KR101547665B1 - 데속소-나치놀 Ａ 및 ８α-하이드록시피노레시놀을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 데속소-나르치놀(desoxo-narchinol; DN) A 또는 8α-하이드록시피노레시놀(hydroxypinoresinol; HP)을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 염증을 효과적으로 억제하므로 패혈증의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

데속소-나치놀 Ａ 및 ８α-하이드록시피노레시놀을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING SEPSIS COMPRISING DESOXO-NARCHINOL-A AND 8α-HYDROXYPINORESINOL AS ACTIVE INGREDIENTS}

본 발명은 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 데속소-나치놀 Ａ 및 ８α-하이드록시피노레시놀을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물, 그리고 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

패혈증은 전 세계적으로 중환자실 이환율 및 사망률의 주요한 원인으로 알려져 있고 국내에서도 정확한 통계는 없지만 매우 높은 발병률을 나타내고 있다. 패혈증(sepsis)은 병원성 그람 음성 세균이 생체에 감염된 경우 세포벽의 성분인 리포폴리사카라이드(LPS)가 독소로 작용하여 생체의 면역체계가 과도하게 활성화됨으로써 유발되며, 전신에 감염증을 일으키거나 증상이 심할 경우 쇼크를 동반하기도 한다. 패혈증은 병원 중환자 병동에 입원한 환자가 사망하는 주요한 원인이 되며, 이에 의한 치사율이 보통 30% 이상인 매우 심각한 질병이고, 의학기술의 발전에도 불구하고 아직도 전 세계적으로 수술의 후유증으로 감염이 되어 패혈증이 발생하는 경우도 많으며, 또한 신생아나 노인들과 같이 체내의 면역력이 약한 사람이 감염이 되었을 경우 패혈증으로 진행되는 경우도 많다. 패혈증에 걸렸을 경우 대개 항생제 치료를 받게 되지만, 적절한 처치가 늦어져 균들이 많이 증식했을 경우나 항생제에 내성이 강한 균주에 의해 감염이 되었을 경우에는 항생제만으로는 효과적인 치료를 할 수 없다. 이처럼 다양한 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균이 점차로 증가하는 현상과 관련하여, 이의 치료가 매우 중요한 문제로 대두되고 있으나, 아직까지 이에 대한 적합한 치료제가 개발되지 못하고 있다.

패혈증의 진행과정에서 나타나는 임상적 특성의 하나가 패혈증의 초기에 체내 염증계가 과활성화되는 것이므로, 패혈증의 치료를 위하여 이러한 염증반응을 수반하거나 촉진하는 TNF-α, 인터루킨-6, 인터루킨-1, 인터루킨-8과 같은 매개체를 억제하려는 수많은 시도가 있어왔으나 환자의 생존율을 개선하지 못했다. 염증 과정 동안에, 염증반응 촉진세포(proinflammatory cells; 주로 활성화된 대식세포)가 사이토카인 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자 알파(TNF-α), 프로스타글란딘 E2(PGE2), 및 산화질소(NO)를 포함하는 다른 염증반응의 촉진 분자를 생성함에 의해, 패혈증의 대부분의 세포적 및 분자적 병리생리학적 원인이 된다 (Szekanecz Z, Koch AE. 2007. Curr Opin Rheumatol 19: 289-295; Kang YJ, Wingerd BA, Arakawa T et al. 2006. J Immunol 177: 8111-8122; Noguchi S, Nakatsuka M, Konishi H et al. 2003. Int Immunopharmacol 3: 1335-1344). 다양한 염증 매개체 중에, 2가지 가장 중요한 것은 NO 및 PGE2이고, 이것은 각각 유도성 NO 합성효소(iNOS) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 생성물이다 (Vane JR, Mitchell JA, Appleton I et al. 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91: 2046-2050).

한편, 감송향 (Nardostachys jatamansi, NJ)은 심계항진, 정신장애, 불면증, 뇌전증, 혈액장애, 및 순환계 질환을 치료하기 위하여 아시아의 몇 나라에서 널리 사용되고 있다. 야타만시산(Jatamansic acid), 야타만손(Jatamansone), 리그난(lignans) 및 네오리그난(neolignans)과 같은 것들이 이들 식물의 뿌리에 존재한다. 감송향의 뿌리를 달인 물은 정신장애, 불면증, 혈액장애 및 순환계 장애에 사용되었으며, 감송향의 주요한 치료 성분은 향신경 활성 및 중추 신경계 (CNS) 효과를 증진시키는 나도시논 (nardosinone)이다.

