CN103992415A - 全真一气汤多糖的提取纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全真一气汤多糖的提取纯化的方法，属于中药提取技术领域，旨在提供一种方法简单，多糖含量高的提取纯化方法；该方法是称取各组分，除熟地外的其余药材干燥粉碎；将熟地切段，用超声提取法提取，离心分离取上清液；将上清液浓缩，调至药液乙醇含量为75-85％，静置离心分离，取下层沉淀干燥得粗多糖A；取粗多糖A加水溶解，摇匀，酸调节pH至5-6，加入木瓜蛋白酶，酶解，灭活离心除去沉淀，取下层液得粗多糖酶解液A；向粗多糖酶解液A中加入氯仿-正丁醇溶液，震荡，静置过夜，收集上层水相溶液，得到多糖溶液A；加水配制成溶液，调节多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔树脂吸附，过滤得粗多糖，将溶液装入透析袋透析即可得到精制多糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖的提取纯化方法，尤其涉及一种绿全真一气汤多糖的提取纯化的方法；属于中药提取技术领域。
背景技术
全真一气汤为明清医学大家冯兆张《冯氏锦囊秘录》中的著名方剂。由熟地黄、白术、人参、麦冬、五味子、附子、牛膝组成。临床广泛用于治疗各种老年虚损性疾病，如胃肠疾病，慢性阻塞性肺病、肺癌、等辩证属气血阴阳俱虚免疫功能低下者，疗效显著。现代研究表明，多糖具有调节免疫，降血脂，抗肿瘤，抗炎，抗衰老等生理功能。
目前有关全真一气汤多糖的提取研究报道很少，本课题组近年对全真一气汤多糖进行了一定程度的探讨，发现其主要的药理作用为增强免疫力，对正常小鼠及环磷酰胺免疫抑制小鼠的非特异性免疫功能有不同程度的增强作用，可提高环磷酰胺抑制的体液免疫功能，具有肠道粘膜免疫调节作用，其主要机理为升高免疫抑制小鼠血清IL-6和TNF-α水平，刺激免疫抑制小鼠机体的细胞因子分泌，从而达到调节免疫功能的作用。
陈虹在硕士论文中虽然提供了《全真一气汤总多糖的提取与质量控制初步研究》，但是所得的多糖含量不高，提取率也比较低。
发明内容
针对上述不足，发明目的在于提供一种提取纯化方法简单，多糖含量高的全真一气汤多糖的提取纯化方法。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：该全真一气汤多糖的提取纯化的方法，依次包括下述步骤：
1)按全真一气汤配方比例称取熟地黄、白术、人参、麦冬、五味子、附子、牛膝，除熟地外，其余药材干燥，粉碎；
2)将熟地切段，与步骤1)粉碎后的药材混合，用超声提取法提取药材1-3次，每次7-9倍水提取25-35min后粗滤，静置过夜后离心分离，取上清液；
3)将步骤2)中的上清液浓缩至相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为75-85％，静置离心分离，取下层沉淀用乙醇洗涤后于55-65℃真空干燥得粗多糖A；
4)取步骤3)粗多糖A加水溶解，摇匀，酸调节pH至5-6，加入木瓜蛋白酶,在45-55℃， 酶解4-6h，灭活，离心除去沉淀，取下层液得粗多糖酶解液B；
5)向步骤4)粗多糖酶解液A中加入其体积1/4-1/6的氯仿-正丁醇溶液，震荡，静置过夜，收集上层水相溶液，得到多糖溶液B；
6)取步骤5)多糖溶液B，加水配制成浓度为3-5mg/ml的溶液，调节多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔树脂在45-55℃水浴下搅拌1-3h，过滤的粗多糖B；
7)取步骤6)粗多糖B加水制成浓度为4-6mg/mL的溶液，将溶液装入透析袋中，封好两端，放入水中透析，每隔20-28h换一次水，48h后，取出透析袋中的溶液，55-65℃真空干燥即得精多糖。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤1)所述的干燥温度均为60℃。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤2)所述的超声条件为在室温下超2s停2s，功率800w。
上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤2)、步骤3)和步骤4)所述的离心条件均为5000rpm×10min。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤3)所述的上清液浓缩是在60℃旋转蒸发至药液相对密度为1.15-1.2。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤4)所述的酸为冰醋酸。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，取步骤2)粗多糖A:水:木瓜蛋白酶的质量比是1：50:1.5。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤4)所述的灭活是沸水浴灭活5min。
