 과피추출물과 억제 활성을 비교한 결과 300㎍/㎖ 농도에서 미성숙한 진귤 과피 추출물이 현저하게 ROS 생성을 억제하는 것을 관찰할 수 있었다.
그러므로 상기 결과를 통해, 진귤 과피 추출물이 대식세포에서 ROS의 생성을 억제하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었고, 특히 미성숙한 진귤 과피 추출물이 성숙한 진귤 과치 추출물보다 대식세포에서 ROS의 생성을 현저하게 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
<
실시예
5>
진귤
과피
추출물의
iNOS
및
COX
-2 단백질 발현에 미치는 영향
본 발명자들은 진귤 과피 추출물이 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿(western blot = immunoblotting)을 이용하여 확인하였다.
RAW 264.7세포를 12 웰 세포배양 플레이트에 5×105 cells/well로 넣고 24시간 배양한 후, 본 발명에 따른 추출물을 넣고 1시간 배양하고 LPS를 100ng/㎖이 되도록 첨가하여 18시간 배양하였다. 이후 세포를 차가운 PBS를 이용해 2회 세척하고 라이시스 버퍼(lysis buffer)[1×RIPA(Upstate Cell Signaling Solution, Lake Placid, NY, USA), 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1mM NaVO4, 1mM NaF, 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin), 및 1㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin)]를 이용해 1시간 동안 세포를 용해(lysis)시킨 후 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)을 표준으로 Bio-Rad protein assay reagent를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백을 8~12%의 폴리아크릴아마이드 겔(polyacylamid gel)에 전기영동하고 PVDF막(poly-vinylidene difluoride membrane; Milipore, USA)에 250mA, 180분 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 막을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% T/TBS(Tween 20/Tris-buffered saline)에 넣고 상온에서 1시간 블록화(blocking)시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS 항체(1:5,000, Calbiochem, USA), COX-2 항체(1:5,000, BD Transduction Lacoratories, USA), phospho-ERK1/2 항체(1:500, Santa Cruz, USA), ERK1/2 항체(1:1,000, Santa Cruz, USA), phospho-SAPK/JNK 항체(Thr183/Tyr185), SAPK/JNK 항체, phospho-p38 MAP 키나아제(Thr180/Tyr182), p38 MAP 키나아제(1:1,000, Cell Signaling Tech, USA), IκB-α 항체(1:1,000, Santa Cruz, USA), β-actin 항체 클론 AC-74(1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 막은 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척한 후, 페록시다아제가 컨주게이트된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:5,000 또는 1:10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척하였다. 단백질은 ECL(Enhanced chemiluminescence) 방법을 이용해 X-ray 필름으로 결과를 확인하였다.
<5-1>
iNOS
단백질 발현 억제 활성
미성숙한 진귤 과피 추출물의 NO 생성 저해 기전을 확인하기 위해 iNOS 단백질 발현을 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 대식세포에 LPS를 단독으로 처리하였을 때 iNOS 단백질 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, 이때 추출물을 75, 150, 300㎍/㎖ 농도로 1시간 전 처리한 경우 iNOS 단백질의 발현양이 농도 의존적으로 감소하였다. 성숙한 진귤 과피 추출물 역시 iNOS 단백질 발현을 농도 의존적으로 감소시키나 미성숙한 진귤 과피 추출물에 비해 단백질 발현 억제 활성이 낮은 것을 보여주었다.
<5-2>
COX
-2 단백질 발현 억제 활성
RAW 264.7 대식세포에서 LPS 자극으로 인해 발현되어 염증매개 인자를 형성하는 COX-2 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 대식세포에 LPS를 단독으로 처리하였을 때 COX-2 단백질 발현양이 증가하였고 이 때 추출물을 75, 150, 300㎍/㎖ 농도로 1시간 전 처리한 경우 COX-2 단백질의 발현양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 미성숙한 진귤 과피 추출물을 성숙한 진귤 과피 추출물과 비교하여 COX-2 단백질 발현양을 확인한 결과 두 가지 추출물 모두 농도 의존적으로 COX-2 단백질 발현을 감소시키나 미성숙한 과피 추출물이 성숙한 과피 추출물에 비해 현저하게 단백질 발현을 감소시키는 것을 보여주었다.