본 발명자들은 앞서서 감송향이 급성 췌장염, 및 폐혈증에 보호 효과를 가짐을 보고하였다. 그러나, 지질다당체 (LPS)에 대한 항염증 효과를 나타내는 NJ-분리 화합물은 연구되지 않았다. 이에, 본 발명자들은 항염증 효과를 나타내는 NJ에서 분리된 화합물을 찾고자 노력하던 중, NJ에서 분리된 DN(desoxo-narchinol A) 및 HP(8α-hydroxypinoresinol)이 LPS 처리된 쥐의 복막 대식세포에서 항염증 효과를 연구한 결과, DN 및 HP는 강하게 LPS-유도 반응을 억제하고 HP는 p38 MAPKs의 활성화를 상당히 억제함을 확인함으로써 본 발명의 상기 물질들이 패혈증의 치료제로 사용될 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용가능한 물질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 데속소-나르치놀(desoxo-narchinol; DN) A를 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

또한, 본 발명은 상기 화학식 하기 화학식 2의 8α-하이드록시피노레시놀(hydroxypinoresinol; HP)을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 2>

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 데속소-나르치놀(desoxo-narchinol; DN) A와 상기 화학식 2의 8α-하이드록시피노레시놀(hydroxypinoresinol; HP)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

그리고, 상기 DN 또는 HP는 감송향으로부터 분리되는 것이 바람직하며, 상기 유효성분은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

그리고 본 발명은 상기 DN 또는 HP를 활성성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 목적을 달성하기 이하여, 본 발명자들은 iNOS, NO, COX-2, 및 PGE2와 같은 염증 매개체의 생성을 연구하였다. 추가하여, 본 발명자들은 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6를 포함한 염증 사이토카인의 생성을 연구하였다. 추가하여, DN 및 HP를 조절하는 기전을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 및 NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화를 연구하였다.

감송향은 지질다당체(lipopolysaccharide)에 대한 항염증 효과를 나타낸다고 보고되어 왔다. 그러나, 감송향으로부터 어떤 성분이 항염증 효과를 생성하는지에 대해서는 알려져 있지 않았다.

본 발명은 쥐의 복막 대식세포에서 지질다당체-유발 염증에 대한 감송향으로부터 분리된 DN(Desoxo-Narchinol-A) 및 HP(8α-hydroxypinoresinol)의 효과를 제공하는 것이다. 항염증 효과는 유도성 산화질소 합성효소 및 그것의 유도체 산화질소, 시클로옥시게나제(cyclooxygenase)-2, 프로스타글란딘 E2, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 및 종양괴사인자 알파와 같은 염증 매개체를 측정함에 의해 평가된다. 추가하여, 본 발명자들은 DN 및 HP 효과에 기초하는 조절 기전을 제공한다. 본 발명자들은 DN 및 HP가 모두 유도성 산화질소 합성효소, 산화질소, 시클로옥시게나제-2, 및 프로스타글란딘 E2 생성을 억제함을 발견하였다. DN는 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 및 종양괴사인자 알파를 억제하는 반면에, HP는 단지 인터루킨-6, 및 종양괴사인자 알파를 억제하지만 인터루킨-1β를 억제하지 못했다. 추가하여, DN 또는 HP의 처리는 p38 MAP 카이나제의 활성화를 억제한다. 함께 판단하건대, 상기 결과는 감송향으로부터 분리된 DN 및 HP는 쥐 대식세포에서 개별적으로 효과적인 항염증 활성을 갖는 성분일 수 있음을 나타낸다.

우리의 이전의 연구는 NJ의 항염증 효과를 조사하였다. 그러나, NJ의 어떠한 성분이 LPS에 대한 항염증 효과를 생성하는지에 대해서는 알려지지 않은 상태이다. 그러므로, 본 발명자들은 NJ로부터 2가지 성분, DN 및 HP를 분리하였다. 본 발명에서 대식세포에서 감소된 염증 매개체 생성에 의해 제시한 바와 같이, DN 및 HP는 강하게 LPS-유도 반응을 억제하였다. 추가하여, DN 및 HP는 p38 MAPKs의 활성화를 상당히 억제하였다.

