CN103169795A

CN103169795A - 清开灵注射剂安全性提高方法

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Publication number: CN103169795A
Application number: CN2011104386394A
Authority: CN
Inventors: 段为钢; 柯瑾; 云宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-25
Filing date: 2011-12-25
Publication date: 2013-06-26

Abstract

一种能够提高清开灵注射剂安全性的方法，其特征是在获得清开灵注射剂成品前增加一道大分子截留工艺，去除大分子物质，从而提高清开灵注射剂的安全性。采用本发明能在不明显改变原清开灵注射剂疗效的前提下增加中药注射剂的安全性。

Description

清开灵注射剂安全性提高方法

技术领域

本发明涉及中药注射剂生产方法领域，应用于清开灵注射剂的生产，以在保证有效性的前提下提高其安全性。

背景技术

中药注射剂最早产生于上世纪四十年代，由钱信忠等学者开创，现已广泛应用于临床。2010年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）一部就收录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵等单方和复方注射剂。中药注射剂能提升药效、使某些中药的疗效得到更好地发挥，在推进中药剂型发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的有效性问题（尽管作用机制尚不完全清除），安全性依然是业界难题。

清开灵注射剂是根据安宫牛黄丸处方研制的现代中药制剂，含珍珠母、栀子、水牛角、板蓝根、金银花等成分，具有清热解毒，化痰通络，醒神开窍之功效。用于热病神昏，中风偏瘫，神志不清，亦可用于急、慢性肝炎，乙型肝炎，上呼吸道感染，肺炎，高烧，以及脑血栓形成、脑出血见上述证候者。现有清开灵注射液和注射用清开灵（粉针剂）两种注射剂，国内有多家药厂生产，临床已使用多年。

随着清开灵注射剂的广泛应用，不良反应不断发现，甚至致死性不良反应也屡有报道。根据已有公开资料分析，清开灵注射剂的安全性事件与超敏反应有关，甚至直接表现为过敏性休克死亡。说明清开灵注射剂的安全性不容忽视，受到业界甚至公众的广泛关注。

根据公开资料分析，中药的疗效最早来自口服和外用，没有注射给药方式。清开灵注射剂的研发也源自口服剂安宫牛黄丸处方。相比之下，安宫牛黄丸和处方相似的其他口服制剂很少发生安全性事件；究其原因，因为口服制剂能减少甚至避免大分子物质的直接吸收，而大分子物质多具有较强的抗原性，直接进入机体容易引发安全性事件。

清开灵注射剂具有生物提取物的特征，目前的制备流程没有大分子物质去除工艺。因此，清开灵注射剂包含有小分子物质和小量或微量的大分子物质。尽管大分子和小分子尚无统一的分子量界限，但学术界对于“分子量越大口服越难吸收”的观点深入人心。以2010年版《中国药典》二部收载的2271个药物（品种）为例，在治疗全身性疾病的口服化学药物中，分子量大于500的较少见，超过1000的则罕见（只有环孢素、维生素B12、腺苷钴胺、依托红霉素4个，但吸收不太理想），超过3000的则没有。分子量与吸收的关系实际上已经在药物设计方面得到了广泛应用。一般认为蛋白质、鞣质（缩合鞣质）、多糖、核酸和树脂均视为大分子物质，2000年版《中国药典》也开始对其中的蛋白质、鞣质和树脂开始进行检查。因此，我们推测，清开灵注射剂的疗效来自所含的小分子物质（因为口服有效，口服能吸收小分子但不能直接吸收大分子），与分子量大于3000的物质几乎无关。

由于清开灵注射剂具有生物提取物的特征，因此在提取的过程中不可避免地带来一些生物大分子物质，比如植物蛋白质、核酸等，还有可能带入鞣质、树脂、多糖等大分子物质。这些大分子物质口服是不能直接吸收的，必须经过消化道的降解才可能以小分子吸收。蛋白质是抗原性最强的常见物质，而且分子量越大抗原性越强，越容易引起过敏反应。据此推测，清开灵注射剂含有的微量蛋白质是导致过敏或类过敏等特有不良反应的主要原因，其他大分子如多糖、核酸、鞣质、树脂等也可能参与了这些不良反应。因此清开灵注射剂的安全性很大程度上取决于所含的大分子成分。来自清开灵注射剂的大分子化学成分对人体影响较大的主要有以下四类。