进一步的，上述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，步骤6)所述的大孔树脂是大孔树脂AB-8。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案：操作简单，多糖含量高，纯度高。通过脱蛋白，透析处理后，多糖含量均上升较高。虽然脱蛋白处理本身并没有提高粗多糖中的多糖含量，但是这个步骤对于整个多糖的精制过程是必不可少的。
全真一气汤具有较显著的临床疗效，对其进行深入的作用机理研究，阐明其科学内涵，具有重要的临床意义。特别是对于其作用的物质基础，有必要进行深入研究。全真一气汤中多种药材含有多糖类成分，而现代研究亦证明，多糖类成分具有多种生理活性，如提高免疫力、抗病毒等。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改仍在本发明权利要求保护范围之内。
实施例1
本发明提供的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，依次包括下述步骤：
1)提取
按全真一气汤配方比例称取药材饮片，共6剂，除熟地外，其余药材60℃干燥，粉碎为粗颗粒。熟地切成小段。采用超声提取法提取药材2次，每次8倍水提取30min(超声条件：超2s停2s，功率800w，室温)。合并提取液，用尼龙网(200目)粗滤，静置过夜后离心处理(5000rpm×10min)，得上清液，60℃旋转蒸发至药液的相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为80％，静置24h，5000rpm离心10min，沉淀用80％的乙醇洗涤一次后于60℃真空干燥得粗多糖A。
2)脱蛋白
取步骤1)粗多糖A2.0g于三角瓶中，加水100mL溶解，摇匀，冰醋酸调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶3g，50℃，酶解5h，沸水浴灭活5min，5000rpm×10min离心除去沉淀。得粗多糖酶解液。采用Sevag法，在上述酶解液中加入其体积1/5的氯仿-正丁醇溶液，震荡30min，静置过夜，收集上层水相溶液，重复三次,得到脱蛋白粗多糖B。
3)除色素
3)取步骤2)脱蛋白粗多糖B适量，加水配制成浓度约为4mg/ml的溶液，用冰醋酸调节多糖溶液的pH至5.0，加入2g大孔树脂AB-8(重量百分比为5％)，在50℃水浴下搅拌2h，过滤脱蛋白粗除色素多糖B。
4)透析
取步骤3)脱蛋白粗除色素多糖B50mg，加水制成浓度约为5mg/mL的溶液，将溶液装入透析袋中，封好两端，放入4000mL的水中透析，每隔24h换一次水，48h后，取出透析袋中的溶液，55℃真空干燥后，分别测多糖含量。
为了更高的说明本发明与现有技术相比的优点所在，下面给出本发明的研究工艺：
1仪器与试剂
超声循环提取机(TGCX2-2B，弘祥隆)，紫外-可见分光光度计(TU-U901，北京普析通用仪器有限责任公司)，恒温水浴锅(HWS-24，上海一恒科学仪器有限公司)，电子天平(XS105DU， 梅特勒-托利多)，真空干燥箱(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)，旋转蒸发仪(R-3，BUCHI)。
熟地黄、白术、党参、麦冬、五味子、附子、牛膝(广东省药材公司中药饮片厂)，大孔树脂(AB-8，天津瑞欧生物科技有限公司)，葡萄糖(sigama)，苯酚，浓硫酸，过氧化氢，活性炭等均为国产分析纯。牛血清白蛋白(纯度≥96％，sigama)，考马斯亮蓝，氯仿，正丁醇等均为国产分析纯。
2.方法与结果
2.1多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法。
2.1.1对照品贮备液的配制
精密称取葡萄糖对照品20.92mg至100mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度，即得浓度为0.2092mg/mL的葡萄糖贮备液。
2.1.2标准曲线的绘制
