KR101074158B1

KR101074158B1 - 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 인삼다당체 조성물

Info

Publication number: KR101074158B1
Application number: KR1020080032386A
Authority: KR
Inventors: 윤연숙; 송지영; 정인성
Original assignee: 재단법인 한국원자력의학원
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2011-10-17
Also published as: WO2009125964A2; US20110046086A1; EP2273999A4; WO2009125964A3; EP2273999B1; KR20090106957A; EP2273999A2; JP2011516543A

Abstract

본 발명은 간 보호 또는 간 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있는 인삼다당체 추출물 및 상기 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 및 치료용 조성물, 및 식품 조성물에 관한 것이다.

인삼다당체, 간 독성, 간 보호, 간 질환, 간경화

Description

간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 인삼다당체 조성물 {COMPOSITION COMPRISING POLYSACCHARIDE EXTRACTED FROM PANAX GINSENG PREVENTING AND TREATING LIVER DISEASES}

2001년 통계청의 사망원인통계결과를 보면 우리나라 사망원인 순위 중 간 질환이 5위를 차지하며 OECD 회원국 중[OECD Health Data]에 사망원인통계가 수록된 29개 국가 중 간 질환 사망자가 헝가리(57.3명), 멕시코(43.2명) 다음으로 우리나라(22.3명)가 3위의 높은 순위를 차지하고 있다. 현재 전 세계 만성 간 질환 환자 수는 약 6~8억 명에 이를 정도로 심각하나, 간은 침묵의 장기로 질환 초기에는 자각 증상이 없고 간 손상 정도가 한 상태에 이르러서야 발견 가능하므로 간 질환의 초기 발견은 그만큼 어려우며, 현존하는 치료제의 혜택을 볼 수 있는 환자는 절반 정도이고 아직까지 FDA 에서 인정받은 간 손상 치료제나 간경화 예방제는 없는 상황이다. 이에 따라 간에 부담을 주지 않는 장기적인 약물투여가 가능하며 평상시 용이하게 섭취하기 위하여 유기화학 제품보다는 인체에 무해하고 부작용이 적은 천연물질로부터 새로운 간 질환 치료제의 개발이 많이 진행되고 있다.

간은 우리 몸에 필요한 수천가지 효소를 생산해 내는 인간의 신체 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로, 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하면서 외부에서 들어온 물질로부터 각종 유독 물질을 제거하는 전신 방어 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 매우 높다. 그러나 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만 스트레스성 만성 피로, 지방성분이 포함된 음식물 또는 알코올의 과도한 섭취, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양부족, 바이러스 감염(HCV, HBV 등), 자가면역질환 등의 자극에 지속적으로 노출되면 염증반응과 세포사멸 과정을 통하여 간 손상이 일어난다. 특히 음식을 통한 과다한 지방 섭취 또는 과도한 알코올의 섭취는 간 조직에 기질이 쌓이는 지방간을 유발하며, 이 때 혈청 속의 sGOT(serum glutamate-oxaloacetate transaminase), sGPT(serum glutamate-pyruvate transaminase) 등이 증가하게 된다. 손상받은 간은 간성상 세포(Hepatostellate cell)가 활성화되어 간염(Hepatitis)을 거쳐 간 섬유화(Hepatic fibrosis)로 진전되고 다시 간경화를 거쳐 간암으로 진행된다. 간경 화(Liver cirrhosis)는 간 섬유화가 많이 진행되어 비가역적인 상태가 되는 경우를 의미하며, 간암, 복수, 복막염 및 정맥류 출혈 등 여러 가지 심각한 합병증을 초래한다.

최근에는 동물모델이 개발되어 간 질환 치료제의 개발에 크게 기여하고 있는데, 독성물질에 의한 간 질환 치료제를 개발하기 위해서는 사염화탄소(CCL₄)로 유도된 동물 모델이 이용되고 있다. 사염화탄소는 지방성 퇴행(fatty degeneration), 섬유증(fibrosis), 간세포 사멸 및 발암 등을 유발시키며, 독성물질이 간세포에 미치는 영향과 그 대사과정을 규명하는데 사용되는 대표적인 물질로서 간세포 배양, 간 박편(slice) 배양 그리고 마우스나 랫트에 직접 투여하는 방법 등을 이용하여 간 독성을 연구하는데 널리 사용되고 있다. 사염화탄소는 간에서 복합적인 기능을 하는 사이토크롬(cytochrome) P450과 같은 대사효소에 의해 대사되어 매우 독성이 강한 자유 라디칼인 CCl₃ 와 Cl을 형성하게 되고 자유 라디칼인 CCl₃ 는 축적된 간 중성지방이나 막 인지질에 있는 지방산의 산화를 유발시켜 지질의 산패를 일으키고 산소와 결합한 후 지질과 산화 반응을 촉진한다. 이러한 지질 과산화작용을 통하여 간장에 지방이 축적되고, 단백질 합성능력은 감소하게 되어 글리코겐으로 분해되고 미토콘드리아, DNA, 세포막과 같은 세포 구조물에 영향을 미쳐 세포를 손상시키거나 죽인다 (Recknagel, R. O., et al., Pharmacol.Rev., 19, pp145-208, 1967; Chang, I.M., et al., Drug and chemical toxicology, 6(5), pp442-453, 1983). 또한 TNF-α(tumor necrosis factor), NO(Nitric oxide), TGF-β(transforming growth factor) 등을 활성화시켜 세포괴사를 유도하거나 섬유화를 진행시키기도 한다 (Sato et al., The protective effect of hepatocyte growth-promoting factor(pHGF) against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rat: an ultrastructural study, Med Eletron Microsc 32, 184-192. 1999). 즉, 사염화탄소는 간에서의 단백질 생합성을 억제하고, 혈중 GOT, GPT 의 증가를 야기시키며, 조직학적으로는 간세포의 소엽중심성 괴사를 일으킨다.