蛋白质：多为植物蛋白，部分为动物蛋白（来自处方中的水牛角）或微生物蛋白（中药材不是无菌的）。蛋白质类物质是抗原性较强的化学物质，能引起各种过敏反应（包括I、II、III、IV型）。这些蛋白质与人的种属差异大，抗原性均较强。

鞣质：鞣质是引起中药注射剂注射后疼痛的主要物质之一。鞣质和蛋白质结合为更大的分子复合物后，可增强蛋白质的过敏性。

多糖：蛋白多糖或糖蛋白本身就具有很强的抗原性，一般高于原有的蛋白质。单纯的多糖能够通过“免疫佐剂”效应增强免疫的作用，即也能增强过敏反应。

核酸：具有免疫调节作用，多通过“免疫佐剂”效应增强过敏反应。

现有清开灵射剂的生产工艺中，原料一般都采用“醇水法”或“水醇法”制备。“醇水法”主要是采用乙醇提取中药材，回收溶剂后再加水去除沉淀后制得；而“水醇法”则主要是采用水提取药材，适当浓缩后然后用80%左右的乙醇沉淀，将上清液制备成原料。然而，这些方法制得的原料均不同程度地含有大分子杂质，如含有蛋白质、多糖、核酸、鞣质等。为了去除鞣质，传统工艺利用蛋白质沉淀鞣质的性质以“皮粉法”去除。在中药注射剂制备的后期工艺中，为了保障活性成分不被破坏，几乎都采用膜过滤的方法除菌。

然而，通过对上市清开灵注射剂的研究发现，通过较灵敏的方法仍能检测到大分子蛋白质和鞣质的存在，有些注射剂的蛋白质含量甚至高达10μg/ml（此值不能被《中国药典》一部规定的法定方法检测出），由于清开灵注射剂（液）的使用剂量一次可高达20ml，可能进入体内的蛋白质足以引起过敏反应。在实验条件下，我们发现皮粉等蛋白质对鞣质的沉淀能力有限，不能完全去除鞣质，在一定条件下，蛋白质和鞣质可以共存。在实验条件下，我们还发现80%的乙醇至少可以溶解20μg/ml的蛋白质（以牛血清白蛋白计）。而清开灵注射剂的最后一道工艺是超滤除菌，显然不能去除大分子物质。

因此，为了提高清开灵注射剂的安全性，去除大分子物质是必然的选择。

发明内容

作为用于全身治疗的清开灵注射剂，大分子物质很难吸收产生全身作用；相反，如果直接进入机体反而可能导致安全性问题。本发明在传统清开灵注射剂的生产工艺中引入一道大分子截留工艺，去除一定分子量以上的大分子物质，这样在保障原有清开灵注射剂活性成分改变不大的情况下，去除中药注射剂中的大分子物质，以提高清开灵注射剂的安全性。

本发明中采用截留分子量为3k~30k的膜，材质不限；截留的方式可以采用正压，也可以采用负压。所采用截滤膜的较佳截留分子量是10k。

附图说明

图1为清开灵注射液经截滤膜处理后的外观变化（试管从左至右编号为Q0、Q1、Q2、Q3、Q1上、Q2上、Q3上）：富含大分子注射液（Q1上、Q2上、Q3上）的颜色较正常注射液（Q0）深，而去大分子注射液Q1的颜色较正常注射液Q0浅，Q2和Q3比Q0略浅，表明去大分子注射液的外观质量得到了改善。Q0：清开灵注射液原液；Q1：清开灵注射液经3k分子筛处理去大分子注射液液；Q2：清开灵注射液经10k分子筛处理去大分子注射液液；Q3：清开灵注射液经30 k分子筛处理去大分子注射液液；Q1上：清开灵注射液经3k分子筛处理后富含大分子注射液液；Q2上：清开灵注射液经10k分子筛处理后富含大分子注射液液；Q3上：清开灵注射液经30 k分子筛处理后富含大分子注射液液。

图2为去大分子清开灵注射液的蛋白含量检查结果：采用PVDF膜滤过吸附法检测，吸附孔直径2mm，吸附体积5ml，采用考马斯亮蓝染色，颜色越深表明蛋白质越多。Q0：清开灵注射液原液；Q1：清开灵注射液经3k分子筛处理去大分子注射液液；Q2：清开灵注射液经10k分子筛处理去大分子注射液液；Q3：清开灵注射液经30 k分子筛处理去大分子注射液液。

