KR20110104237A - 감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감송향 (Nardostachys jatamansi; NJ)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 내독소 쇼크(endotoxin shock)를 효과적으로 억제하므로 패혈증의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Composition for preventing and treating sepsis comprising Nardostachys jatamansi extract as an active ingredient}

본 발명은 감송향의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

감송향(Nardostachys jatamansi(NJ))은 아시아 여러 국가들에서 간질, 히스테리, 심계 항진(palpitations), 및 경련 치료제로서 뿐만 아니라 강장제(bitter tonic), 흥분제, 및 항-경련제로 널리 사용된다[1]. Jatamansic acid, jatamansone, lignans 및 neolignans 과 같은 다양한 sesquiterpene 들은 식물의 뿌리에 존재한다[2,3]. NJ의 알콜추출물은 쥐에서 티아세트아마이드(thiacetamide)-유도성 간 손상을 예방한다[1]. 본 발명자들은 이전 연구에서 NJ 추출물이 세룰레인(cerulein)-유도성 급성 췌장염을 감소시킨다는 것을 보였다[4]. 하지만, NJ가 LPS (lipopolysacchride)-유도성 내독소 쇼크(endotoxin shock)에 미치는 효과는 아직 연구된 바 없다.

패혈 쇼크(septic shock)는 전세계적으로 300,000명 이상의 환자들에게 영향을 미치며, 항생제 치료 및 집중적인 관리 지원에도 불구하고 높은 사망률(60%)을 보인다[5,6]. 패혈증의 병인은 세균 감염에 의한 전신 감염 반응(systemic inflammatory response)의 진전 및 동적 확장과 관련된다[7]. 그람-음성(gram-negative) 세균의 외막(outer membrane)의 구성성분 중 하나인 LPS는 국부적 염증(local inflammation), 항체 생산, 및 패혈 쇼크와 같은 심각한 감염에 대해 다양한 반응을 일으킨다[8]. TNF (tumor necrosis factor)-α, IL (interleukin)-1, NO (nitric oxide), 및 IFN (interferon)과 같은 염증 매개인자는 내독소 쇼크를 일으킬 수 있다.

LPS 는 CD14 및 톨(toll)-유사 수용체들과 같은 포유동물의 세포막 분자들에 결합한다[9,10]. LPS 의 TLR-4 와의 상호작용은 IL-1, IL-6, TNF-α, 및 IFNs을 포함한 사이토카인(cytokines)의 생성을 유발한다[11]. TLR 신호전달은 두 가지 경로를 거쳐 일어날 수 있다. 한 가지 경로는 MyD88 (myeloid differentiation factor 88)에 의존적이며, 이것은 MAPKs (mitogen-activated protein kinases) 및 NF-kB (nuclear factor kappa B)의 활성을 유발한다. 이러한 MyD88-의존적 경로는 IL-1, IL-6 및 TNF-α의 생성에 결정적이다. 또 다른 경로는 MyD88-독립적 경로이며, 이것은 IFN 조절 인자를 통해 타입-1 IFN (IFN-α/β)을 유도한다[12].

이에 본 발명자들은 패혈증의 예방 및 치료에 효과가 있는 물질을 탐색하던 중 감송향 추출물이 LPS (lipopolysacchride)에 의해서 유발되는 내독소 쇼크를 효과적으로 억제하고, 항-염증효과가 있음을 확인하여 패혈증의 예방 및 치료용 약학 조성물로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 감송향의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 감송향 추출물은 감송향의 뿌리를 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 유기용매로는 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.

구체적으로, 감송향 뿌리 건조물 또는 분말에 1 내지 20 배, 바람직하게는 5 내지 15 배, 더욱 바람직하게는 10 배의 물을 첨가하고 80 내지 150℃, 바람직하게는 90 내지 100℃의 온도에서 1 내지 24시간, 바람직하게는 2 내지 6시간, 더욱 바람직하게는 2시간 동안 추출한 후 여과하여 감송향 뿌리의 열수 추출물을 제조할 수 있다. 감송향 뿌리의 유기용매 추출물은 감송향 뿌리 건조물 또는 분말에 1 내지 5 배, 바람직하게는 3 배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 추출한 후 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 동결 건조 또는 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약리효과를 증진시키기 위해 약학적으로 허용가능한 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 추출방법에 따라 생약재의 추출물을 제조한 후 약학 조성물에 가하거나 감송향 뿌리와 생약재를 혼합한 후 상기 방법으로 추출하여 얻어진 추출물을 조성물에 포함시킬 수도 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