分别精密量取对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL具塞试管中，补加水至2.0mL，摇匀。加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，置沸水浴中保温15min，取出置冰浴中冷却至室温。另取蒸馏水2.0mL置具塞试管中，加入相应的试剂用上述方法处理，制备空白溶液，在490nm处测定吸光度，用吸光度对葡萄糖质量进行线性回归，得回归方程：Y＝7.404X+0.022(r＝0.9997)
2.1.3样品的含量测定
取供试品约10mg，精密称定于50mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度。精密量取0.4mL于10mL具塞试管中，补加水至2.0mL，按2.2.2项下方法处理，并测定。
2.2蛋白含量的测定
采用考马斯亮蓝法。
2.2.1考马斯亮蓝G-250溶液的配制
称取考马斯亮蓝G-25025mg于250mL量瓶中，加12.5mL95％乙醇溶解，摇匀，加入25mL85％H3PO4，摇匀后，加入稀释至刻度，5000rpm×10min离心取上清液备用。
2.2.2对照品贮备液的配制
精密称取牛血清白蛋白10.51mg至50mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度，即得浓度为0.2102mg/mL的牛血清白蛋白贮备液。
2.2.3标准曲线的绘制
分别精密量取对照品贮备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于25mL具塞试管中，补加水至2.0mL，摇匀。加入考马斯亮蓝G-250溶液10mL，摇匀，室温放置30min，以蒸馏水为空白，在595nm波长处测定吸光度，用吸光度对牛血清白蛋白的质量进行线性回归，得回归方程：Y＝2.298X+1.403(r＝0.993)
2.2.4供试品的制备及含量的测定
取粗多糖约10mg，精密称定于50mL量瓶中，加水溶解，摇匀，并定容至刻度。精密量取2mL于10mL具塞试管中，按2.2.3项下方法处理，测定并计算蛋白含量。
2.3提取
按全真一气汤配方比例称取药材饮片，共6剂，除熟地外，其余药材60℃干燥，粉碎为粗颗粒。熟地切成小段。采用超声提取法提取药材2次，每次8倍水提取30min(超声条件：超2s停2s，功率800w，室温)。合并提取液，用尼龙网(200目)粗滤，静置过夜后离心处理(5000rpm×10min)，得上清液，60℃旋转蒸发至药液的相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为80％，静置24h，5000rpm离心10min，沉淀用80％的乙醇洗涤一次后于60℃真空干燥得粗多糖A。分别按2.1，2.2项下方法测多糖、蛋白含量。结果见表1
2.4脱蛋白
取粗多糖A2.0g于三角瓶中，加水100mL溶解，摇匀，冰醋酸调节pH至5.5，加入木瓜蛋白酶3g，50℃，酶解5h，沸水浴灭活5min，5000rpm×10min离心除去沉淀。得粗多糖酶解液。采用Sevag法，在上述酶解液中加入其体积1/5的氯仿-正丁醇溶液，震荡30min，静置过夜，收集上层水相溶液，重复三次，分别照2.1，2.2项下方法测多糖及蛋白含量。结果见表1。
由表1可知，对全真一气汤粗多糖进行脱蛋白处理后，蛋白含量由9.83±0.23％下降到4.61±0.09％，但同时多糖的含量由44.18±1.02％下降到37.00±0.74％，结果表明，脱蛋白过程，多糖会有损失。
表1 脱蛋白对粗多糖的多糖含量及蛋白含量的影响(n＝3)
| 编号 | 多糖含量(％) | 蛋白含量(％) |
| 粗多糖A | 44.18±1.02 | 9.83±0.23 |
| 脱蛋白粗多糖B | 37.00±0.74 | 4.61±0.09 |
2.5除色素方法的考察
2.5.1色素检测方法
取粗多糖适量，配制成浓度为2mg/mL的溶液，溶液颜色为棕黄色，从互补色原理可知，当溶液的某种物质选择性的吸收可见光中的某种颜色的光时，溶液就会呈现出对应的互补色，由于麦冬多糖溶液为橙黄色，证明对其互补光蓝色有最大吸收，故选择450nm作为检测波长，测定多糖溶液除色素前后的吸光度，依据以下公式计算色素脱除率：
色素脱除率％＝×100％
2.5.2全真一气汤多糖除色素方法的比较取粗多糖适量，加水配制成浓度约为4mg/ml的溶液，平均分成12份，取9份用于除色素方法的比较，每组3个平行。
(1)大孔树脂AB-8静态吸附法脱色：用冰醋酸调节多糖溶液的pH至5.0，加入2g大孔树脂AB-8(重量百分比为5％)，在50℃水浴下搅拌2h，过滤后取在450nm波长处测定吸光值A，计算色素脱除率。取样20mL，60℃减压干燥后按2.2项下方法测定多糖含量。结果见表2，该法平均脱色率为48.32±1.05％。
