CN104950101A - 一种中药注射剂微量树脂的检查方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药注射剂微量树脂的检查方法，属于中药注射剂安全性评价领域。本发明方法分子筛原理先将中药注射剂中的大分子类物质进行不同程度地富集制备大分子富集液，用大分子富集液再进行检查，即用氯仿萃取获得残渣，再用冰醋酸溶液检查残渣的溶解性；为了有利于结果观察，对冰醋酸溶液还需进行离心处理，能检查到中药注射剂中的树脂存在，其灵敏度明显较《中国药典》方法高。通过调整富集比和样品体积可以方便地对检查灵敏度进行调整而用于具体中药注射剂的树脂检查，能够用于中药注射剂的安全性评价。

Description

一种中药注射剂微量树脂的检查方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射剂的检查方法，尤其涉及一种中药注射剂微量树脂的检查方法，属于中药注射剂安全性评价领域。

技术背景

中药注射剂最早产生于上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创，现已广泛应用于临床。2010年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收录有灯盏细辛等单方和复方注射剂。中药注射剂能提升药效、使某些中药的疗效能得到更好地发挥，在推进中药剂型发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的有效性问题(尽管作用机制尚不完全清除)，安全性依然是业界难题。

随着中药注射剂的广泛应用，不良反应不断发现，甚至致死性不良反应也屡有报道。近年来发生的“清开灵注射液事件”、“双黄连注射液事件”、“鱼腥草注射液事件”等说明中药注射剂的安全性不容忽视，受到业界甚至公众的广泛关注。

传统中药的疗效最早来自口服和外用，没有注射给药方式。大多中药注射剂的研发也源自口服剂的疗效，如清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液和灯盏细辛注射液。口服能够吸收的中药成分基本上都属于小分子物质，因为大分子物质不易吸收，或者需降解之后才能吸收，而降解产物吸收后不可能在机体重新组装成原来的大分子物质。

中药注射剂具有生物提取物的特征，目前的制备流程没有针对性的大分子物质去除工艺。因此，中药注射剂含有小分子物质，也含有少量或微量的大分子物质。大分子和小分子尚无统一的分子量界限，但学术界对于“分子量越大口服越难吸收”的观点深入人心。以2010年版《中国药典》二部收载的2271个药物(品种)为例，在治疗全身性疾病的口服化学药物中，分子量大于500的较少见，超过1000的则罕见(只有环孢素、维生素B12、腺苷钴胺、依托红霉素4个，但吸收不太理想)，超过3000的则没有。分子量与吸收的关系实际上已经在药物设计方面得到了广泛应用。一般认为中药注射剂中可能含有的蛋白质、鞣质(缩合鞣质)、多糖、核酸和树脂均视为大分子物质，2000年版《中国药典》也对其中的蛋白质、鞣质和树脂开始进行检查。因此，我们推测，基于传统口服剂上升而来的中药注射剂疗效来自所含的小分子物质，与分子量大于3000的物质几乎无关。

由于中药注射剂具有生物提取物的特征，因此在提取的过程中不可避免地带来一些生物大分子，比如植物蛋白质、核酸等，还有可能带入鞣质、树脂、多糖等大分子。这些大分子口服是不能直接吸收的，必须经过消化道的降解才可能以小分子吸收。蛋白质是抗原性最强的常见物质，而且分子量越大抗原性越强，越容易引起过敏反应或类过敏反应。据此推测，中药注射剂含有的微量蛋白质是导致过敏或类过敏等特有不良反应的主要原因，其他大分子如多糖、核酸、鞣质、树脂等也可能参与了这些不良反应。因此中药注射剂的安全性很大程度上取决于所含的大分子成分。对来自中药的大分子成分分析如下：

热原：多为细菌的细胞壁的脂多糖成分，分子量较大，能引起恒温动物发热、休克、甚至死亡。

蛋白质：多为植物蛋白，部分为动物蛋白或微生物蛋白。蛋白质类物质是抗原性较强的化学物质，能引起各种过敏反应(包括I、II、III、IV型)。由于与人的种属差异较大，中药注射剂含有的蛋白质类大分子的抗原性均较强。

鞣质：鞣质是引起中药注射剂注射后疼痛的主要物质之一。鞣质后蛋白质结合为更大的分子复合物后，可增强蛋白质的过敏性。

多糖：蛋白多糖或糖蛋白本身就具有很强的抗原性，一般高于原有的蛋白质。单纯的多糖也能够通过“免疫佐剂”效应增强免疫的作用，即也能增强过敏反应。

核酸：具有免疫调节作用，多通过“免疫佐剂”效应增强过敏反应。

树脂：是一类分子量较大的聚合物，可以引起疼痛，也可增强免疫反应。

现有中药注射剂的生产工艺一般都采用“醇水法”或“水醇法”制备中药注射剂的原料。“醇水法”主要是采用乙醇提取中药材，回收溶剂后再加水去除沉淀后制得；而“水醇法”则主要是采用水提取药材，适当浓缩然后用80％左右的乙醇沉淀，将上清液制备成原料。除此之外还有“酸碱法”等。然而，这些方法制得的原料均不同程度地含有大分子杂质，如含有蛋白质、多糖、核酸、鞣质、树脂等。对于蛋白质和鞣质，前期有人建立了灵敏的中药注射剂微量蛋白和鞣质检查方法。