본 발명의 조성물에 추가될 수 있는 생약재는 약학적으로 허용되는 임의의 생약재일 수 있으며, 예를 들면, 고본 (Angelicae tenuissimae Radix), 천마 (Gastrodiae Rhizoma), 시호 (Bapleuri Radix), 당귀 (Angelicae gigantis Radix), 도인 (Persicae Semen), 계지 (Cinnamomi Ramulus), 대황 (Rhei Rhizoma), 감초 (Glycyrrhizae Radix), 천궁 (Cnidii Rhizoma), 진피 (Aurantii nobilis Pericarpium), 택사 (Alismatis Rhizoma), 황련 (Coptidis Rhizoma), 황금 (Scutellariae Radix), 복령 (Hoelen), 작약 (Paeoniae Radix), 백출 (Atractylodis Rhizoma alba), 황백 (Phellodendri Cortex), 치자 (Gardeniae Fructus), 반하 (Pinelliae Tuber), 조구등 (Uncaria Ramuluset Uncus), 지실 (Ponciri Fructus), 인삼 (Gingseng), 맥문동 (Liriopis Tuber), 원지 (Polygalae Radix), 석창포 (Acori graminei Rhizoma), 창출 (Atractylodis Rhizoma alba), 감국 (Chrysanthemi Flos), 방풍 (Ledebouriellae Radix), 생강 (Zingiberis Rhizoma crudus), 망초 (Natrii sulfas), 대조 (Zizyphi Fructus), 단삼 (Salviae Radix), 목단피 (Mautan Radicis Cortex), 지황 (Rehmanniae Radix), 박하 (Menthae Herba), 산약 (Dioscoreae Rhizoma), 저령 (Polyporus), 하수오 (Polygonimultiflori Radix), 구자 (Allii tuberosi Semen), 결명자 (Cassiae Semen), 구기자 (Lycii Fructus), 독 활 (Araliae cordatae Radix), 두충 (Eucommiae Cortex), 백화사설초 (Hedyotis Herba), 삼백초 (Saururus Herba), 인진 (Artemisiaecapillaris Herba), 지모 (Anemarrhenae Rhizoma), 홍화 (Carthami Flos), 황기 (Astragali Radix), 석송자 (Lycopodium), 은행잎 (Ginkgonis Folium), 황정 (Polygonati Rhizoma), 연자육 (Nelumbinis Semen), 용골 (Fossilia ossis Mastodi), 지골피 (Lycii radicis Cortex), 우슬 (Achyranthis Radix), 숙지황 (Rehmanniae Radix preparata), 흑임자 (Perillae Semen), 백자인 (Thujae Semen), 맥아 (Hordei Fructus germinatus), 토사자 (Cuscutae Semen), 파극천 (Morindae Radix), 해송 (Pini koraiensis Radix) 등을 단독으로 또는 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 패혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 활성성분인 감송 추출물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 감송향의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 100 ㎍ 내지 5 ㎎, 가장 바람직하게는 500 ㎍ 내지 1 ㎎일 수 있다. 그러나, 상기 감송향 추출물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 감송향을 패혈증의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

아울러, 본 발명에 따른 감송향 추출물은 패혈증을 예방 및 개선하기 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 감송향 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 감송향 추출물과 패혈증의 예방 및 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 감송향 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 감송향을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

참고로, 본 발명에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

따라서, 본 발명은 감송향의 신규한 용도로서, 감송향 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 감송향 추출물을 포함하는 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 패혈증을 효과적으로 억제하므로 패혈증의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 NJ 가 LPS-유도성 내독소 쇼크 및 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 보여준다. 내독소 쇼크는 본 발명의 일실시예에 따라 6-8-주령 암컷 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. (A) 전처리 NJ가 내독소 쇼크 마우스(그룹당 n=10)의 생존율에 미치는 영향을 120시간의 생존 동안 모니터하였다. NJ 가 생체 내 LPS-유도성 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, LPS (37.5 mg/kg) 치사량 주입 1시간 전에 1, 5, 또는 10 mg/kg의 NJ 를 마우스에(그룹당 n=6) 경구투여하였다. (B) TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 검출을 위해 혈청 샘플들을 37.5 mg/kg 의 LPS 투입 3시간 후에 마우스로부터 얻었다. (C) TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 mRNA 수준 측정을 위해 37.5 mg/kg LPS 투입 3시간 후에 마우스로부터 간 샘플들을 채취하였다. 적어도 3번의 독립적인 실험들의 대표적인 막대그래프를 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다. *, P < 0.05 vs. 식염수 처리; †, P < 0.05 vs. LPS 처리 단독.
도 2는 쥐 복막 마크로파지에서 NJ가 염증성 사이토카인들의 생성에 미치는 영향을 보여준다. 복막 마크로파지들을 1, 10, 또는 50 mg/ml 의 NJ 로 60분간 전처리한 후, 500 ng/ml 의 LPS로 24시간 동안 자극시켰다. (A) 쥐 마크로파지에서 NJ 의 세포독성을 MTT 어세이(assay)로 측정하였다. (B) ELISA로 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 를 검출하기 위해 배양상층액을 모았다. (C) LPS-의존적 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 전사의 동역학을 실시간(real time) RT-PCR로 조사하였다. NJ 가 (D) MAPKs 및 (E) Iκ-Bα 에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 세포들을 50 mg/ml 의 NJ로 60분간 전처리하고, 500 ng/ml 의 LPS 로 표시된 시간 지점들에서 자극시켰다. 적어도 3번의 독립적인 실험들의 대표적인 데이터를 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다. *, P < 0.05 vs. 식염수 처리; †, P < 0.05 vs. LPS 처리 단독.
도 3은 쥐의 간에서 NJ 가 타입 1 IFN 생성에 미치는 영향을 나타낸다. NJ 가 생체 내 LPS-유도성 IFN-α/β 생성에 미치는 효과를 조사하기 위하여, LPS (37.5 mg/kg) 치사량 주입 1시간 전에 1, 5, 또는 10 mg/kg의 NJ 를 마우스에 경구투여하였다(그룹당 n=6). 37.5 mg/kg LPS 투입 3시간 후에 마우스로부터 간 샘플들을 채취하였다. (A) IFN-α/β 및 (B) IRF-1 및 -7 의 mRNA 수준을 실시간(real time) RT-PCR로 측정하였다. 적어도 3번의 독립적인 실험들의 대표적인 막대그래프를 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다. *, P < 0.05 vs. 식염수 처리; †, P < 0.05 vs. LPS 처리 단독.
도 4는 쥐 복막 마크로파지에서 NJ 가 IFN-α/β 생성에 미치는 영향을 나타낸다. 복막 마크로파지들은 1, 10, 또는 50 mg/ml 의 NJ 로 60분간 전처리한 후, 500 ng/ml 의 LPS 로 6시간 동안 자극시켰다. (A) IFN-α/β 및 (B) IRF-1 및 -7 의 mRNA 수준을 실시간 RT-PCR로 측정하였다. NJ 가 (C) STAT-1 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상기 세포들을 50 mg/ml 의 NJ로 60분간 전처리한 후, 500 ng/ml 의 LPS로 지정된 시간 지점들에서 자극하였다. 적어도 3번의 독립적인 실험들의 대표적인 데이터를 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다. *, P < 0.05 vs. 식염수 처리; †, P < 0.05 vs. LPS 처리 단독.
도 5는 NJ가 LPS-유도성 내독소 쇼크(endotoxin shock) 및 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine) 생성에 미치는 치료효과를 나타낸다. 내독소 쇼크는 본 발명의 실시예에 따라 68-주령 암컷 C57BL/6 마우스에서 유도하였다. (A) 후처리한 NJ 가 LPS-유도성 내독소 쇼크(그룹당 n=10)에 미치는 영향을 120시간 동안의 생존 동안 모니터하였다. NJ 가 생체 내 LPS-유도성 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, LPS (37.5 mg/kg) 치사량 주입 1시간 후에 1, 5, 또는 10 mg/kg의 NJ 를 마우스에 경구투여하였다(그룹당 n=6). (B) TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 검출을 위해 37.5 mg/kg 의 LPS 투여 3시간 후에 마우스로부터 혈청 샘플들을 얻었다. (C) TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 mRNA 수준을 측정하기 위해 37.5 mg/kg LPS 투여 3시간 후에 마우스로부터 간 샘플들을 채취하였다. 적어도 3번의 독립적인 실험들의 대표적인 막대그래프를 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다. *, P < 0.05 vs. 식염수 처리; †, P < 0.05 vs. LPS 처리 단독.
도 6 은 마우스 간에서 NJ가 타입1 IFN 생성에 미치는 치료 효과를 보여준다. 후-처리된 NJ 가 생체 내 LPS-유도성 IFN-α/β 생성에 미치는 효과를 알아보기 위하여, LPS (37.5 mg/kg) 치사량 주입 1시간 후에 1, 5, 또는 10 mg/kg의 NJ 를 마우스에 경구투여하였다(그룹당 n=6). 37.5 mg/kg LPS 투여 3시간 후에 마우스로부터 간 샘플들을 채취하였다. (A) IFN-α/β 및 (B) IRF-1 및 -7의 mRNA 수준을 실시간 RT-PCR로 측정하였다. 적어도 3번의 독립적인 실험들의 대표적인 막대그래프를 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다. *, P < 0.05 vs. 식염수 처리; †, P < 0.05 vs. LPS 처리 단독.
도 7은 NJ의 HPLC 크로마토그램이다. 증류수에 녹여 NJ 표준용액을 준비하였다(10 mg/100 ml). 상기 주사 부피는 10 ㎕ 였고, 검출은 254 nm에서 이루어졌다.