<
실시예
6>
진귤
과피
추출물의
전염증성
매개인자의
발현에 미치는 영향
본 발명자들은 진귤 과피 추출물이 전염증성 매개인자(cytokine)의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, RT-PCR(Real time PCR) 방법을 사용하였다. RT-PCR(Real time PCR)에 의해 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현 수준을 평가하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 대조군으로는 β-actin을 사용하였다.
미성숙한 진귤 과피와 성숙한 진귤 과피가 RAW 264.7 대식세포에서 cytokine의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Real-time PCR 방법을 사용하였다.
RT-PCR 분석을 위해 RAW 264.7세포를 12 웰 세포배양 플레이트에 1×106cells/well로 넣고 18시간 배양 후 300㎍/㎖의 추출물을 각각 넣고 1시간 전 배양하고, 이후 LPS를 100ng/㎖가 되도록 첨가한 후 4~6시간 배양하였다. 세포의 전체 RNA는 TRI 시약(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH)을 이용하여 분리하였다.
배양이 끝난 세포에 TRI 시약을 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심분리(12,000rpm, 15분, 4℃)하였다. 상등액을 회수하여 동량의 이소프로란올을 첨가하고 원심분리(12,000rpm, 8분, 4℃)하여 RNA를 침전시키고 이를 75% 에탄올로 세척하고 원심분리(7,500rpm, 5 min, 4℃)한 후, 상등액을 제거하고 건조시켰다. RNA는 Nuclease-free water(Amresco, USA)에 용해시킨 후 260㎚ 파장으로 흡광도를 측정하여 정량하였다. A260/A280㎚의 비율이 1.6~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA 시료를 실험에 사용하였다.
cDNA는 Maxime RT 프리믹스 키트(Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 합성하였다. 1㎍ 전체 RNA와 Nuclease-free water를 최종 20㎕가 되도록 프리믹스 튜브(premix tube)에 첨가한 후 45℃에서 60분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Nuclease-free water를 첨가하여 최종 50㎕로 보관하였다.
유전자들의 발현 분석을 측정하기 위해 iQ SYBR Green Supermix(SYBR Supermix; Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 반응은 cDNA 1㎕, 프라이머 각 10pmole, 2×SYBR Supermix 5㎕를 혼합한 후 Nuclease-free water를 가하여 반응액을 10㎕에 맞춘 다음, Chromo 4TM Real time PCR Detector(Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분간 초기 활성화시킨 다음, 95℃에서 20초간 변성(denaturation), 65℃에서 20초간 결합(annealing), 72℃에서 30초간 합성(extension)의 과정을 한 사이클로 하여 총 44회 반복 실시하여 증폭하였고, 각 사이클의 합성 후에 형광 값이 기록되었다. 모든 사이클이 완료된 후 65℃에서 95℃까지 반응시켜 프라이머의 DNA 변성곡선(melting curve) 분석을 실시하였다. 결과는 Chromo 4 Real-Time PCR Detection system의 Gene expression analysis(Bio-Rad, USA)를 이용해 분석하였다. RT-PCR에서 사용된 프라이머의 염기서열과 생성물의 크기는 하기 표 2에 나타내었다.
| 유전자 | 염기서열 | 서열번호 | 크기(bp) | |
| IL-1β | 정방향 | 5'-CAGGATGACATGAGCACC-3' | 1 | 447 |
| 역방향 | 5'-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3' | 2 | ||
| IL-6 | 정방향 | 5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3' | 3 | 308 |
| 역방향 | 5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3' | 4 | ||
| TNF-α | 정방향 | 5'-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3' | 5 | 374 |
| 역방향 | 5'-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3' | 6 | ||
| β-actin | 정방향 | 5'-GTACCCCATTGAACATGGCA-3' | 7 | 200 |
| 역방향 | 5'-CTACGTACATGGCTGGGGTG-3' | 8 | ||
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 세포에 100ng/㎖의 LPS를 처리하고 4시간 경과 후 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 mRNA 발현이 유도되었다. 이 때 각 추출물을 1시간 전처리 후 동일하게 LPS를 처리한 군의 경우 양성 대조군(β-actin)에 비해 cytokine mRNA의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 비록 미성숙한 과피 추출물이 뛰어난 효과를 나타내진 않았으나, 이는 진귤의 미성숙 또는 성숙 추출물 모두 전염증성 매개인자의 초기 발현을 억제한다는 것을 의미한다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 진귤 과피 추출물이 LPS에 의해 자극된 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 유도를 전사단계에서 효과적으로 억제한다는 사실을 알 수 있었다.