일반적으로 이용되고 있는 간 질환의 치료방법은 크게 식이요법과 약제요법으로 구분되고 있으며, 대부분 이 두 가지 방법을 병용하고 있다. 현재 사용되고 있는 대표적 간 질환 치료제는 실리마린(silymarin)과 비페닐 디메칠디카르복실레이트(biphenyl dimethyl dicarboxylate, BDD)가 있다. 그러나 실제로 간 질환은 한 가지 원인에 의해서만 발생되는 것은 아니고 여러 요인의 복합적인 작용에 의해 발병하기 때문에 근원적 치료개념을 갖는 약물을 거의 없는 실정이다. 따라서 그 치료에 있어서도 어느 한 가지 작용기전을 갖는 약제에 의한 것만으로는 모든 간 질환에 대해 충분하게 만족스러운 높은 치료 효과를 기대할 수 없다. 예를 들어, 급성 간 질환의 경우 휴식과 고단백질 식이 및 비타민류를 충분히 공급하는 방법이 주로 사용되며, 간에 부담이 되는 약물요법은 오히려 피하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 실리마린, BDD 등의 약물은 예방제의 개념으로 사용되는 것이 아니라 치료제의 개념으로, 즉 간염 치료의 필요성이 있을 경우에만 사용하고 있다.

이와 같은 동물모델을 이용하여 간 기능을 보호하여 간염 발생을 예방하거나 간염을 치료할 수 있는 약제를 다양하게 개발하고 있으며, 그 실례로 인도에서는 오래전부터 치커리를 간 질환에 이용해 왔는데, 주요 활성 성분인 Cichorin은 사염화탄소에 노출된 마우스에 75 mg/kg 의 농도에서 간 보호 효과가 있음이 확인되었고 (H.Kalantari Ph et al., Protective Property of Cichorium Intybus in CCl₄induced Liver Damage in mice. School of Pharmacy, Ahwaz university of Medical Sciences, Ahwaz, Iran.), 감초의 뿌리에서 채취되는 글리시리진은 화학구조상 트리터페노이드계 사포닌 물질로서 미국에서는 일반적으로 안전하다고 여겨지는 물질 (GRAS:Generally Recognized as Safe)이라고 판단하여 사탕, 의약품, 담배에 사용되며 암과 종양의 발생을 억제하고 동맥경화를 개선하며 간 보호효과가 있는 것으로 확인되었으나 과용시 성기능 장애가 일어날 수 있고 고혈압과 부종을 일으키는 것으로 보고되었다. 이 외에도 강황의 간 해독 기능과 항암작용이 보고되었으며, 사포닌 계의 버플로사이드(bupleuroside) 계열 화합물(H. Maysuda et al., Bioorg. Med. Chem., 7, pp2193-2198, 1997), 나린진(naringin) (K.Kawaguchi et al., Eur. J. Pharmacol., 368, pp1560-1567, 2001), 맨드라미(Celosia argentea)의 씨앗에서 추출한 다당체 등이 DGalN/LPS 로 유도된 간 손상 모델에서 간 기능을 보호하고 실험동물의 치사를 억제하는 활성이 있다고 보고되었다 (K.Hase et al., Biol. Pharm.. Bull., 19, pp567-572, 1996). 또한 식물성분 중에 간장보호나 간염의 치료에 효과적인 다당류나 당단백 등의 성분들이 포함되어 있다고 보고되고 있는데, 식물에 포함되어 있는 다당류나 당단백은 실험적으로 간 독성을 현저하게 경감시키는 효과가 있으며, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 얻은 글루칸(glucan)은 대식세포를 자극하여 바이러스에 저항성을 나타낸다고 알려져 있다 (참조: Science 208:67-69, 1980). 그러나, 인삼 속 식물의 다당체가 간 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 발휘한다는 사실은 지금까지 전혀 알려진 바가 없었다.