NJ의 뿌리줄기는 예로부터 소화장애 등의 치료를 위한 약초로 사용되었다. 또한, 파킨슨 병, 간 손상, 신경 손상, 급성 췌장염에 대한 NJ의 약물예방적 효과(pharmacologic protective action)가 보고되어져왔다[4,20]. 본 발명은 LPS-유도성 내독소 쇼크에 대한 NJ의 예방효과에 관한 것이다. 본 발명자들은 쥐 모델 및 마크로파지에서 NJ의 전처리가 내독소 쇼크 및 염증 반응을 억제시킨다는 것을 생존율의 증가 및 TNF-α, IL-1, IL-6, 및 IFN-α/β 와 같은 염증 매개자의 억제로 보여주었다. 또한, 본 발명자들은 NJ의 후처리가, 특히 10 mg/kg 의 투여량에서, LPS 투여에 대한 생존율을 증가시킨다는 것을 보여주었다(도 5A). 이러한 결과들은 NJ 가 염증 매개자의 억제를 통해 내독소 쇼크를 억제할 수 있다는 것을 암시한다.

최근의 연구들은 LPS-TLR4 신호전달 경로가 염증 반응 및 특정 질병의 발달에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 특히 패혈증에서, 많은 연구들은 LPS-TLR4 신호전달 경로의 면역 조절 능력을 보고하였다. 예를 들어, 패혈증에서 중요한 역할을 하는 염증 매개자들은 TNF-α, IL-1, IL-6, 및 IFN-α/β 이다. 패혈증 모델에서 TNF-α 혈청 수준은 나노몰 농도 단위에 이른다; 구체적으로, 재조합 TNF-α 의 동물로의 투여는 치사성 내독소혈증(lethal endotoxemia)에서 발생하는 것과 유사한 순환 허탈(circulatory collapse) 및 치명적인 기관 손상을 유도한다[21,22]. IL-1β 및 IL-6 역시 LPS 자극 이후 높게 발현된다. IL-6 생성 또는 턴오버(turnover)의 조절이상(dysregulation)은 사이토카인의 만성적 상승 및 많은 병리학적 결과들을 야기시킬 수 있다[23]. 본 발명자들의 이전 연구와 일치하게[4], NJ 처리는 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6와 같은 염증매개자들의 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 생성을 억제하였다(도 1, 2 및 5). IFN-β-결핍 마우스는 LPS에 대해 저항성을 보인다[18]. 또한 본 발명자들은 NJ 가 생체내 및 시험관내 LPS-유도성 IFN-α/β 생성을 억제한다는 것을 보였다(도 3A 및 4A). 상기 결과들은 NJ 가 LPS-유도성 내독소 쇼크(endotoxin shock)에 미치는 저해 효과가 염증매개자들의 감소와 관련될 수 있다는 것을 보여준다.