유도성 NO 합성효소는 마이크로몰 범위에서 세포성 NO 수준을 증가시킬 수 있고, 이것은 다양한 염증 질환에서 중요한 역할을 수행할 수 있는 생리학적 면역 효과에 중요할 수 있다. COX-2 활성의 상승은 PGE2를 포함하여 염증 반응에 중요한 프로스타노이드(prostanoid)의 합성을 담당한다. 본 발명에서, DN 및 HP는 iNOS 매재 NO 생성 및 COX-2-매개 PGE2 합성을 억제하였고, 이것은 DN 및 HP가 염증 과정을 약화시킬 수 있음을 제안한다.

톨(toll)-유사 수용체 4의 리간드, LPS는 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α와 같은 많은 수의 염증 촉진 사이토카인을 유도할 수 있고, 대식세포에서 염증의 강력한 자극제이다. 이제 일반적으로 염증 증후군에 기반하는 대부분의 병리학적 과정은 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 급격한 과잉생성에 의해 유발된다고 여겨진다. 추가하여, 패혈증에 있어서, IL-6 및 TNF의 수준이 염증 공간에서 상승된다. DN 및 HP의 선처리는 투여량-의존 경향으로 IL-6 및 TNF-α 단백질 수준에서 LPS-유도 상승조절을 감소시킨다. DN은 또한 IL-1β 생성을 억제시켰다. 이러한 데이터는 DN 및 HP에 의한 염증 촉진 사이토카인의 억제가 이들의 항-염증 활성에 기여할 수 있음을 나타낸다.

LPS에 의해 유도된 염증은 NO 및 사이토카인 상승조절과 관련되고, 이것은 결국 MAPKs and NF-κB의 활성화를 가져온다. 일반적으로, 유도된 MAPKs는 p38, ERK1/2 및 JNK이고, MAPKs는 자주 자기 인산화(self-phosphorylation)에 의해 활성화된다. 그러나, NF-κB의 활성화는 주로 인산화 및 이어지는 Iκ-Bα의 분해에 의해 매개된다. MAPKs중에서, p38이 부상후 염증세포 활성화에 대해 중요한 역할을 담당한다. p38의 결여시에, 세포 프라이밍(priming)이 이루어지지 않고, p38α-KO 생쥐내 보여지는 사이토카인의 상승된 수준이 사이토카인 수준의 세포 활성화 또는 만성적 상승을 생성하지 않는다. 그러므로, p38에 의한 세포 활성화는 미지의 공격 이후에 급성 또는 만성 염증의 상태를 유지시키는데 중요하고, p38α의 억제 또는 제거는 결과를 상승시킬 수 있다. 우리의 결과는 DN and HP이 p38의 활성화를 억제시키지만, ERK 1/2, JNK, 또는 NF-κB의 활성화는 억제시키는 못함을 제시하였다. 그러나, DN 및 HP 의 억제 기전은 NJ 전체 추출물과는 다르다. NJ 추출무은 모든 MAPKs의 활성화를 억제시켰지만, NJ로부터 분리된 DN 및 HP는 단지 p38 활성화를 억제시켰고, 이것은 NJ로부터의 다른 다른 성분이 ERK 1/2 및 JNK 활성화를 억제시킬 수 있음을 의미한다. 추가적인 연구를 통하여, NJ로부터 다른 분리된 성분의 잠재력을 연구할 필요성이 있다.