图3为去大分子清开灵注射液的缩合鞣质含量检查结果：采用蛋清包被PVDF膜滤过吸附法检测，吸附孔直径2mm，吸附体积5ml，缩合鞣质有颜色直接观察，颜色越深表明缩合鞣质越多。Q0：清开灵注射液原液；Q1：清开灵注射液经3k分子筛处理去大分子注射液液；Q2：清开灵注射液经10k分子筛处理去大分子注射液液；Q3：清开灵注射液经30 k分子筛处理去大分子注射液液。

图4为清开灵注射液原液（Q0）指纹图谱。

图5为经3k截滤膜处理后去大分子清开灵注射液（Q1）指纹图谱。

图6为经10k截滤膜处理后去大分子清开灵注射液（Q2）指纹图谱。

图7为经30k截滤膜处理后去大分子清开灵注射液（Q3）指纹图谱。

图8为两种清开灵注射液（Q0和Q2）对LPS发热家兔体温的影响（n=3）：“清开灵”表示清开灵注射液原液（Q0）；“处理”表示经10k分子筛去大分子的清开灵注射液（Q2）；“0.75”、“1.5”、“3”分别指给药体积。

具体实施方式

实施示例1 用截留分子量为3k、10k和30k的截滤膜去除上市清开灵注射液的大分子物质。

清开灵注射液购自市场（厂家略），批号：100327.2，采用离心方式截留分子量为3k、10k和30k的的清开灵注射液，得到7份样品，分别为“Q0”、“Q1”、“Q2”、“Q3”、“Q1上”、“Q2上”和“Q3上”。“Q0”为正常的中药注射液A；“Q1”为经3k截滤膜去大分子后的注射液；“Q2”为经10k截滤膜去大分子后的注射液；“Q3”为经30k截滤膜去大分子后的注射液；“Q1上”为3k截滤膜截留获得的富含大分子注射液，来自5倍体积的原注射液；“Q2上”为10k截滤膜截留获得的富含大分子注射液，来自10倍体积的原注射液；“Q3上”为30k截滤膜截留获得的富含大分子注射液，来自10倍体积的原注射液。将获得的“Q0”、“Q1”、“Q2”、“Q3”、“Q1上”、“Q2上”和“Q3上”进行比较，发现“Q1上”、“Q2上”和“Q3上”颜色均很深，而“Q1”、“Q2”和“Q3”颜色均较浅（见图1），表明去大分子能提高清开灵注射液的外观质量。采用PVDF膜过滤截留吸附法（5ml体积）检测发现，普通清开灵注射剂含有较多的蛋白质（5-10μg/ml），而经过截滤膜去大分子处理后，蛋白质斑点明显变弱（图2）。采用蛋清包被PVDF膜过滤截留吸附法（5ml体积）检测发现，普通清开灵注射剂含有较多的缩合鞣质（约0.1mg/ml），而经过截滤膜去大分子处理后，缩合鞣质斑点明显变弱（图3）。

实施示例2 分析截留大分子物质后清开灵注射液的物质含量变化。

中药注射剂HPLC指纹图谱的相似性是衡量不同批次中药注射剂质量一致性的标准之一。本实施示例采用HPLC指纹图谱检测去大分子后指纹图谱的相似性，如果指纹图谱高度相似则表明经此处理方式得到的去大分子清开灵注射剂物质基础基本不变。

注射用清开灵购自市场（厂家略），批号：110324.2，按说明书溶解后采用加压过滤方式分别经截留分子量为3k、10k和30k的注射液，由此得到7份样品，分别为“Q0”、“Q1”、“Q2”、“Q3”、“Q1上”、“Q2上”和“Q3上”。“Q0”为正常的中药注射液A；“Q1”为经3k截滤膜去大分子后的注射液；“Q2”为经10k截滤膜去大分子后的注射液；“Q3”为经30k截滤膜去大分子后的注射液；“Q1上”为3k截滤膜截留获得的富含大分子注射液，来自5倍体积的原注射液；“Q2上”为10k截滤膜截留获得的富含大分子注射液，来自10倍体积的原注射液；“Q3上”为30k截滤膜截留获得的富含大分子注射液，来自10倍体积的原注射液。