패혈증에서, LPS를 가진 세포의 도입은 NF-κB 및 MAPKs 의 활성을 유도하는 연쇄반응(cascade)을 자극한다[24-27]. NF-κB는 많은 염증매개자들의 발현을 조절하는 중요한 조절인자로 인식되어져 왔다[28]. 본 발명에서, LPS 는 복막내 마크로파지들에서 Iκ-Bα를 분해하였다. 하지만, NJ는 LPS-유도성 Iκ-Bα 분해를 저해하지 못했다(도 2E). 본 발명의 실시예의 결과들은 NJ 가 TNF-α, IL-1, 및 IL-6 생성에 미치는 억제효과가 NF-κB 활성과는 무관할 수 있다는 것을 암시한다. LPS-유도성 MAPKs 활성의 저해는 신규한 패혈증 치료제의 개발을 위한 표적으로 각광받았다[29]. 본 발명자들의 이전 연구는 NJ가 선방(acinus) 세포에서 MAPKs의 활성을 억제한다는 것을 보여주었다[4]. 상기 결과와 일치하여, NJ 는 복막 마크로파지들에서도 LPS-유도성 MAPKs 활성(p38, ERK ½, 및 JNK)을 저해하였다(도 2D). 이러한 결과들은 NJ가, NF-kB 활성이 아니라, MAPKs의 억제를 통해 TNF-α, IL-1, 및 IL-6의 생성을 저해한다는 것을 암시하며, 이것은 NJ가 LPS-MAPKs 신호전달 경로에 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다.

IFN-α/β 생성이 바이러스 침입에 대한 첫 번째 숙주 방어선이라는 것이 잘 알려져 있다. 추가로, 최근의 연구들은 TRIF-의존적 IFN-b 생성이 자가면역 질환의 조절 및 LPS 쇼크 반응의 조절에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 보고하였다[18,30]. IFN-α/β 유전자의 발현은 MyD88-의존적 방식으로 빠르게 유도되었고, STAT-1 표적 유전자의 발현을 야기시켰다[15]. IFN-α/β의 유도는 주로 IRFs에 의해 조절된다. 본 발명에서, NJ 처리는 LPS-유도성에 의한 IFN-α/β의 유도 및 IRF-1 및 -7 의 mRNA 발현수준을 억제하였다(도 3 및 6). 이러한 결과들은 NJ가 IRF-1 및 -7 의 유도를 저해함으로써 IFN-α/β의 생성을 억제할 수 있음을 보여준다. IFN의 그들의 수용체와의 상호작용은 세포질(cytoplasmic) STAT-1 단백질의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)를 일으키며, 이것은 핵으로의 이동 및 얼마간의 IFN-반응 유전자들의 전사를 야기한다. STAT-1 은 또한 내독소 쇼크의 발달에 기여한다[31]. NJ 는 LPS-처리 세포들에서 STAT-1 활성을 억제하였다(도 4C). 이러한 결과들은 NJ-처리 세포들에서 감소된 STAT-1 활성이 감소된 IFN-α/β 생성의 결과일 수 있다는 것을 보여준다.

상기의 점들을 고려할 때, 본 발명의 실시예들의 결과들은 NJ 가 LPS-유도성 내독소 쇼크(endotoxin shock)를 억제한다는 것을 보여준다. 상기 결과들은 NJ 가 LPS-유도성 내독소 쇼크에 미치는 영향이 MAPKs 활성의 억제를 통한 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 생성의 감소와 관련될 수 있다는 것을 보여준다. 또한, IRF-1 및 -7의 유도 억제에 의한 감소된 IFN-α/β 와도 관련될 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 NJ가 패혈증 및 자가면역 질환의 치료에 유용하며, 항염증제로서 유용할 수 있음을 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참조예> 통계 분석

하기 결과들은 독립적 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 표현하였다. 그룹들 사이의 결과들의 통계적 유의성을 분석하기 위하여 독립적인 t-test 또는 one-way ANOVA 를 사용하였고, 만약 통계적으로 유의하다면, 그룹들 사이의 다중비교(multiple comparison)로서 Duncan 법을 이용한 post hoc 분석을 수행하였다. 모든 통계적 분석은 SPSS, version 10.0 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. P<0.01 또는 P<0.05 를 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주하였다.

<실시예 1>

<1-1> 화합물 및 시약의 준비

Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 RPMI-1640, FBS (fetal bovine serum), 페니실린(penicillin), 및 스트렙토마이신(streptomycin)을 구입하였다. 마우스 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α 검출을 위한 ELISA (Enzyme-linked immunosorbant assay) 키트를 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. Escherichia coli 055:B5 의 LPS를 Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 티오글리콜레이트(Thioglycollate (TG))를 BD Pharmingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 총(total) 및 인산기-특이적(phospho-specific) MAPKs (extracellular signal-regulated kinase 1/2 [ERK ½]; c-Jun NH₂-terminal protein kinase [JNK]; p38), STAT(signal transducer and activator of transcription)-1, 및 인산기-특이적 STAT-1 들에 대한 항체를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Iκ-B (Inhibitory kappa-B)α 모노클로날(monoclonal) 항체들 및 퍼옥시다아제-연결 2차 항체들을 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 전-염색된(Pre-stained) SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 마커들을 Bio-Rad (Hercules, CA, USA)에서 입수하였다. 트리졸(TRIzol) 시약 및 PCR 반응 키트들을 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 유도성(Inducible) IL-6, TNF-α, IL-1β, 및 b-actin 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머들을 Genotech (Daejeon, Republic of Korea)에서 구입하였다. C57BL/6 마우스를 Orient Bio Co.(Sungnam, KyungKiDo, Republic of Korea)에서 구입하였다.