<
실시예
7>
진귤
과피에서
분리한
폴리메톡시플라본의
세포독성 측정
본 발명자들은 진귤 과피에서 분리한 폴리메톡시 플라본(PMF)의 RAW 264.7 대식세포에 대한 독성평가를 상기 <실시예 2>에서와 동일한 방법으로 MTT와 LDH 분석을 통해 확인하였다. 이때, 처리한 PMF의 농도는 0, 6.25. 12.5, 25, 50, 100μM 이었다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, PMF는 MTT 와 LDH 분석을 통해 실험에 사용된 농도 범위(6.25~100μM)에서 시료가 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
<
실시예
8>
진귤
과피에서
분리한
폴리메톡시플라본의
일산화질소 생성 억제 활성
본 발명자들은 상기 <실시예 7>의 세포독성 평가와 동일한 농도 범위(0, 6.25. 12.5, 25, 50, 100μM)에서 PMF의 일산화질소 생성 억제활성을 상기 <실시예 3>에서와 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, PMF를 처리한 군의 경우 모든 농도 범위에서 양성 대조군과 비교하여 유의적으로 일산화질소의 생성을 억제하였고 농도의존적인 경향을 나타내었다. 추출물을 100μM로 처리한 군은 양성 대조군에 비해 40% 이상 일산화질소의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
9>
진귤
과피에서
분리한
폴리메톡시플라본의
iNOS
및
COX
-2 단백질 발현에 미치는 영향
본 발명자들은 진귤 과피에서 분리한 PMF가 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 상기 <실시예 5>에서와 같은 방법을 이용하여 확인하였다.
<9-1>
iNOS
단백질 발현 저해 활성
PMF의 일산화질소 생성 저해 기전을 확인하기 위해 iNOS 단백질 발현을 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 대식세포에 LPS를 단독으로 처리하였을 때 iNOS 단백질 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, 이때 시료를 12.5, 25, 50, 100 μM 농도로 1시간 전 처리한 경우 iNOS 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.
<9-2>
COX
-2 단백질 발현 저해 활성
PMF가 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 대식세포에 LPS를 단독으로 처리하여 COX-2 단백질 발현양이 증가하는 것을 확인하였으며, 이때 시료를 12.5, 25, 50, 100 μM 농도로 1시간 전 처리한 경우 양성 대조군에 비해 COX-2 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
10>
진귤
과피에서
분리한
폴리메톡시플라본이
NF
κB 경로와
MAP
kinase
경로에 미치는 영향
<10-1> IκB-α 분해에 미치는 영향
PMF가 NFκB 경로에 미치는 영향을 확인하기 위해 IκB-α 분해를 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, LPS 처리 후 10분, 20분까지는 PMF가 IκB-α의 분해에 영향을 미치지 않는 것으로 보이나 40분부터는 PMF를 처리한 군의 IκB-α의 양이 PMF를 처리하지 않은 군에 비해 많은 것을 볼 수 있고 이는 60분에서도 동일한 경향을 나타내었다. 이와 같은 결과는 PMF가 NFκB 경로에 있어 IκB-α분해에 영향을 미치는 것을 의미한다.