(2)活性炭法脱色：用冰醋酸调节多糖溶液的pH至5.0，加入1.2g活性炭(重量百分比为3％)，在50℃水浴下搅拌1h，过滤后在450nm波长处测定吸光值A，计算色素脱除率。取样20mL，60℃减压干燥后按2.2项下方法测定多糖含量。结果见表2，该法平均脱色率为68.49±1.02％。
(3)H2O2法脱色：用NaOH溶液调节多糖溶液的pH至8.0，滴加H2O2(体积百分比为20％)，在50℃水浴下搅拌3h，过滤后在450nm波长处测定吸光值A，计算色素脱除率。取样20mL，60℃减压干燥后按2.2项下方法测定多糖含量。结果见表2，该法平均脱色率为68.98±0.69％。
由表2可知，H2O2法和活性炭法色素脱除率较大孔树脂法高，但同时多糖的破坏比较多，多糖含量下降较多，因此选择大孔树脂法脱色。
表2 全真一气汤多糖除色素方法比较(n＝3)
| 脱色方法 | 多糖含量(％) | A450nm | 色素脱除率(％) |
| 未脱色 | 37.00±0.94 | 1.190±0.005 | -- |
| 大孔树脂AB-8 | 39.63±1.08 | 0.615±0.013 | 48.32±1.05 |
| 活性炭 | 32.19±0.86 | 0.375±0.012 | 68.49±1.02 |
| H2O2 | 33.98±1.19 | 0.205±0.010 | 68.98±0.69 |
2.6多糖的精制
分别采用透析法对粗多糖A进行精制。
2.6.1透析
分别取粗多糖A50mg，加水制成浓度约为5mg/mL的溶液，将溶液装入透析袋中，封好两端，放入4000mL的水中透析，每隔24h换一次水，48h后，取出透析袋中的溶液，55℃真空干燥后，分别测多糖含量。
2.7多糖纯化工艺的确定
2.7.1脱蛋白对纯化工艺的影响
分别用透析法对粗多糖A，脱蛋白粗多糖B进行精制。测定多糖含量，结果见表3。
表3中，对比工艺1和3可知，通过透析法精制，粗多糖A的多糖含量上升了约13％，对比工艺2和4可知，脱蛋白后的粗多糖B的多糖含量上升了33.7％。
表3 脱蛋白对全真一气汤多糖纯化工艺的影响(n＝3)
| 编号 | 制备工艺 | 多糖含量(％) |
| 1 | 水提→醇沉 | 44.18±1.02 |
| 2 | 水提→醇沉→脱蛋白 | 37.00±0.74 |
| 3 | 水提→醇沉→透析 | 57.14±1.08 |
| 4 | 水提→醇沉→脱蛋白→透析 | 70.66±0.83 |
2.7.2除色素对纯化工艺的影响
采用透析法分别对脱蛋白粗多糖B和(脱蛋白+除色素)处理的粗多糖进行精制，测定多糖含量，结果见表4。
表4中，对比工艺1和2可知，除色素处理后，全真一气汤的多糖含量有小幅度的提高，对比工艺2和3可知，除色素后的多糖再经过透析处理后，多糖含量提高较多，达到87.63％。
表4 除色素对全真一气汤多糖纯化工艺的影响(n＝3)
| 编号 | 制备工艺 | 多糖含量(％) |
| 1 | 水提→醇沉→脱蛋白 | 37.00±0.74 |
| 2 | 水提→醇沉→脱蛋白→除色素 | 39.63±1.08 |
| 3 | 水提→醇沉→脱蛋白→透析 | 70.66±0.83 |
| 4 | 水提→醇沉→脱蛋白→除色素→透析 | 87.63±0.97 |
2.7.3纯化工艺的确定
根据表3，4结果，确定全真一气糖汤多糖的提取纯化工艺为：水提→醇沉→脱蛋白→除 色素→透析，该工艺条件下，可制备得到高纯度多糖，具体工艺依次如下：
本研究所采用的全真一气汤多糖的三种除色素方法，均为经过优化后所得最佳工艺条件。通过综合比较除色素率与多糖含量可见，活性炭与过氧化氢的脱色效果较好，但活性炭的吸附作用为无选择性吸附，多糖会因此而有所损失，而过氧化氢的强氧化性可能引起多糖结构的改变，故经这两种脱色方法处理后，多糖含量亦有所下降。大孔树脂AB-8静态吸附法色素的脱除率稍低于其他两种方法，但经该法处理后多糖含量有所提高，且该法操作简单，综合考虑认为适用于全真一气汤粗多糖的色素脱除。此外，表4结果表明：除色素虽然对多糖的含量影响较小，但先除色素，再经过透析，多糖含量最终能达到87.63±0.87％，由此可见除色素是全真一气汤多糖纯化工艺中非常重要的步骤。
由表1可知，对全真一气汤进行脱蛋白处理后，蛋白有效脱除的同时，多糖的含量也有所下降。但表4数据表明，脱蛋白处理后多糖含量下降比较多，但是通过透析处理后的多糖含量上升较高。结果说明，虽然脱蛋白处理本身并没有提高粗多糖中的多糖含量，但是这个步骤对于整个多糖的精制过程是必不可少的。