<1-2> 식물 재료의 준비

NJ 는 일반적인 구입처(Omni Herb, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 상기 약초에 대한 동정은 한국약물시험연구소(Korean drug test laboratory)에서 확인하였다. 확증 표본(voucher specimens)(NO; Oh/wh/nj-43)들을 원광대 한의학과 식물표본실에 기탁하였다. NJ 는 상기 약초의 건조시킨 처방제(prescription)를 끓인 증류수로 달여서 준비하였고, 약 2시간 정도 달였다. 상기 추출물을 -80℃에서 냉동시킨 후, 동결건조 분말을 만들었다. 상기 분말을 증류수로 추출하고, 여과시켰다. 상기 여과물을 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.

<1-3> 내독소 쇼크 동물 모델의 준비

68 주령 암컷 C57BL/6 마우스에 세균 내독소(E. coli serotype O55:B5의 LPS, 37.5 mg/kg)를 복강내 주사(intraperitoneal (i.p.) injection)하여 내독소 쇼크(endotoxin shock)를 유도하였다. 식염수(대조군) 또는 NJ (1 mg/kg, 5 mg/kg, 및 10 mg/kg)를 세 그룹의 마우스(그룹당 n=10)에 복강내 주사하였다. NJ 투여 1시간 후(예방효과(prophylactic effect)) 또는 전에(치료효과(therapeutic effect)), LPS 를 복강내 주사로 투여하였다. 생존율을 120시간 동안 모니터하였다. 실험동물의 사용 및 관련된 실험 절차들은 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH (National Institutes of Health) 가이드라인에 따라 수행하였으며, 실험들은 원광대학교 동물관리위원회의 승인 하에 이루어졌다.

<1-4> 혈액 및 간 샘플의 준비

NJ 추출물(1, 5, 및 10mg/kg)을 마우스에 경구투여하였다(그룹당 n=6). 혈청 및 간 샘플들은 LPS 투여 3시간 후에 각각의 마우스로부터 얻었으며, 사용시까지 -70℃에서 보관하였다.

<1-5> 복막내 마크로파지 배양

3 ml의 TG를 복강내 주사로 투여하고 4일 후에 TG-유발(elicited) 복막 마크로파지(macrophage)들을 채취하였다[13]. 10 U/ml 의 헤파린(heparin)을 함유하는 8 ml 의 HBSS (Hanks' balanced salt solution) 용액을 사용하여 복막 세척을 수행하였다. 6-웰(well) 조직 배양 플레이트(5 x 10⁶ 세포/웰)에서 상기 세포들을 10% 열-불활성(heat-inactivated) FBS가 첨가된 RPMI에 접종하였다. 3시간의 배양 후에, 비부착성(non-adherent) 세포들을 제거하고, NJ가 있거나 없는 조건에서 부착성 세포들에 LPS를 처리하였다.

<1-6> 웨스턴 블랏(Western blot)

복막 마크로파지(peritoneal macrophage)들(5 x 10⁶ 세포/웰)을 500 ng/ml 의 LPS로 자극시켰다. 샘플 버퍼(62.5 mM TrisHCl [pH 6.8], 2% sodium dodecyl sulfate, 20% glycerol, 및 10% 2-mercaptoethanol)에서 복막 마크로파지들을 끓여 총 세포 용해물(lysate)을 만들었다. 그 후 상기 세포 용해물 내의 단백질들을 10% SDS-PAGE로 분리시키고, 나이트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 그 후 실온에서 상기 막을 PBS-Tween-20에서 5% 스킴밀크(skim milk)로 2시간 동안 블록시키고(blocked), 인산화된(phosphorylated) ERK½, 인산화된 p38, 인산화된 JNK, 인산화된 STAT-1, 및 Iκ-Bα에 대한 항체들로 오버나잇으로 배양하였다. PBST에서 3번 세척한 후, 각각의 블랏을 2차 항체로 1시간 동안 배양하고, 생산자의 프로토콜에 따라 enhanced chemiluminesence detection system (Amersham, Piscataway, NJ, USA) 을 사용하여 항체-특이적 단백질들을 시각화하였다.

<1-7> ELISA

복막 마크로파지(peritoneal macrophage)를 500 ng/ml 의 LPS 및/또는 다양한 농도의 NJ 로 24시간 동안 자극시켰다. 상층 배양액을 모은 뒤 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 상용화된 시스템(R&D Systems)을 사용하여 생산자의 지시에 따라 상기 상층액의 사이토카인(cytokine) 수준을 측정하였다. ELISA는 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6에 특이적인 mAb 로 코팅된 96-웰(well) 플레이트로 고안하였다. 상기 코팅된 플레이트들을 0.05% Tween-20을 함유한 PBS로 세척하였다. 본 측정에 사용한 모든 시약들을 37℃로 2시간 동안 배양하였다. 재조합 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 를 희석하고 표준(standard)으로 사용하였다. 표준곡선(standard curve)을 만들기 위해 20 ng/ml에서 시작하여 단계적 희석(serial dilutions)을 수행하였다. 측정 플레이트들을 비오틴화(biotinylated) 마우스 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 아비딘 퍼옥시다아제(avidin peroxidase), 및 30% hydrogen peroxide를 포함하는 2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid] (ABTS)의 기질 용액에 연속적으로 노출시켰다. 상기 플레이트들을 405 nm에서 읽었다.