한편, 본 발명자들은 본원 출원 이전에, 대한민국 등록특허 제144130호를 통하여 글루코즈, 갈락토오즈, 갈락투론산 및 단백질로 구성된 인삼 단백다당체가 방사선 방어작용이 있음을 보고한 바 있으며, 대한민국 등록특허 제0361187호에서는 인삼다당체의 조혈 촉진작용, 골수 방어작용 및 방사선 민감작용 등을 보고한 바 있다. 그러나 상기의 선행 기술들은 그 다당체를 구성하는 구성성분의 종류와 비율에 있어서는 본 발명에 의해 추출된 다당체와는 상이한 것이고, 상기의 질환들과 간 질환은 발생 원인 및 이를 치료하기 위한 약물의 기작 등이 전혀 상이하다. 또한, 상기 특허는 약제로 개발되기까지 순수 분리과정이 까다롭고 수득률이 미비하며, 나아가 본 발명자들은 조성물의 구성에 있어서 글루코즈와 갈락토오즈의 함량 변화가 활성에 지대한 영향을 미침을 알게 되었다.

효과적이고 개선된 간염 치료제 또는 간세포 보호제의 개발은 계속 이루어져야 하며, 본 발명의 목적 또한 여기에 있다. 이에 본 발명자들은 백삼을 물로 추출한 다음 농축하고 에탄올을 가하여 침전된 다당체를 획득하였으며, 만노즈 1.2~2.8중량%, 글루코즈 64.1~82.8중량%, 갈락토오즈 10.0~26.6중량% 및 아라비노즈 0.6~5.4중량%의 당으로 구성된 조성물로 실험관내 실험과 사염화탄소로 유발한 간 질환 동물 모델에서 다양한 기전으로 간을 보호 내지는 치료하는 효능이 매우 우수 함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 간 보호 또는 간 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있는 인삼다당체 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 인삼다당체 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 억제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호 및 간 기능 개선 효과를 가지는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 간 보호 또는 간 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있는 인삼다당체 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 인삼속 식물의 예로는 파낙스 진생 씨.에이. 메이여(panax ginseng C.A. Mayer ), 파낙스 퀸크폴리옴(panax quinquefolium), 파낙스 노토진생(panax notoginseng), 파낙스 슈도진생(panax pseudoginseng), 파낙스 자포니쿰(panax japonicum), 베트남 진생(panax vietnamensis Ha et Grushv.) 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 특히 파낙스 진생 씨.에이. 메이여에서 유래한 진생 라딕스 알바(Ginseng Radix Alba) 즉, 백삼이 바람직하다. 백삼은 파낙스 진생 씨.에이. 메이여의 잔뿌리와 주피를 제거하고 말린 것이다.

본 발명에 따른 다당체는 만노즈 1.2~2.8중량%, 글루코즈 64.1~82.8중량%, 갈락토오즈 10.0~26.6중량% 및 아라비노즈 0.6~5.4중량%의 당을 포함한다.

본 발명의 인삼다당체 추출물은 간 보호 또는 간 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있으며, 상기 간 질환은 지방간, 간괴사, 간경변, 간경화, 급만성 간염 또는 간암을 포함한다.

본 발명자들은 다음과 같은 방법으로 본 발명의 인삼다당체의 간 보호 효과를 확인하였다.

구체적으로, 간 기능의 개선 여부를 평가하기 위해서 여러가지 바이오마커를 측정하여 평가하였으며, 대표적인 바이오마커로서 혈중에 존재하는 간 손상 표지자인 ALT(Alanine aminotransferase), AST(Aspartate aminotransferase), ALP(Alkaline phosphatase), 총 빌리루빈 및 알부민 효소 등을 사용하였다. 간 세포에 괴사나 파괴가 있는 경우 효소의 수치는 정상적인 수치를 초과하게 되며, 약물이 간세포 보호효과가 있는 경우 정상적인 범위로 환원하게 된다.

우선, 본 발명자들은 본 발명의 인삼다당체를 단독 투여 또는 장기간 투여해도 대조군과 비교하여 상기와 같은 간 손상 지표의 유의적인 변화가 없었으므로, 본 발명의 인삼다당체가 간 독성을 전혀 나타내지 않는 간 보호 효능이 있음을 확인하였다(도 1 및 표 2 참조).