함께 판단하건대, 본 발명자들은 DN 및 HP의 항 패혈증 효과를 증명하였다; DN 및 HP는 iNOS, NO, COX-2, PGE2, 및 염증촉진 사이토카인과 같은 염증 매개체를 억제시켰다. 우리의 데이터는 감송향으로부터 분리된 DN 및 HP는 p38 경로의 비활성화에 의하여 LPS-유도 패혈증 상태의 방지를 위한 잠재적 치료 전략을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약리효과를 증진시키기 위해 약학적으로 허용가능한 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 유효성분을 분리한 후 약학적 조성물에 포함시킬 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

본 발명의 조성물에 추가될 수 있는 생약재는 약학적으로 허용되는 임의의 생약재일 수 있으며, 예를 들면, 고본 (Angelicae tenuissimae Radix), 천마 (Gastrodiae Rhizoma), 시호 (Bapleuri Radix), 당귀 (Angelicae gigantis Radix), 도인 (Persicae Semen), 계지 (Cinnamomi Ramulus), 대황 (Rhei Rhizoma), 감초(Glycyrrhizae Radix), 천궁 (Cnidii Rhizoma), 진피 (Aurantii nobilis Pericarpium), 택사 (Alismatis Rhizoma), 황련 (Coptidis Rhizoma), 황금 (Scutellariae Radix), 복령 (Hoelen), 작약 (Paeoniae Radix), 백출 (Atractylodis Rhizoma alba), 황백 (Phellodendri Cortex), 치자 (Gardeniae Fructus), 반하 (Pinelliae Tuber), 조구등 (Uncaria Ramuluset Uncus), 지실 (Ponciri Fructus), 인삼 (Gingseng), 맥문동 (Liriopis Tuber), 원지 (Polygalae Radix), 석창포 (Acori graminei Rhizoma), 창출 (Atractylodis Rhizoma alba), 감국 (Chrysanthemi Flos), 방풍 (Ledebouriellae Radix), 생강 (Zingiberis Rhizoma crudus), 망초 (Natrii sulfas), 대조 (Zizyphi Fructus), 단삼 (Salviae Radix), 목단피 (Mautan Radicis Cortex), 지황 (Rehmanniae Radix), 박하 (Menthae Herba), 산약 (Dioscoreae Rhizoma), 저령 (Polyporus), 하수오 (Polygonimultiflori Radix), 구자 (Allii tuberosi Semen), 결명자 (Cassiae Semen), 구기자 (Lycii Fructus), 독활 (Araliae cordatae Radix), 두충 (Eucommiae Cortex), 백화사설초 (Hedyotis Herba), 삼백초 (Saururus Herba), 인진 (Artemisiaecapillaris Herba), 지모 (Anemarrhenae Rhizoma), 홍화 (Carthami Flos), 황기 (Astragali Radix), 석송자 (Lycopodium), 은행잎 (Ginkgonis Folium), 황정 (Polygonati Rhizoma), 연자육 (Nelumbinis Semen), 용골 (Fossilia ossis Mastodi), 지골피 (Lycii radicis Cortex), 우슬 (Achyranthis Radix), 숙지황 (Rehmanniae Radix preparata), 흑임자 (Perillae Semen), 백자인 (Thujae Semen), 맥아 (Hordei Fructus germinatus), 토사자 (Cuscutae Semen), 파극천 (Morindae Radix), 해송 (Pini koraiensis Radix) 등을 단독으로 또는 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다.