<1-8> RNA 정량

SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA)으로 정량적 실시간 RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR)을 수행하기 위해 수집한 세포들로부터 총(total) RNA를 추출하였다. 상기 RNA 분리 프로토콜은 DNase I 처리를 포함한다. 본 발명자들은 RNA를 정량하고, 올리고(oligo) (dT)12-8 프라이머 및 RT-PCR용 SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 20㎕의 RT 반응당 2㎍의 총 RNA로 cDNAs 를 역전사하였다. RT-PCR은 67.7 mM TrisHCl (pH 8.8), 16.6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20, dATP, dCTP, 및 dGTP 각각 200 nM, 400 nM dUTP, 4.5 mM MgCl₂, 각각의 프라이머 300 nM, 200 nM 프로브(probe), 2 U Taq DNA polymerase, 및 1/10 (부피) 의 cDNA 합성 용액을 포함하는 25㎕ 용액에서 수행하였다. 열 순환(thermal cycling) 조건은 다음과 같다: 95℃, 4분; 95℃, 15초 및 60℃, 1분의 40사이클. DNA 중합효소(polymerase)의 5' exonuclease 활성으로 인한 프로브 가수분해에 의해 생성된 형광을 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 측정하였다. 임계 사이클(threshold cycle (Ct)) 값을 sequence detection SDS 1.7 소프트웨어 (Applied Biosystems) 및 quencher에 대한 리포터 시그널의 표준화(normalization)로 측정하였다. 각각의 샘플들은 (Ct < 33에 대해) 0.5를 초과하지 않는 Ct 값들의 표준편차로 2반복(Ct < 32) 또는 3반복(Ct > 32)으로 증폭되었다. 표준 곡선을 만들어 상기 Ct 값들을 정량적 결과로 해석하였다. 따라서, cDNA 표준(standard)을 실험 샘플들과 같은 조건으로 준비하였다. 이것을 상기 실험 샘플들에서 예상된 표적 mRNA 양을 포함하는 Ct 값들의 범위를 커버하도록 연속적으로 희석하고, 관심 있는 유전자와 내생적 대조군(endogenous control)을 분석하였다. 선형회귀(y = mx + b)를 만들기 위해, 결과적인 Ct 값들을 초기 RNA 질량의 로그에 대해 그래프화하였다. 실험적 RNAs 의 양을 표준곡선으로부터 계산하였다(상관계수(correlation coefficient), R2 > 0.990). 관심 있는 유전자의 전사에서 n-배(fold) 로 주어지는, 상기 mRNA 수준을, 내생적 대조군 및 LPS 자극 전 야생형 발현에 대한 측정(calibration)으로 측정된 RNA 질량 값에 대한 표준화로 측정하였다. 선택적으로, mRNA 전사의 증폭(동적 범위)은 각각의 유전형(genotype)의 기초적 mRNA 발현에 대한 측정으로 계산하였다. IFN-α4 의 경우, 비-자극 샘플들은 기초적 발현을 보이지 않았다; 따라서, 야생형 세포들에서 전사 반응을 보인 첫 번째 지점을 임의로 calibrator 로 하였다.

<1-9> 프라이머 및 프로브

Primer Express 1.5 소프트웨어(software) (Applied Biosystems)를 사용하여 포워드(Forward) (f) 및 리버스(reverse) (r) 프라이머 (Invitrogen), TaqMan 프로브(probes) (MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany), 및 TaqMan minor groove binder (MGB) 프로브(Applied Biosystems)를 설계하였다. 다음 프라이머들을 사용하여 실시간(Real-time) PCR을 수행하였다:

<mHPRT>

전방향: TTG CTC GAG ATG TCA TGA AGG A (서열번호 1);

역방향: TGA GAG ATC ATC TCC ACC AAT AAC T (서열번호 2);

<mIRF-1>

전방향: CCG AAG ACC TTA TGA AGC TCT TTG (서열번호 3);

역방향: GCA AGT ATC CCT TGC CAT CG (서열번호 4);

<mIRF-7>

전방향: CTG GAG CCA TGG GTA TGC A (서열번호 5);

역방향: AAG CAC AAG CCG AGA CTG CT (서열번호 6);

<mIFN-α4>

전방향: CCT GTG TGA TGC AGG AAC C (서열번호 7);

역방향: TCA CCT CCC AGG CAC TGA (서열번호 8);

<mIFN-β>

전방향: ATG AGT GGT GGT TGC AGG C (서열번호 9);

역방향: TGA CCT TTC AAA TGC AGT AGA TTC A (서열번호 10);

<mTNF-α>

전방향: TCT CTT CAA GGG ACA AGG CTG (서열번호 11);

역방향: ATA GCA AAT CGG CTG ACG GT (서열번호 12);

<mIL-1-β>

전방향: FAM-TTG ACG GAC CCC AAA AGA T-TAMRA (서열번호 13)

역방향: FAM-GAA GCT GGA TGC TCT CAT CTG-TAMRA (서열번호 14)

<mIL-6>

전방향: FAM-TTC ATT CTC TTT GCT CTT GAA TTA GA-TAMRA (서열번호 15) 및

역방향: FAM-GTC TGA CCT TTA GCT TCA AAT CCT-TAMRA (서열번호 16).

TaqMan 프로브들은 5' 말단에 리포터 다이(reporter dye), 6-carboxyfluorescein (FAM)로 표지된 올리고뉴클레오티드, 및 3' 말단에 quencher dye, 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)로 표지된 올리고뉴클레오티드로 구성되었다. TaqMan MGB 프로브 구성에서, spectral performance를 향상시키기 위하여 비-형광성 (non-fluorescent) quencher (NFQ)를 사용하였다. 상기 프로브 서열들은 다음과 같다:

<mHPRT>

FAM-TGG GAG GCC ATC ACA TTG TGG CTA MRA (서열번호 17);

<mIRF-1>

FAM-CAG TCT GAG TGG CAG CGG ACA CAC A-TAMRA (서열번호 18);

<mIRF-7>

FAM-CTG GAG GGC GTG CAG CGT GA-TAMRA (서열번호 19);

<mIFN-α4>

FAM-AGA CTC CCT GCT GGC TGT GAG GAC A-MGB-NFQ (서열번호 20);

<mIFN-β>

FAM-AAG CAT CAG AGG CGG ACT CTG GGA-TAMRA (서열번호 21);

<mTNF-α>

FAM-CCC GAC TAC GTG CTC CTC ACC CA-TAMRA (서열번호 22);

범용 프로브(universal probe) (mIL-1β, M15131.1 Roche Applied Science); 및

범용 프로브 (mIL-6, M20572.1; Roche Applied Science).