<10-2>
MAP
키나아제
인산화에 미치는 영향
PMF가 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 MAP 키나아제 인산화에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 기법으로 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, phospho-ERK의 경우 PMF 처리 후 30분에서는 인산화에 영향이 없지만 1시간부터 PMF를 처리하지 않은 군에 비해 인산화가 감소되는 양상을 확인하였다. 이후 12시간, 18시간에서 역시 PMF 미처리군에 비해 PMF 처리군에서 phospho-ERK의 인산화가 주기적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. phospho-JNK 와 phospho-P38은 PMF를 세포에 처리하고 1시간 후 LPS로 자극해 1시간 까지는 이들 키나아제의 활성화에 영향을 미치지 못하였다. 그러나 6시간에서 phospho-JNK 와 phospho-P38이 시료 미처리 군에 비해 시료 처리 군에서 인산화가 감소된 것을 확인하였고, 12시간, 18시간에서 역시 인산화가 감소하는 양상을 나타내었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Jeju Mational University
<120> Composition for inhibition of inflammation comprising extract of
citrus sunki Hort. or compounds isolated therefrom
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1B F primer
<400> 1
caggatgaca tgagcacc 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1B R primer
<400> 2
ctctgcagac tcaaactcca c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 F primer
<400> 3
gtactccaga agaccagagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 R primer
<400> 4
tgctggtgac aaccacggcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNFa F primer
<400> 5
ttgacctcag cgctgagttg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNFa R primer
<400> 6
cctgtagccc acgtcgtagc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-actin F primer
<400> 7
gtaccccatt gaacatggca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B-actin R primer
<400> 8
ctacgtacat ggctggggtg 20
Claims (10)
- 미성숙 진귤 과피 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 미성숙 진귤 과피는 녹색 계열의 색을 띄는 과피인 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미성숙 진귤 과피 추출물은 항산화 활성, ROS 생성 억제활성 또는 NO 생성 억제활성이 있는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 미성숙 진귤 과피 추출물은 대식세포에서 iNOX, COX-2, IL-1β, IL-6 또는 TNF-α의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 폴리메톡시플라본 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증 억제용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 폴리메톡시플라본 화합물은 미성숙 진귤 과피로부터 분리된 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 폴리메톡시플라본 화합물은 항산화 활성, ROS 생성 억제활성 또는 NO 생성 억제활성이 있는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 폴리메톡시플라본 화합물은 대식세포에서 LPS에 의한 염증 신호전달 초기에 ERK, JNK, p38의 인산화를 감소시킴으로써 iNOX 및 COX-2의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 폴리메톡시플라본 화합물은 NF-kB 또는 MAP 키나아제 경로를 통해 iNOX 및 COX-2의 발현을 억제하는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 염증 억제용 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 염증 억제용 건강기능식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100054491A KR20110134742A (ko) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100054491A KR20110134742A (ko) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110134742A true KR20110134742A (ko) | 2011-12-15 |
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ID=45501930
Family Applications (1)
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| KR1020100054491A KR20110134742A (ko) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | 진귤 과피 추출물 또는 이로부터 분리한 폴리메톡시플라본을 유효성분으로 함유하는 염증 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20110134742A (ko) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150069841A (ko) * | 2013-12-16 | 2015-06-24 | 명지대학교 산학협력단 | 감귤류에서 노빌레틴 및 탄제레틴 함량이 높은 추출물을 추출하는 방법과 추출물의 용도 |
| WO2016153211A3 (ko) * | 2015-03-20 | 2016-11-17 | 주식회사 뉴트라팜텍 | 감귤류 과피 추출물의 제조방법 및 간 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
| CN108024948A (zh) * | 2015-09-08 | 2018-05-11 | 赛特瑞恩股份有限公司 | 包含天然植物提取物的用于减轻由黄尘和细颗粒物引起的皮肤炎症的组合物 |
| KR20200125086A (ko) * | 2019-04-26 | 2020-11-04 | 박재규 | 청귤류로부터 5-o-디메틸노빌레틴의 추출/분리 및 만성 알코올성 지방간 손상보호 조성물 |
| KR20230059580A (ko) | 2021-10-26 | 2023-05-03 | 제주대학교 산학협력단 | 진귤 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 이의 용도 |
-
2010
- 2010-06-09 KR KR1020100054491A patent/KR20110134742A/ko not_active Application Discontinuation
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|---|---|---|---|---|
| KR20150069841A (ko) * | 2013-12-16 | 2015-06-24 | 명지대학교 산학협력단 | 감귤류에서 노빌레틴 및 탄제레틴 함량이 높은 추출물을 추출하는 방법과 추출물의 용도 |
| WO2016153211A3 (ko) * | 2015-03-20 | 2016-11-17 | 주식회사 뉴트라팜텍 | 감귤류 과피 추출물의 제조방법 및 간 손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
| CN108024948A (zh) * | 2015-09-08 | 2018-05-11 | 赛特瑞恩股份有限公司 | 包含天然植物提取物的用于减轻由黄尘和细颗粒物引起的皮肤炎症的组合物 |
| KR20200125086A (ko) * | 2019-04-26 | 2020-11-04 | 박재규 | 청귤류로부터 5-o-디메틸노빌레틴의 추출/분리 및 만성 알코올성 지방간 손상보호 조성물 |
| KR20230059580A (ko) | 2021-10-26 | 2023-05-03 | 제주대학교 산학협력단 | 진귤 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 이의 용도 |
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