因此，尽管《中国药典》已有树脂检查方法，为了能进一步从严控制中药注射剂中的大分子物质，仍需要开发一种方法，以便能更灵敏地检查中药注射剂中的微量树脂。

发明内容

因为中药注射剂中的树脂属于大分子类物质，我们利用分子筛原理先将中药注射剂中的大分子类物质进行不同程度地富集制备大分子富集液，用大分子富集液再进行检查，即用氯仿萃取获得残渣，再用冰醋酸溶液检查残渣的溶解性；为了有利于结果观察，对冰醋酸溶液还需进行离心处理。

本发明所述的一种中药注射剂微量树脂的检查方法，按以下步骤进行：

1)用截留一定分子量的分子筛按照一定比例富集中药注射剂原液中的大分子物质，制备大分子富集液；

2)取5mL的大分子富集液加一滴浓盐酸，如无沉淀则不再检查，即树脂检查阴性；

3)步骤2)如果有沉淀产生，则再取一份体积的大分子富集液加入氯仿进行充分萃取；

4)将萃取后的氯仿层分离挥干得残渣；

5)将残渣加入一定体积的冰醋酸充分振摇混匀，并转移到试管内，再加入冰醋酸1.5倍体积的水，然后振摇混匀得冰醋酸溶液；

6)将步骤5)获得的冰醋酸溶液进行离心后观察试管底部是否有沉淀，如有可见沉淀则树脂检查阳性。

对以上操作步骤进一步说明如下：

步骤1)中，中药注射剂原液指的是中药注射液或是注射用中药注射剂按所附使用说明书制备的溶液；分子筛的截留分子量是3k-30k；大分子富集液制备的截留比是2:1～10:1，即最少从2份体积中药注射剂原液中制备1份大分子富集液，最多从10份中药注射剂原液中制备1份大分子富集液。优选的，分子筛截留分子量是3k，截留比是10:1。

步骤3)中，大分子富集液的一份体积为0.5～10mL，萃取用氯仿的体积是大分子富集液体积的1～3倍。优选的，所用大分子富集液的较佳体积为5mL，萃取用氯仿的体积是10mL。

步骤5)，所用冰醋酸的体积为0.5～5mL。优选的，体积为2mL。

步骤6)，离心的离心力为500～10000g，离心时间为1～10分钟。优选的，离心力为3000g，离心10分钟。

本发明所述中药注射剂微量树脂的检查方法，即将中药注射剂原液中的大分子物质富集后再参照《中国药典》方法并在观察前进行离心即能检查到中药注射剂中的树脂存在，其灵敏度明显较《中国药典》方法高。通过调整富集比和样品体积可以方便地对检查灵敏度进行调整而用于具体中药注射剂的树脂检查，能够用于中药注射剂的安全性评价。

附图说明

图1本发明所述一种中药注射剂微量树脂的检查方法的流程示意图。

图2四种中药注射剂原液树脂检查的阴性结果：从左至右依次是清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液、灯盏细辛注射液。

图3四种中药注射剂经3k分子筛按10:1制备成大分子富集液后的树脂检查：清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液树脂检查阳性，从左至右依次是A清开灵注射液、B双黄连注射液、C丹参注射液、D灯盏细辛注射液。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但只是用于帮助理解本发明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，不对本发明构成任何限制。

实施例1  《中国药典》方法对四种中药注射剂原液进行树脂检查。

取四种上市中药注射液，即清开灵注射液(批号：100327.2)、双黄连注射液(批号：20100324)、丹参注射液(批号1005104)、灯盏细辛注射液(批号：20090830)，各5mL，加盐酸一滴，放置30min，可见沉淀析出，表明树脂检查可能阳性；另取注射液5mL，加10mL氯仿振摇萃取，取氯仿萃取液，挥干，残渣加2mL冰醋酸溶解，加3mL三蒸水，放置30min(操作到此是《中国药典》的树脂检查方法)或离心观察底部均未见沉淀生成(见表1和图2)，因此检查阴性。

表1  四种中药注射剂原液的树脂检查结果

注：“-”表示阴性；*实际上就是《中国药典》检查方法。

实施例2  参照《中国药典》方法放大10倍体积后对四种中药注射剂原液进行树脂检查。

取四种上市中药注射液，即清开灵注射液(批号：100327.2)、双黄连注射液(批号：20100324)、丹参注射液(批号1005104)、灯盏细辛注射液(批号：20090830)，各50mL，加盐酸10滴，放置30min，可见沉淀析出，表明树脂检查可能阳性；另取注射液50mL，加100mL氯仿振摇萃取，取氯仿萃取液，挥干，残渣加20mL冰醋酸溶解，加30mL三蒸水，放置30min(操作到此是放大10倍体积后的《中国药典》的树脂检查方法)或离心观察底部均未见沉淀生成(见表2)，因此检查阴性。