또한, 본 발명의 인삼다당체는 사염화탄소나 아세트아미노펜과 같은 간 독성 물질의 투여에 의해 생쥐에 간 손상을 유도하였을 때 혈액 내 간 손상 효소가 현저히 감소하고 지질과산화물 생성이 감소시켰으며, 사염화탄소를 대사시키는 간 효소인 싸이토크롬 P450-2E1을 현저히 감소시켰고, 간 손상을 가중시키는 염증성 싸이토카인 및 케모카인의 생성을 감소시킴을 확인하였다(도 2 내지 도 8 참조).

또한, 지나친 염증반응이나 조직변형의 결과로 생길 수 있는 간 섬유화를 인삼다당체를 전처리 또는 후 처리시 현저히 감소시켰으므로 간 섬유화 보호 또는 치료 효능이 있음을 입증하였다(도 8 참조).

이상의 실험 결과들로부터 본 발명의 인삼다당체가 간 보호 또는 간 질환 예방 및 치료에 매우 유용함을 알 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인삼다당체를 인삼속 식물로부터 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 인삼다당체 추출방법은 (a) 인삼속 식물을 세절 건조 후 물에 넣고 0~180℃ 로 0.5~20 시간 동안 냉침 또는 가열하여 추출액을 얻는 단계; (b) 상기 추출액을 농축한 후 유기용매를 이용하여 다당체를 침전 및 분리하는 단계; 및 (c) 분리된 다당체로부터 유기용매를 제거하여 다당체를 얻는 단계로 이루어진다.

상기 단계 (a)에서 반응 온도가 너무 낮으면 추출량이 매우 적고 공정의 원활한 진행이 어려우며 반대로 너무 높으면 일부 다당들이 변질될 가능성이 있으므로 바람직하지 않고, 반응 시간이 너무 짧으면 추출량이 매우 적고 반대로 너무 길면 공정의 경제성이 떨어지므로 바람직하지 않다. 상기 "냉침"은 대략 0∼25℃에서 침지하는 것을 의미하고, 상기 "가열"은 대략 50~180℃ 에서 침지하는 것을 의미한다. 사용되는 물의 양은 특별히 제한되는 것은 아니며, 용이한 추출을 위해 인삼 뿌리 등의 부피를 기준으로 8∼20 배의 물을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 6년근 인삼 1kg을 세절 건조한 후 물 8L로 추출하였다.

상기 단계 (b)에서 추출액은 다당체의 효과적인 회수를 위하여 농축하게 되는데, 예를 들어, 진공∼760 mmHg의 감압조건에서 20∼90℃로 가열하여 농축할 수 있다. 농축된 추출액에 유기용매을 부가하여 다당체를 침적시키는데, 바람직하게는 0.1∼1 M의 염화나트륨, 및 0.1∼1 M의 저급알코올 또는 아세톤을 사용한다. 유기용매의 사용량은 추출액의 부피를 기준으로 1∼5 배, 바람직하게는 2∼4 배로 사용한다. 상기 저급알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 펜탄올 등 C5 이하의 알코올이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을, 더욱 바람직하게는 70~90%(v/v) 에탄올을 사용한다. 다당체의 분리는 여과(한외여과 등 포함), 원심분리, 이온교환수지, 흡착수지 및 투석 등 다양한 방법에 의해 행해질 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 추출액을 56℃ 로 감압 증류하여 농축된 인삼 용액을 80%(v/v) 에탄올로 포화시켜 침전물을 수득한 후 이를 물로 투석하여 분리하였다.

상기 단계(c)에서 유기용매를 제거한 후 건조를 행하여 다당체를 분말의 형태로 얻을 수도 있다. 그러한 건조방법으로, 열풍, 진공건조, 동결건조, 분무건조 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 단계 (b)에서 얻은 분리액을 동결 건조하여 인삼다당체를 제조하였다.