또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 '경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 활성성분인 DN 및 HP의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 DN 및 HP의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎍ 내지 5 ㎎, 가장 바람직하게는 5 ㎍ 내지 1 ㎎일 수 있다. 그러나, 상기 DN 및 HP의 용량은 약학적 조성물의 투여경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 DN 및 HP을 패혈증의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 DN를 활성성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 DN 이외에 추가적으로 상기 화학식 2의 HP를 활성성분으로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 DN 및 HP 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 DN 및 HP과 패혈증의 예방 및 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 DN 및 HP을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 DN 및 HP을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 DN 및 HP을 유효성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 DN 및 HP을 포함하는 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 염증을 효과적으로 억제하므로 패혈증의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 복막 대식세포 세포 생존 능력에 DN 및 HP의 효과를 나타낸 것으로, 표시된 투여량에서 DN 또는 HP와 함께 세포를 배양하였다. 24시간 이후에, 실시예에서 설명한 MTT 분석에 의해 세포 생존 능력을 측정하였다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균이다 (#p < 0.001 vs. DMSO).
도 2는 iNOS 및 NO 생성에 DN 및 HP의 효과를 나타낸 것으로, 1시간 동안 표시된 농도에서 DN 또는 HP와 함께 세포를 배양하고 그리고 나서 24시간 동안 500 ng/㎖ LPS와 함께 배양하였다. (A, C) 웨스턴 블럿 분석으로 LPS-유도 iNOS 발현을 측정하였다. (B, D) Griess 반응에 의하여 NO 방출을 측정하였다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균이다 (*p < 0.05 vs. DMSO; +p < 0.05 vs. LPS).
도 3은 COX-2 및 PGE2 생성에 DN 및 HP의 효과를 나타낸 것으로, 1시간 동안 표시된 농도에서 DN 또는 HP로 세포를 선처리하고 그리고 나서 24시간 동안 500 ng/㎖ LPS와 함께 배양하였다. (A, C) 웨스턴 블럿 분석으로 LPS-유도 COX-2 발현을 측정하였다. (B, D) ELISA에 의하여 PGE2 방출을 측정하였다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균이다 (*p < 0.05 vs. DMSO; +p < 0.05 vs. LPS).
도 4는 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 생성에 DN 및 HP의 효과를 나타낸 것으로, 1시간 동안 표시된 농도에서 DN 또는 HP로 세포를 선처리하고 그리고 나서 24시간 동안 500 ng/㎖ LPS와 함께 배양하였다. 상층액내의 사이토카인의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 상세한 설명은 실시예에 기재하였다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균이다 (*p < 0.05 vs. DMSO; +p < 0.05 vs. LPS).
도 5는 MAPKs의 활성화에 DN 및 HP의 효과를 나타낸 것으로, 1시간 동안 DN 또는 HP로 세포를 선처리하고, 그리고 나서 표시된 시간 동안 500 ng/㎖ LPS와 함께 배양하였다. 상세한 설명은 실시예에 기재하였다. 3번의 분리된 실험의 대표적 웨스턴 블럿을 기재하였다.
도 6은 Iκ-Bα 분해에 DN 및 HP의 효과를 나타낸 것으로, 1시간 동안 DN 또는 HP로 세포를 선처리하고, 그리고 나서 표시된 시간 동안 500 ng/㎖ LPS와 함께 배양하였다. 상세한 설명은 실시예에 기재하였다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균이다.
도 7은 본 발명의 (A) DN 및 (B) HP의 구조를 나타낸 화학식이다.

이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 더욱 구체적으로 제시하여 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 이하의 실시예는 이 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명이 충분히 이해되도록 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 상기와 같은 실시예들에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 1> 통계 분석

모든 데이터는 독립된 실험의 평균 ± 표준편차로서 표시하였다. 2 그룹 사이 또는 3 그룹 이상 사이의 결과의 통계적 유의성을 분석하기 위하여 이원분산분석(Two-way ANOVA)을 사용하였다. 모든 통계 분석은 SPSS, 버전 10.0 통계분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

< 참조예 2> 화합물 및 시약

RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute culture medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 마우스 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 탐지를 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay) 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. 대장균 055:B5로부터의 LPS는 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 전체 및 인-특이적 MAPKs (p38; 세포외 신호-조절 카이나제 1/2 [ERK 1/2]; c-Jun NH2-말단 단백질 카이나제 [JNK])에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. Iκ-Bα(Inhibitory kappa-Bα) 단일클론 항체 및 퍼옥시다제-연결 2차항체(peroxidase-conjugated secondary antibody)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 미리 염색된 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis) 마커는 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)로부터 구입하였다. TRIzol 시약 및 PCR(polymerase chain reaction) 키트는 Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다.

< 참조예 3> 도구

JEOL Eclipse-500 MHz 스펙트로미터(500 MHz for 1 h)를 사용하여 핵자기공명 스펙트럼을 기록하였고, 테트라메틸실란을 기준으로 화학적 이동(chemical shift)을 측정하였다. 실리카겔 60-프리코팅된(precoated) 플레이트 (70-30 mesh, Merck) 및 YMC 겔(YMC Co. Ltd., Japan)-코팅된 플레이트에서 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 경박 크로마토그래피 (TLC), 실리카겔 F254 (0.2 ㎜, Merck) 및 RP-18 F254s 플레이트 (0.2 ㎜, Merck)를 사용하였다. UV 광 아래서 또는 10% 황산 용액으로 스프레이후에 가열 이후에 스팟을 탐지하였다.