全真一气汤具有较显著的临床疗效，对其进行深入的作用机理研究，阐明其科学内涵，具有重要的临床意义。特别是对于其作用的物质基础，有必要进行深入研究。全真一气汤中多种药材含有多糖类成分，而现代研究亦证明，多糖类成分具有多种生理活性，如提高免疫力、抗病毒等。
Claims (9)
1.一种全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)按全真一气汤配方比例称取熟地黄、白术、人参、麦冬、五味子、附子、牛膝，除熟地外，其余药材干燥，粉碎；
2)将熟地切段，与步骤1)粉碎后的药材混合，用超声提取法提取药材1-3次，每次7-9倍水提取25-35min后粗滤，静置过夜后离心分离，取上清液；
3)将步骤2)中的上清液浓缩至相对密度为1.15-1.2，用乙醇调至药液乙醇含量为75-85％，静置后离心分离，取下层沉淀用乙醇洗涤后于55-65℃真空干燥得粗多糖A；
4)取步骤3)粗多糖A加水溶解，摇匀，酸调节pH至5-6，加入木瓜蛋白酶,在45-55℃，酶解4-6h，灭活，离心除去沉淀，取下层液得粗多糖酶解液B；
5)向步骤4)粗多糖酶解液B中加入其体积1/4-1/6的氯仿-正丁醇溶液，震荡，静置过夜，收集上层水相溶液，得到多糖溶液B；
6)取步骤5)多糖溶液B，加水配制成浓度为3-5mg/ml的溶液，调节多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔树脂在45-55℃水浴下搅拌1-3h，过滤的粗多糖B；
7)取步骤6)粗多糖B加水制成浓度为4-6mg/mL的溶液，将溶液装入透析袋中，封好两端，放入水中透析，每隔20-28h换一次水，48h后，取出透析袋中的溶液，55-65℃真空干燥即得精多糖。
2.据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤1)所述的干燥温度均为60℃。
3.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤2)所述的超声条件为在室温下超2s停2s，功率800w。
4.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤2)、步骤3)和步骤4)所述的离心条件均为5000rpm×10min。
5.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤3)所述的上清液浓缩是在60℃旋转蒸发至药液相对密度为1.15-1.2。
6.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤4)所述的酸为冰醋酸。
7.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，取步骤2)粗多糖A:水:木瓜蛋白酶的质量比是1：50:1.5。
8.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤4)所述的灭活是沸水浴灭活5min。
9.根据权利要求1所述的全真一气汤多糖的提取纯化的方法，其特征在于，步骤6)所述的大孔树脂是大孔树脂AB-8。
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| CN103301290A (zh) * | 2013-06-25 | 2013-09-18 | 广西医科大学 | 复方龙眼多糖免疫固本方剂及其制备方法 |
-
2014
- 2014-05-06 CN CN201410188742.1A patent/CN103992415B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101074158B1 (ko) * | 2008-04-07 | 2011-10-17 | 재단법인 한국원자력의학원 | 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 인삼다당체 조성물 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN105801723A (zh) * | 2016-04-12 | 2016-07-27 | 浙江大学 | 一种海洋硫酸多糖的快速纯化方法 |
Also Published As
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|---|---|
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