이상 본 발명에 따른 인삼다당체 추출방법을 설명하였지만, 임삼다당체의 추출 효율을 높이거나 순도를 높이기 위하여 일부 공정의 변형 또는 부가가 가능할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방 및 치료용 조성물, 및 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 억제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 인삼다당체를 의약으로 사용할 경우 약학적 제제 및 그 투여방법에 있어서 각종 공지의 방법을 적용할 수 있다. 인삼다당체를 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 제제화할 경우, 유효성분에 악영향을 미치지 않는한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 즉 안정제, 완화제, 유화제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 적합하며 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 용매, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물 중 약학적 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이 외에, 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함하여 제제화할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 인삼다당체 조성물은 약학적 제형에 있어서 함유량은 제형에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 통상적인 방법에 따른다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 인삼다당체의 투여량은 환자의 상태 와 간 질환의 정도에 따라서 다양화될 수 있지만, 성인 1일 10 mg/kg ~ 500 mg/kg의 범위 내에서 조절될 수 있다. 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 인삼다당체 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 보호 및 간 기능 개선 효과를 가지는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 기능성 식품, 영양 보조제(nutritional supplement), 영양제(nutrient), 파머푸드(pharmafood), 건강 식품(health food), 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드(designer food), 식품 첨가제(food addtives) 등의 모든 형태에 해당한다. 인삼다당체를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체 및 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 본 발명의 인삼다당체는 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 20 중량%로 가할 수 있으나, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02~10 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 인삼다당체 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 음 료와 같이 여러 가지 향미제 또는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 인삼다당체는 대표적인 간 독성 물질인 사염화탄소나 아세트아미노펜에 의한 간 손상을 유의적으로 감소시키고 효과적으로 체내 염증반응을 조절한다. 따라서, 본 발명의 인삼다당체는 스트레스, 음주에 따른 간 손상이나 과도한 약물이나 식품에 의해 유발된 간 독성을 감소시키는 한편, 체내의 염증 반응을 조절하여 간을 보호하는 치료제로 사용할 수 있다. 또한 경구투여나 복강투여 두 가지 투여방법 모두에서 효과가 있었고 장기 복용해도 간에 아무런 이상을 초래하지 않으므로 예방 목적으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 제조실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조실시예 및 실험예는 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조실시예 1. 인삼다당체의 제조

6년근 인삼 1kg을 세절 건조한 후, 물 8L로 추출하여 수가용성 분액을 56℃로 감압 증류하여 농축된 인삼 용액을 80(v/v)% 에탄올로 포화시켜 침전물을 수득한 후 이를 물로 투석한 다음 동결 건조하여 인삼다당체를 제조하였다.

제조실시예 2. 인삼다당체의 구성당 분석

제조실시예 1의 인삼다당체를 20mg 취하여 2M-HCl 2 ㎖를 가하여 100℃에서 24시간 가열하여 산가수분해한 다음 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 여기에 2M-NaOH를 가하여 중화하고 감압 농축한 다음 0.3M-NaOH 400 ㎕를 가하였다. 단당류 표준품은 100 nM/0.3.M-NaOH 100 ㎕로 만든 후 시료와 더불어 각각 100 ㎕를 취해 0.5M-PMP(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone) 메탄올 용액 100 ㎕을 가하고 70℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 실온에서 냉각하고 0.3M-HCl 100 ㎕로 중화한 다음, 잔여 PMP를 클로로포름으로 추출하여 제거하고 상층액인 수용액 층을 취하여 농축하였다. 2 배량의 물로 희석하여 0.45 μm 크기의 필터를 통과시 킨 후 고속 액체크로마토그래피법으로 분석하였으며 조건은 다음과 같다.

기기 : Waters HPLC System (515 HPLC pumps)

디텍터 : Waters 490E UV Detector (검출파장 : 250 nm)

칼럼 : Zorbax Extended-C18 column (4.6 cm I.d x 250mm, 5 μm)

칼럼온도 : 35℃

유속 : 1 ㎖/min

시료주입량 : 10 ㎕

이동상 : 50 mM Sodium phosphate (pH 6.9)

- Buffer A : 15% Acetonitrile(ACN) in Sod. phosphate buffer,

- Buffer B : 40% Acetonitrile(ACN) in Sod. phosphate buffer

[Gradient 조건] 시간 (분) %A %B

Initial 100 0

10 92 8

30 80 20

50 100 0

단당류	머무름 시간(RT)	조성(중량%)
D(+)-만노스	14.50	1.2-2.8
L(+)-람노스	18.82	미검출
D-글루쿠론산	19.68	미검출
D(+)-갈락투론산	21.75	미검출
D(+)-글루코스	25.15	4.1-82.8
D(+)-갈락토즈	27.06	10.0-26.6
D(+)-자일로즈	28.28	미검출
L(+)-아라비노스	28.72	0.6-5.4
D(+)-퓨코스	31.38	미검출

상기 표 1에서 제시한 바와 같이 인삼다당체는 만노즈 1.2~2.8중량%, 글루코즈 64.1~82.8중량%, 갈락토오즈 10.0~26.6중량% 및 아라비노즈 0.6~5.4중량%의 당으로 구성되어 있다.

( 실험예 )

상기 제조실시예로부터 인삼다당체를 제조한 후 사염화탄소에 의해 간 독성이 유발된 동물을 대상으로 다음과 같은 생체내 실험과 실험관내 실험을 수행하였다.

실험예 1. 인삼다당체 단독 투여의 간 독성 여부실험

BALB/c 수컷 생쥐에 인삼다당체를 10, 50, 100, 200 mg/kg 으로 각각 복강 주사하여 48 시간 후에 생쥐의 혈액을 채취하여 혈장 분리 후 간 손상의 표지자인 ALT, AST, ALP, 총 빌리루빈, 알부민 효소량을 측정하였다. 대조군으로는 인산완충액을 동일한 방법으로 투여하였다. 인삼다당체 단독 투여군에서는 농도에 상관없이 시료를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 모든 간 손상 지표의 유의적인 변화가 없었다 (도 1 참조).