< 실시예 1> 추출 및 분리

NJ는 열수로부터 추출되었다. NJ 추출물 (15 g)을 증류수에 녹이고 에틸아세테이트(EtOAc) 분획한 후에 n-부탄올로 분획하였다. 용출액으로 n-헥산/EtOAc (4:1~1:2)를 사용한 실리카겔 컬럼 (6.5 X 60 ㎝)으로 6개의 분획(Fr. 1~6)을 얻었고, 그 결과 EtOAc-용해 분획(2.2 g)을 분리하였다.

MeOH/H₂O (1:1)를 사용한 역상(YMC Gel ODS-A, S-75 ㎛) 컬럼 (3 X 25 ㎝)에서 추가적인 4개의 분획(Fr. 2-1~2-4)을 얻었고, 그 결과 분획 2 (468.7 ㎎)를 분리하였다. 용출액으로 디클로로메탄/MeOH (30:1)을 사용한 중압(medium pressure) 액체 크로마토크래피(MPLC) (컬럼: SI-40 A, 11 ㎜ X 300 ㎜)를 사용하여 분획 2-2 (137.7 ㎎)를 정제하였고 그 결과 DN (43.7 ㎎)를 생성하였다 (도 7의 A). 스펙트럼 데이터는 문헌에 보고된 것과 동일하였다 (Itokawa et al., 1993). 5개의 분획(Fr. 5-1~5-5)을 얻었고, 그 결과 분획 5(201.9 ㎎)를 정제하였다. 용출액으로 MeOH/H₂O (1:2)를 사용한 MPLC를 사용하여 분획 5-2 (41.3 ㎎) 및 5-3 (24.9 ㎎)을 얻었고, 그 결과, HP (27.4 ㎎)를 생산하였다(도 7의 B). 스펙트럼 데이터는 문헌에 보고된 것과 동일하였다.

< 실시예 2> 복막 대식세포 배양

모든 실험은 원광대 동물관리위원회의 허가에 따른 프로토콜에 따라 수행되었다. 15-20 g의 체중의 6 내지 8 주령의 암컷 C57BL/6생쥐를 Orient Bio (Sungnam, KyungKiDo, South Korea)으로부터 구입하였다. 모든 동물은 23 ± 2℃의 외기 온도와 7일 동안 12시간 명암 사이클을 갖는 기후-조절되는 방내의 표준 구두박스형 케이지에서 양육되고 거주되었다. 3 ㎖ TG를 복강내 주입 4일 이후에 TG(Thioglycollate)-유도 복막 대식세포를 수확하였다. 10% 가열-비활성 FBS가 보충된 RPMI 배지 8 ㎖를 사용하여 복막관류를 수행하였다. 3시간 동안 배양 이후에, 부착되지 않은 복막 세포를 제거하고, 상기 배지가 부착된 세포로 교체하였다.

< 실시예 3> MTT 분석

세포 활성화를 이전에 보고된 바 (Bae GS, Seo SW, Kim MS, et al. 2011. J Nat Med 65: 6372) 에 따라 측정하였다.

< 실시예 4> NO 농도의 측정

대식세포(2 X 10⁵ cells/well)를 1시간 동안 DN 및 HP로 미리 처리하였고, 그리고 나서 24시간 동안 LPS (500 ng/mL)로 자극시켰다. NO 농도를 측정하기 위하여, 조정배지로부터 100 ㎕ 분획을 분리하였고 10분 동안 실온에서 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% phosphoric acid)의 동일한 양으로 배양시켰다. 그리고 나서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 5> PGE2 분석

제조자에 프로토콜(Stressgen Biotechnologies, MI, USA) 에 따라 면역측정 키트를 사용하여 PGE2 수준을 측정하였다.