<1-10> 생화학적 분석

NJ 를 5일마다 마우스에 경구투여하였다(그룹당 n=6). 5,000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 혈청 샘플들을 분리하였다. 신선한 혈청을 사용하여 총 bilirubin, urine Na, albumin, creatine, glutamic oxaloacetic transaminase, glutamic pyruvic transaminase, alkaline phosphatase, 및 총 bilirubin 을 측정하였다. 측정을 위해 생화학적 키트(Span Diagnostics, Surat, France)를 사용하였다.

<1-11> MTT 어세이(assay)

테트라졸리움(tetrazolium) 화합물 3-(4,5 dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 를 purple formazan crystals 로 변환시키는 살아 있는 세포의 능력에 기반한 colorimetric technique의 변형을 이용해 세포 생존능력을 측정하였다. MTT (5 mg/ml) 를 Kreb's-Henseleit 버퍼(115 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 1.3 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCOs, 1 M CaCl₂, 및 1 M MgCl₂)에 용해시켰다. 상기 혼합물 50 ml 를 각각의 웰(well)에 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 서스펜션(suspension)을 제거하고 생성된 formazan crystals 을 200 ml 의 dimethyl sulfoxide에 용해시켰다. 각각의 웰의 부분 표본(aliquot)들을 96-웰 플레이트의 웰에 중복하여 접종하고, 마이크로-ELISA 플레이트 리더(micro-ELISA plate reader)를 사용하여 540 nm에서 측정하였다. NJ-처리 생존세포들의 수는 유사한 시간 단위 동안 유지된 대조군의 백분율로 표현하였다.

<1-12> 산 추출법(Acid Extraction Method)

1g 의 샘플을 20ml 의 3% 하이드로클로릭산(hydrochloric acid) 용액에 녹였다. 20 ml 의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 3번 흔드는 용액-용액 추출법(liquid-liquid extraction method)을 통해 불순물을 제거하였다. 소듐 카보네이트(sodium carbonate)를 가지고 상기 하이드로클로릭산의 pH를 9로 맞추고, 20 ml 의 클로로포름(chloroform)으로 3번 추출하였다. 상기 클로로포름 층은 진공 회전식 증발기(vacuum rotary evaporator) 내에서 증발하여 건조되었다. 총 알칼로이드(total alkaloid) 함량은 24.6 mg/g 이었다.

< 실시예 2>

NJ 가 LPS -유도성 내독소 쇼크에 미치는 영향

NJ 가 LPS-유도성 내독소 쇼크(endotoxin shock)에 미치는 영향을 알아보기 위하여, NJ의 생체 내(in vivo) 독성을 측정하였다. NJ 추출물을 마우스에 경구투여 하였다(그룹당 n=6). 표 1은 낮은 투여량의 NJ (< 20 mg/kg) 는 유의성 있는 생체 내 독성을 갖지 않는다는 것을 보여준다. 하지만, 높은 투여량의 NJ (20 및 50 mg/kg) 는 독성을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 LPS-유도성 내독소 충격을 위해 낮은 투여량의 NJ를 사용하였다.

TP, 총 단백질; UN, 요소(Urine) Na; Alb, 알부민; CREA, 크레아틴; AST, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase); ALT, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제; ALP, 알라닌 아미노포스파타아제(aminophosphatase); T-BIL, 총 빌리루빈(bilirubin). * P < 0.01 vs. 식염수(saline). 데이터는 3개의 독립적 실험들의 평균 ± S.E.M. 으로 나타내었다.

LPS 투여(37.5 mg/kg) 1시간 전에, 1, 5, 및 10 mg/kg 의 양 만큼 NJ 를 경구투여하였다. LPS 투여는 보통 2일 안에 죽음을 초래한다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, NJ의 전-처리(pre-treatment)는 투여량 의존적 방식(dose-dependent manner)으로 LPS-유도성 내독소 쇼크(endotoxin shock)를 억제한다. LPS는 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6을 포함한 여러 종류의 사이토카인(cytokine)들을 유도하여, 다양한 염증 반응들의 진행을 매개한다[14]. NJ가 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 의 LPS-유도성 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 본 발명자들은 그것이 상기 사이토카인들의 생성에 미치는 영향을 조사하였다. NJ (1, 5, 및 10 mg/kg)를 마우스에 복강투여(i.p.)하고(그룹당 n=6), 혈청 및 간 샘플을 LPS 투여 3시간 후에 얻었다. 치사 곡선(lethality curve)과 일치하게, LPS 의 주사는 혈청 내에서 높은 수준의 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 발현을 유도하였다. 하지만, NJ는 혈청 내에서 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 의 LPS-유도성 수준을 억제하였고(도 1B), 간에서 메신져(messenger) RNA의 LPS-유도성 수준을 억제하였다(도 1C).