실험예 2. 인삼다당체 장기 투여시 간에 미치는 영향

BALB/c 수컷 생쥐 (그룹당 4마리)에 인삼다당체를 일주일에 두 번씩 100 mg/kg 으로 20 주간 경구투여하고 2 주마다 그룹당 4 마리씩 생쥐의 안구총으로부터 혈액을 뽑아 혈청을 분리하여 간에 독성을 유발하는지 간 독성 표지 인자인 ALT 방법으로 투여하였다. 20 주간 총 4000 mg/kg 의 인삼다당체를 경구투여해도 대조군에 비해 ALT 및 AST 모두 변화가 없었으므로 인삼다당체를 장기간 복용하여도 간 독성을 유발하지 않음을 확인하였다 (표 2 참조).

인삼다당체를 20주간 경구투여시 간 효소 측정

주수(주)	인삼다당체 누적투여량(mg/kg)	대조군		인삼투여군
주수(주)	인삼다당체 누적투여량(mg/kg)	ALT(UI/L)	AST(UI/L)	ALT(UI/L)	AST(UI/L)
2	400	59	106	52	105
4	800	60	101	46	98
6	1200	50	116	46	104
8	1600	59	116	50	107
10	2000	52	116	49	105
12	2400	54	111	49	105
14	2800	60	103	50	100
16	3200	55	113	49	97
18	3600	59	107	53	99
20	4000	55	116	49	109

실험예 3. 인삼다당체 투여에 의한 사염화탄소 유발 간 손상 보호효과

인삼다당체의 간 보호 효과를 비교하기 위해 사염화탄소로 간 손상을 일으킨 생쥐에서 간 손상 효소를 측정하였다. BALB/c 수컷 생쥐에 인삼다당체 100 mg/kg와 양성대조군으로 간 보호 효과가 있음이 입증되어 이미 널리 이용되고 있는 실리마린 400 mg/kg를 각각 복강 주사하고 24시간 후에 사염화탄소 15 ㎍/kg 로 오일에 용해시켜 복강주사하였다. 24시간이 경과한 후에 생쥐의 혈액을 채취하여 혈장을 분리하고 ALT 및 AST 효소를 측정하였다. 대조군으로는 인산완충액과 올리브 오일을 동일한 방법으로 투여하였다.

그 결과, 간 손상이 일어난 군 중에서 실리마린 처리군에서는 사염화탄소 유발 간 손상군에 비해 ALT 와 AST가 각각 68%, 60% 감소한데 비해 인삼다당체 처리군에서는 각각 82%, 87%로 감소함으로써 우수한 간 보호 효과를 나타내었다 (도 2 참조).

실험예 4. 인삼다당체 투여에 의한 아세트아미노펜 유발 간 손상 보호효과

우리가 흔히 타이레놀로 알고 있는 아세트아미노펜은 과다복용시 또는 알콜과 함께 복용시 심각한 간 손상을 초래하는 것으로 보고된 바 있다. 상기한 인삼다당체가 아세트아미노펜에 의한 간 손상에도 간 보호 효과가 있는지 확인하기 위하여 BALB/c 수컷 생쥐에 인삼다당체를 100 mg/kg 으로 복강투여하고 24시간 후에 아세트아미노펜 500 mg/kg을 따뜻한 인산완충용액에 용해시켜 복강주사하였다. 24시간 경과한 후에 마우스의 혈액을 채취하여 혈장 분리 후 ALT 및 AST 효소를 측정하였다. 대조군으로는 인산완충액을 동일한 방법으로 투여하였다.

그 결과, 인삼다당체 처리군에서는 아세트아미노펜 유발 간 손상군에 비하여 ALT 와 AST가 각각 84%, 87% 감소하였다. 따라서, 인삼다당체 투여는 사염화탄소 뿐만 아니라 아세트아미노펜에 의한 간 손상에도 보호효과가 있음을 확인하였다 (도 3 참조).

실험예 5. 인삼다당체 투여에 의한 간의 지질과산화물 생성 감소

약물이 유입되면 간에서 대사 작용이 일어남과 동시에 산화작용이 증가하여 지질과산화물이 생성되는데 이러한 지질과산화물은 간 손상을 증가시킬 수 있는 요인이 된다. 인삼다당체 투여군이 사염화탄소에 의한 간 손상 유발 대조군에 비해 우수한 보호 효과를 나타내었으므로 지질과산화물을 측정하기 위하여 간 조직을 채취한다. 채취한 간 조직을 생리식염수에 넣고 분쇄시킨 다음 ThioBarbituric Acid Reactive Substances (TBARS assay kit) 실험 방법에 따라 지질과산화물인 말로닐 디알데하이드 (MDA)를 측정하였다.