< 실시예 6> 웨스턴 블럿 분석

대식세포(5 X 10⁶ cells/well)를 1시간 동안 DN 및 HP로 미리 처리하였고, 그리고 나서 LPS (500 ng/mL)로 자극시켰다. 동일한 완충액 (62.5 mM Tris-HCl [pH 6.8], 2% SDS(sodium dodecyl sulfate), 20% 글리세롤 및 10% 2-머캅토에탄올)에서 대식세포를 끓여서 전체 세포 용해물을 제조하였다. 세포 용해물내 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이동시켰다. 실온에서 2시간 동안 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS에서 5% 탈지우유로 상기 막을 차단시키고 하룻밤 동안 iNOS, COX-2, 인산화된 p38, 인산화된 ERK1/2, 인산화된 JNK, 및 Iκ-Bα에 대한 항체와 함께 배양시켰다. PBST에서 3번 세척한 후에, 각 블럿을 1시간 동안 상응하는 2차 항체와 함께 배양하고, 제조자의 권유 프로토콜에 따라 증진된 화학루미네센스 탐지 시스템(Amersham, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 상기 항체-특이적 단백질을 시각화시켰다.

< 실시예 6> ELISA 분석

대식세포(1 X 10⁶ cells/well)를 1시간 동안 DN 및 HP로 미리 처리하였고, 그리고 나서 24시간 동안 LPS (500 ng/mL)로 자극시켰다. 배양 상등액을 수집하고 사용전까지 -70℃에 보관하였다. IL-1β, IL-6, 및 TNF-α에 대한 ELISA를 중복하여 수행하였다; PBS (pH 7.4)내 항-생쥐 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α 단일클론 항체의 100-㎕ 용액으로 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 플레이트를 코팅하였다. 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS로 상기 플레이트를 세척하고 2시간 동안 10% FBS를 함유한 PBS로 상기 플레이트를 차단하였다. 추가적인 세척이후에, 2시간 동안 실온(RT)에서 기준 및 시료를 첨가하고 배양하였다. 상기 웰을 세척하고 1시간 동안 RT에서 바이오티닐화된 항-생쥐 IL-1β, IL-6, 또는 TNF-α를 첨가하고 배양하였다. 상기 웰을 세척하고, 아비딘-퍼옥시다제(avidin-peroxidase)를 첨가하고, RT에서 30분 동안 RT에서 배양한 후에 반복하여 세척하고 TMB 기질을 첨가하였다. 자동화 마이크로플레이트 ELISA 기록기를 사용에서 450 nm에서 칼라 변화를 측정하였다. 재조합된 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 연속적인 희석을 사용하여 각 측정 플레이트에서 표준 시료를 수행하였다.

<결과 1> 쥐의 복막 대식세포내 세포독성에 대한 DN 및 HP 의 효과

세포 활성화에 DN 및 HP의 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 쥐의 복막 대식세포에 MTT 분석을 수행하였다. 세포는 표시된 투여량에서 24시간 동안 DN 및 HP와 함께 배양되었다 (도 1). DN 및 HP는 각각 500 nM and 1,000 nM 보다 더 큰 수준에서 세포 활성화 세포독성에 영향을 미쳤다 (*p < 0.001) (도 1). 그러므로, 본 발명자들은 DN에 대해서는 50~500 nM 그리고 HP에 대해서는 100~1000 nM의 농도범위를 사용하였다.

<결과 2> LPS -유도 iNOS 및 NO 생성에 DN 및 HP 의 효과

본 발명자들은 LPS 자극된 대식세포에 iNOS 및 NO의 발현에 DN 및 HP의 효과를 조사하였다. DN 또는 HP의 선처리는 투여량-의존 경향으로 LPS-유도 iNOS 발현을 억제하였다(도 2A 및 2C). iNOS 결과와 일치하게, DN 또는 HP의 선처리는 또한, 투여량-의존 경향으로 LPS-유도 NO 생성을 억제하였다(도 2B 및 2D).

<결과 3> LPS -유도 COX -2 및 PGE2 생성에 DN 및 HP 의 효과

1시간 동안, DN 또는 HP의 표시된 농도로 대식세포를 선처리하였고 그리고 나서 24시간 동안 500 ng/mL의 LPS로 자극하였다. DN 또는 HP의 선처리는 COX-2 수준에서 LPS 유도 상향조절을 감소시켰다(도 3A 및 3C). PGE2가 COX-2 활성화의 결과이므로, 본 발명자들은 복막 대식세포에 PGE2 생성을 측정하였다. COX-2 결과와 유사하게, DN 또는 HP의 선처리는 투여량-의존 경향으로 LPS-유도 PGE2 생성을 억제하였다(도 3B 및 3D).