表2  四种中药注射剂原液的树脂检查结果

注：“-”表示阴性；*实际上就是参照《中国药典》检查方法，只是放大了检测体积。

实施例3  参照《中国药典》方法只放大取样体积后对四种中药注射剂原液进行树脂检查。

取四种上市中药注射液，即清开灵注射液(批号：100327.2)、双黄连注射液(批号：20100324)、丹参注射液(批号1005104)、灯盏细辛注射液(批号：20090830)，各50mL，加盐酸1滴，放置30min，可见沉淀析出，表明树脂检查可能阳性；另取注射液50mL，加10mL氯仿振摇萃取，取氯仿萃取液，挥干，残渣加2mL冰醋酸溶解，加3mL三蒸水，放置30min(操作到此是《中国药典》的树脂检查方法，只是放大了取样体积)或离心观察底部均未见沉淀生成(见表3)，因此检查阴性。

表3  四种中药注射剂原液的树脂检查结果

注：“-”表示阴性；*实际上就是《中国药典》检查方法，只是放大了取样体积。

实施例4  用本发明所述中药注射剂微量树脂的检查方法对四种中药注射剂进行树脂检查

取四种上市中药注射剂原液，即清开灵注射液(批号：100327.2)、双黄连注射液(批号：20100324)、丹参注射液(批号1005104)、灯盏细辛注射液(批号：20090830)，分别用截留分子量3k、10k、30k的分子筛按照10:1制备大分子富集液(即从10份中药注射剂原液制备1份大分子富集液)。取各种大分子富集液5mL加入到试管中，3000r/min离心10min未见沉淀。然后再取各大分子富集液5mL，加盐酸一滴，放置30min，可见沉淀析出，表明树脂检查可能阳性。另再取各大分子富集液5mL，加10mL氯仿萃取，取氯仿萃取液，挥干，残渣加2mL冰醋酸溶解，加3mL三蒸水，放置30min未见沉淀(表4)，但3000r/min离心10min后清开灵注射液、双黄连注射液、丹参注射液可见沉淀(表4，图3)，即检查阳性。其中只有“灯盏细辛注射液”未能检查到树脂，表明灯盏细辛注射液可能存在的树脂要比另三种注射剂少很多。

由于用《中国药典》方法无法检查到这四种上市中药注射剂的树脂，而用本发明所述中药注射剂微量树脂的检查方法，即将中药注射剂原液中的大分子物质富集后再参照《中国药典》方法并在观察前进行离心即能检查到中药注射剂中的树脂存在，因此灵敏度明显较《中国药典》方法高。很明显，通过调整富集比和样品体积可以方便地对检查灵敏度进行调整而用于具体中药注射剂的树脂检查。

表4四种中药注射剂富含大分子注射液树脂检查结果

注：“+”表示阳性，“++”表示强阳性；“-”表示阴性。

因此，本发明虽然以《中国药典》方法为基础，但在采取富含大分子样品替代中药注射剂原液后，并结合离心观察，该发明在中药注射剂微量树脂检测灵敏度方面取得了意想不到的效果；且该效果不是简单地用放大检测体系或放大取样体系就能取得的。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出的若干改进、润饰、等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1)用截留一定分子量的分子筛按照一定比例富集中药注射剂原液中的大分子物质，制备大分子富集液；

2)取5mL的大分子富集液加一滴浓盐酸，如无沉淀则不再检查，即树脂检查阴性；

3)步骤2)如果有沉淀产生，则再取一份体积的大分子富集液加入氯仿进行充分萃取；

4)将萃取后的氯仿层分离挥干得残渣；

5)将残渣加入一定体积的冰醋酸充分振摇混匀，并转移到试管内，再加入冰醋酸1.5倍体积的水，然后振摇混匀得冰醋酸溶液；

6)将步骤5)获得的冰醋酸溶液进行离心后观察试管底部是否有沉淀，如有可见沉淀则树脂检查阳性。

2.根据权利要求1所述的中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，步骤1)所述的中药注射剂原液是中药注射液或是注射用中药注射剂按所附使用说明书制备的溶液。

3.根据权利要求1所述的中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，步骤1)所述分子筛的截留分子量为3k-30k。

4.根据权利要求1所述的中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，步骤1)制备大分子富集液的截留比是2:1～10:1；即，最少从2份体积中药注射剂原液中制备1份大分子富集液，最多从10份中药注射剂原液中制备1份大分子富集液。

5.根据权利要求1所述的中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，步骤3)所用大分子富集液的一份体积为0.5～10mL，萃取用氯仿的体积是大分子富集液体积的1～3倍。

6.根据权利要求1所述的中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，步骤5)所用冰醋酸的体积为0.5～5mL。

7.根据权利要求1所述的中药注射剂微量树脂的检查方法，其特征在于，步骤6)离心的离心力为500～10000g，离心时间为1～10分钟。