< 실시예 3>

NJ 가 TNF-α, IL-1β 및 IL -6의 LPS -유도성 생성에 미치는 영향

이전의 연구에 따르면 마크로파지(macrophage)들은 LPS 투여 동안 지배적인 역할을 한다[15]. 따라서, 본 발명자들은 쥐 복막 마크로파지들에서 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 을 조사하였다. 상기 세포들을 0.5, 5, 또는 50 mg/ml 의 NJ로 60분간 전처리한 후, 500 ng/ml 의 LPS 로 24 시간 동안 자극하였다. NJ 그 자체는 세포독성을 나타내지 않았다(도 2A). 생체 내(in vivo) 결과와 일치하게, NJ 는 투여량에 비례하여 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 의 생성을 억제하였다(도 2B). 또한, 본 발명자들은, 사이토카인의 수준과 일치하게, NJ 가 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 mRNA 의 LPS-유도성 발현을 억제함을 관찰하였다(도 2C). NJ 가 TLR-4/MD-2 복합체의 발현을 감소시킬 가능성을 배제시키기 위해, 본 발명자들은 NJ 가 수용체 발현에 미치는 영향을 조사하였다. NJ는 복막 내 마크로파지에서 TLR-4/MD-2 복합체의 발현을 억제하지 않았다. TNF-α, IL-1, 및 IL-6를 포함한 다양한 사이토카인들의 생성은 MAPKs 및 NF-kB의 활성에 의해 야기되었다[16]. 따라서, 본 발명자들은 NJ 가 MAPKs 및 NF-kB 활성의 억제에 미치는 영향을 조사하였다. NJ의 전-처리는 식염수와 비교하여 MAPKs (ERK ½, JNK, 및 p38)의 LPS-유도성 활성을 약간 억제하였다(도 2D). NF-kB 전사 인자의 핵 전좌(nuclear translocation) 및 DNA 결합(binding)은 Ik-Ba의 분해에 의해 진행되었다[17]. NJ가 Ik-Ba의 LPS-유도성 분해를 억제하는지 알아보기 위하여, 웨스턴 블랏팅으로 Ik-Ba 의 단백질 수준을 측정하였다; NJ는 Ik-Ba 의 분해를 억제하지 않았다(도 2E).

< 실시예 4>

NJ 가 타입 1 IFNs 의 LPS -유도성 생성에 미치는 영향

타입 1 IFNs (IFN-α/β)는 LPS-유도성 치사(lethality)의 필수적 작동자(effector)이다[18]. 따라서, 본 발명자들은 쥐 간 샘플에서 실시간(real-time) RT-PCR 로 NJ가 IFN-α/β 에 미치는 영향을 조사하였다. 상기 관찰결과와 일치하게, LPS-주사 마우스에서 IFN-α/β 발현이 유도되었다. 하지만, NJ의 전처리는 쥐 간에서 IFN-α/β의 LPS-유도성 발현을 억제하였다(도 3A). IRF-1 및 IRF-7의 유도는 LPS 도입에 의한 IFN-α/β 의 최대생성에 필수적일 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 IRF-1 및 IRF-7의 유도를 조사하였다. NJ는 쥐 간에서 IRF-1 및 IRF-7 mRNA의 LPS-유도성 발현을 억제하였다(도 3B). 생체 내 결과와 일치하게, NJ는 마크로파지에서 IFN-α/β 의 발현 및 IRF-1 및 IRF-7의 유도도 감소시켰다(도 4A 및 B). 타입 1 IFN 이 STAT-1의 활성을 초래한다고 보고되었다[19]. 따라서 본 발명자들은 STAT-1 활성을 조사하였다. 이전 연구 결과와 일치하게[15], STAT-1은 LPS 자극 2-3 시간 후 활성화되었다(도 4C). 하지만, NJ 는 STAT-1 의 LPS-유도성 활성을 감소시켰다(도 4C).

< 실시예 5>

NJ 의 LPS -유도성 내독소 쇼크에 대한 치료효과

도 1A에 나타낸 바와 같이, NJ의 전처리는 LPS-유도성 내독소 쇼크를 억제하였다. 따라서, NJ의 치료적 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 LPS-유도성 내독소 쇼크 동안의 NJ의 효과를 조사하였다. LPS 주사 1시간 후에 NJ 를 경구 투여하였다. NJ의 후-처리(post-treatment) 역시 혈청 및 쥐 간에서 LPS-유도성 내독소 쇼크 및 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 와 같은 염증 매개자(inflammatory mediator)의 생성을 억제하였다(도 5). 간에서 IFNa/b 및 IRF-1/7 의 발현 역시 NJ 후처리에 의해 억제되었다(도 6 A 및 B).

< 실시예 6>

NJ 주요 구성성분의 동정

NJ 의 주요 구성분을 알아보기 위하여 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석을 위해, 크로마토그래피 시스템은 펌프(pump) (3000 HPLC pump; Dionex Association, USA), UV detector (Photodiode array detector; Dionex Association), 및 autosampler (Waters Association, USA)로 구성되었다. hydrosphere C18 column (4.6 mm x 250 mm, 5 ㎛) 을 사용하였다. 유동상(mobile phase)으로 water-methanol glacial (50:50) 을 사용하였다. 피크(peak)의 검출은 254 nm에서 이루어졌고, 감도(sensitivity)는 0.5 AUFs에서 맞췄다. 주입 부피는 10 ㎕ 였고, 유동 비율(flow rate)은 1.0 ml/min 이었다. 표준 용액(standard solution)은 증류 메탄올(10 ㎍/10 ml)에 녹여서 준비하였다. 상기 용액을 0.45 ㎛ 막 필터로 여과하고 HPLC 에 사용하였다.

NJ의 크로마토그램(chromatogram)을 도 7에 나타내었다. NJ 의 주요 구성분의 피크들은 아직 동정되지 않았다.

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Claims (5)

1. 감송향 (Nardostachys jatamansi; NJ) 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 감송향 추출물이 감송향의 뿌리를 물 또는 유기용매로 추출한 것임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 감송향 추출물이 감송향의 뿌리에 1 내지 20 배의 물을 가하고 80 내지 150℃에서 1 내지 24 시간 동안 추출한 후 여과하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항의 감송향 (Nardostachys jatamansi; NJ) 추출물을 활성성분으로 포함하는 패혈증 예방 및 개선용 식품 조성물.
   

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