그 결과, 사염화탄소에 의해 간 손상이 유발된 군에서 MDA가 유의적으로 증가한 반면 인삼다당체 투여에 의하여 MDA 수치가 43% 감소하였으므로 사염화탄소 유발 지질과산화물 생성 억제에 인삼다당체가 효과적임을 입증하였다.

인삼다당체와 사염화탄소를 각각 복강투여했을 때 지질과산화물 측정

MDA 측정치	대조군	인삼다당체	사염화탄소	인삼다당체 +사염화탄소
nmole/㎖	10.98±0.83	0.96±1.41	22.16±1.02	12.63±0.67

실험예 6. 간 조직 면역염색 실험

사염화탄소 유발 간 손상 및 인삼다당체 투여에 의한 간 보호 효과를 해부병리학적으로 관찰하고자 BALB/c 수컷 생쥐에 인삼다당체 100 mg/kg 또는 인산완충액을 복강 주사하고 24 시간 후에 사염화탄소 15 ㎍/kg 로 올리브 오일에 용해시켜 복강 주사하였다. 24 시간 경과 후 간을 적출해 내고 파라포르말린 용액에 고정한 다음 파라핀 포매를 하여 3-5 μM의 크기로 절편하고 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색을 시행하여 조직 슬라이드를 만들고 현미경 하에서 관찰하였다.

그 결과, 대조군에 비해 사염화탄소 유발 간 손상군에서는 광범위한 괴사조직을 관찰할 수 있는 반면, 인삼다당체 처리군에서는 거의 정상 조직에 가까운 소견을 나타내었다 (도 4 참조).

실험예 7. 인삼다당체 투여에 의한 싸이토크로 P450 대사효소 및 염증성 싸이토카인 변화

7-1. 싸이토크롬 P450 -2 E1 단백질량 측정

약물을 복용하면 체내로 흡수시키기 위하여 싸이토크롬 P450을 통해 대사가 되어야 하는데, 사염화탄소를 주로 싸이토크롬 P450-2E1에 의해 대사가 되어 체내로 흡수되므로 간 조직에서의 싸이토크롬 P450-2E1 변화를 웨스턴 블랏팅을 이용해 관찰하였다. 상기 기술한 실험조건과 동일하게 인삼다당체 또는 인산완충액을 투여하고 24시간 경과 후 사염화탄소 주입으로 간 손상을 유발하였다. 24시간 후 간 조직을 채취하여 일반적인 방법으로 단백질을 추출하였으며, 10% SDS-PAGE gel 을 사용하여 단백질을 분리하고 싸이토크롬 P450-2E1 항체를 붙여 발현량을 확인하였다.

그 결과, 사염화탄소 처리군에서 현저히 싸이토크롬 P450-2E1 발현량이 감소하였으나 인삼다당체 단독 처리군에서는 대조군 대비 변화가 없었으며 사염화탄소에 의한 싸이토크롬 P450-2E1 저하를 정상수준으로 회복시킴을 확인하였다 (도 5 참조).

7-2. 염즘성 싸이토카인 발현량 측정

간 손상과 관련하여 다양한 싸이토카인의 변화가 언급되고 있으므로 간 조직의 RNA를 분리하여 cDNA 로 합성하고 해당하는 싸이토카인 프라이머(primer)를 이용하여 역전사 PCR (Reverse Transcriptation Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하였다. 최종산물은 1.5% 아가로즈 젤에 전기영동하여 발현량을 측정하였다.

그 결과, 사염화탄소 유발 간 손상군에서는 염증의 대표적 지표인 TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α)가 증가한 반면 간 세포의 회복에 관여하는 IFN-γ(interferon-γ) 나 IL-6(interleukin-6)은 감소한 것으로 나타났다. 이에 반해 인삼다당체 단독 처리군에서는 대조군 대비 IFN-γ 및 IL-6 가 약간 증가하는 경향을 보였으며 사염화탄소에 의해 증가된 TNF-α는 감소시키고, 감소된 IFN-γ 및 IL-6 는 증가시키는 조절작용을 나타냈다. 또한 사염화탄소 유발 간 손상군에서는 염증반응을 거쳐 세포변형이나 섬유증의 초기 지표인 α-SMA(α-Smooth Muscle Actin)의 발현이 현저히 증가하였으며 인삼다당체 전처리에 의해 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다 (도 7 참조).