<결과 4> L-1β, IL -6, 및 TNF -α 생성의 LPS -유도 상승조절에 DN 및 HP 의 효과

LPS에 의해 유도된 염증 반응에 DN 및 HP의 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 염증반응 촉진 사이토카인 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α의 생성을 분석하였다. DN의 선처리는 투여량-의존 경향으로 LPS-유도 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α 생성을 억제하였다 (도 4A). HP의 선처리는 또한 투여량-의존 경향으로 IL-6 및 TNF-α 의 LPS-유도 상승조절을 억제하였지만, IL-1β의 생성을 억제하지는 않았다 (도 4B).

<결과 5> MAPKs 의 활성화에 DN 및 HP 의 효과

염증 매개체에 DN 및 HP의 억제 기전을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 MAPK 경로를 조사하였다. 1시간 동안 DN 또는 HP로 세포를 처리하고, 그리고 나서 표시된 시간 동안 LPS로 자극하였다 (도 5). 그러나, DN 및 HP 선처리는 p38의 인산화를 억제하였지만, ERK 및 JNK의 인산화를 억제하지는 못했다 (도 5A 및 5B).

<결과 6> NF -κB의 활성화에 DN 및 HP 의 효과

NF-κB의 활성화에 DN 및 HP의 선처리 효과를 측정하기 위하여, 1시간 동안 DN 또는 HP로 세포를 처리하고, 그리고 나서 표시된 시간 동안 LPS로 자극하였다 (도 6). 본 발명자들은 Iκ-Bα의 분해를 측정함에 의하여 NF-κB 활성을 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, LPS 처리는 Iκ-Bα 분해를 통하여 NF-κB 활성화를 가져왔다. DN 또는 HP의 선처리는 Iκ-Bα 분해의 억제의 결여에 의해 나타낸 바와 같이, NF-κB 수준에 전혀 효과를 갖지 못한다 (도 6A 및 6B).

<기타 제조예 > DN 및 HP 를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품의 제조

본 발명자들은 상기 실시예를 통해 DN 및 HP 성분이 항-염증 활성이 뛰어남을 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 하기와 같이 제조하였다.

<음료의 제조>

꿀 522 ㎎, 치옥토산아미드 5 ㎎, 니코틴산아미드 10 ㎎, 염산리보플라빈나트륨 3 ㎎, 염산피리독신 2 ㎎, 이노시톨 30 ㎎, 오르트산 50 ㎎, DN 및 HP (1:1 중량비) 0.48 ~ 1.28 ㎎, 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<츄잉껌의 제조>

껌베이스 20 %, 설탕 76.36 ~ 76.76 %, DN 및 HP (1:1 중량비) 0.24 ~ 0.64 %, 후르츠향 1 %, 물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

<캔디의 제조>

설탕 50 ~ 60 %, 물엿 39.26 ~ 49.66 %, DN 및 HP (1:1 중량비) 0.24 ~ 0.64 %, 오렌지향 0.1 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

<아이스크림의 제조>

유지방 10.0 %, 무지유고형분 10.8 %, 설탕 12.0 %, 물엿 3.0 %, 유화안정제(스팬, span) 0.5 %, 향료(스트로베리)0.15 %, 물 63.31 ~ 62.91 %, DN 및 HP (1:1 중량비) 0.24 ~ 0.64 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.

< 쵸코렛의 제조>

*설탕 34.36 ~ 34.76 %, 코코아 버터 34 %, 코코아 매스 15 %, 코코아 파우다 15 %, 레시틴 0.5 %, 바닐라향 0.5 %, DN 및 HP (1:1 중량비) 0.24 ~ 0.64 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 초코렛을 제조하였다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (4)

1. 하기 화학식 2의 8α-하이드록시피노레시놀(hydroxypinoresinol; HP)을 유효성분으로 함유하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   

   

   
   <화학식 2>
2. 제 1항에 있어서,
   상기 8α-하이드록시피노레시놀(hydroxypinoresinol; HP)는 감송향으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 유효성분은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
4. 제 1항의 8α-하이드록시피노레시놀(hydroxypinoresinol; HP)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물.

Images