7-3. 케모카인의 발현량 측정

체내의 염증 신호가 전달되면 호산구나 T 세포를 염증 부위로 이동시키기 위하여 여러가지 케모카인이 증가한다. 하지만, 간 손상이 일어난 부위에서 염증 반응에 의해 많은 면역세포들이 모이면 오히려 손상을 더욱 악화시킬 수 있으므로 케모카인의 발현량 변화를 측정하였다. 상기 기술한 것과 동일한 실험 조건에서 간을 적출하고 RNA 를 분리하여 RT-PCR 을 수행하였다. MCP-1(Monocyte Chemotactic Protein-1), MIP-2(Macrophage Inflammatory Protein-2), KC(Keratinocyte-derived chemokine)와 같은 호산구를 염증 부위로 이동시키는 케모카인들이 사염화탄소 처리군에 모두 현저히 증가하였으며 인삼다당체 전처리 투여에 의해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 6 참조).

실험예 8. 인삼다당체 투여에 의한 간 섬유화 억제 작용

대표적인 섬유화 지표인자로서 α-SMA 가 널리 알려져 있으며 상기 실험군의 간 조직에서 그 발현량과 변화를 확인하였으나 실험관내 실험으로 간세포(HepG2)를 배양하여 다양한 인자를 다시 한 번 검색하였다. 간 세포주에 섬유화 유발인자인 TGF-β를 5 nM/㎖의 농도로 처리하고 인삼다당체를 여러 조건의 농도(12.5-200 ㎍/㎖)와 시간(전 후 20 시간)으로 처리한 다음 α-SMA의 발현량을 검사하였다.

그 결과, TGF-β를 처리 전, 후 2 시간째 인삼다당체를 50 ㎍/㎖ 이상 처리하였을 때 α-SMA와 피브로넥틴, 콜라겐이 현저히 감소하였으므로 간 섬유화를 방지할뿐만 아니라 치료 효과도 우수한 것으로 보여진다 (도 8 참조).

이상과 같은 실험예로부터 본 발명의 인삼다당체가 사염화탄소나 아세트아미노펜과 같은 간 독성 물질의 투여에 의해 유도된 간 손상을 빨리 회복시키는 효과가 있으며 장기 복용해도 간 독성이 전혀 나타나지 않는 간 보호 효능이 있음을 확인하였다. 또한 지나친 염증반응이나 조직변형의 결과로 생길 수 있는 간 섬유화를 인삼다당체를 전처리 또는 후 처리시 현저히 감소시켰으므로 간 섬유화 보호 또는 치료 효능이 있음을 입증하였다.

도 1은 인삼다당체를 여러 가지 농도로 복강투여했을 때 간 독성이 없음을 나타낸 도면이다.

도 2는 인삼다당체 처리에 의해 사염화탄소에 의한 간 독성이 유의적으로 감소함을 나타내는 도면이다.

도 3은 인삼다당체 처리에 의해 아세트아미노펜에 의한 간 손상이 효과적으로 억제됨을 나타내는 도면이다.

도 4는 사염화탄소에 의한 간 손상이 인삼다당체 처리에 의해 감소됨을 보여주는 간 조직 염색사진이다.

도 5는 사염화탄소에 의해 손상된 간 조직에서 인삼다당체 처리에 의한 싸이토크롬 P450-2E1의 단백질이 감소됨을 보여주는 사진이다.

도 6은 사염화탄소로 유발된 간 손상에서 증가된 케모카인들이 인삼다당체 투여에 의해 감소됨을 보여주는 사진이다.

도 7은 인삼다당체 투여에 의해 염증성 싸이토카인들의 감소를 보여주는 사진이다.

도 8은 인삼다당체 투여에 의해 간 섬유화가 저해됨을 보여주는 결과이다.

Claims

유효성분으로서 만노즈 1.2~2.8중량%, 글루코즈 64.1~82.8중량%, 갈락토오즈 10.0~26.6중량% 및 아라비노즈 0.6~5.4중량%의 당으로 이루어진 인삼다당체 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간 질환 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 간 질환은 지방간, 간괴사, 간경변, 간경화, 급만성 간염 또는 간암을 포함하는 조성물.
삭제
삭제
삭제
유효성분으로서 만노즈 1.2~2.8중량%, 글루코즈 64.1~82.8중량%, 갈락토오즈 10.0~26.6중량% 및 아라비노즈 0.6~5.4중량%의 당으로 이루어진 인삼다당체 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 간 섬유화 억제용 조성물.
만노즈 1.2~2.8중량%, 글루코즈 64.1~82.8중량%, 갈락토오즈 10.0~26.6중량% 및 아라비노즈 0.6~5.4중량%의 당으로 이루어진 인삼다당체 추출물을 포함하는 간 보호 및 간 기능 개선 효과를 가지는 식품 조성물.
제7항에 있어서, 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드, 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드 및 식품 첨가제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 식품에 사용하기 위한 식품 조성물.