将“Q0”、“Q1”、“Q2”、“Q3”四个样品进行HPLC指纹图谱分析，发现其中三个样品的指纹图谱相似度较高（参见图4~图7）。进一步定量考察发现，“Q2”和“Q3”指纹图谱中的主要指纹峰与“Q0”相比，改变度<5%（表1），表明经10k和30k截滤膜去除大分子后，物质基础未发生明显变化，提示疗效无明显变化。如果将正常注射液为参照，用相对色谱系数（

）比较相同色谱条件下不同处理样品的差别（参见表2），则发现“Q1”（即经3k分子筛处理的注射液）成分丢失较多，而“Q2”、“Q3”则丢失很少，少于5%，考虑到Q2去大分子成分较Q3彻底，因此认为Q2能在保持原有小分子的同时去除了较多的大分子物质，也就是说清开灵注射剂经10k分子筛处理后，能够保持小分子物质基础基本不变。

附指纹图谱色谱条件：

色谱柱：NUDEOSIL-C18，4.6 mm × 250mm，5μm；流动相：(A)甲醇-(B) 0.5％醋酸，梯度洗脱：0min：10％甲醇，50min：100％甲醇，65min：100％甲醇；检测波长：255 nm；流速为1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量：20 μL。

表1 清开灵注射液指纹峰相似度。

保留时间	Q0面积	Q1面积	Q1/Q0	Q2面积	Q2/Q0	Q3面积	Q3/Q0
								3.073	8439839	5152930	0.611	8322011	0.986	8237395	0.976
5.205	3630490	7773042	2.141	3584630	0.987	3587338	0.988
								13.813	5340525	6087597	1.140	5239044	0.981	5175528	0.969
24.658	84731662	28706556	0.339	81169503	0.958	80165581	0.946

表2 清开灵注射液的相对色谱系数。

编号	处理方式	总峰面积	固体物质浓度（g/ml）	相对色谱系数
					Q0	原液	102142516	0.0416	1.000
Q1	3k	47720125	0.0311	0.625
					Q2	10k	98315188	0.0391	1.024
Q3	30k	97165842	0.0404	0.980

实施示例3 分析截留大分子物质后清开灵注射液的解毒有效性变化。

清热解毒是清开灵注射剂的主要药理功效，表现为清开灵注射剂具有降低发热动物体温的作用。细菌脂多糖LPS（1μg/kg）能诱发家兔发热，可导致家兔体温升高2.5℃，约1小时到高峰，维持约4小时，然后体温趋向恢复。以普通清开灵注射剂对照，考察去大分子注射剂降低发热家兔体温的作用。观察发现，普通清开灵注射剂和非去大分子注射剂均有一定的体温降低作用，并有大体的量效相关性。经多因素方差分析，去大分子注射剂的清热作用总体上略优于原注射液（P<0.05）。参见图8。

实施示例4 分析截留大分子量后富含大分子清开灵注射液的安全性。

由于本发明采用上市清开灵注射剂，因此均为符合当前《中国药典》的合格产品。考虑到方法的灵敏性，采用药典方法（药典方法采用动物实验法，但动物实验的灵敏性有限）直接检测去大分子清开灵注射剂很难获得安全性更高的阳性结果。为此，我们提出如果富含大分子注射液的安全性较低，则表明去除大分子物质后的注射剂则安全性得到进一步提高。

参照2010年版《中国药典》一部附录91进行异常毒性检查。按照附录91要求配制以上7种来自清开灵注射剂的样品，取符合要求的35只小鼠随机分为5组，每只小鼠腹腔注射0.5ml，观察20分钟，结果发现注射“Q0”、“Q1”、“Q2”、“Q3”样品的小鼠未见明显变化，而注射了“Q1上”、“Q2上”和“Q3上”样品的小鼠分别有3、5、4只发生扭体反应（1~5次）。表明富含大分子组分清开灵注射液有较大的刺激性，因而安全性较低，从而间接表明去除大分子物质后的注射剂安全性得到提高。

Claims

1.一种提高清开灵注射剂安全性的方法，其特征是在清开灵注射剂获得成品前采用特定大分子截滤膜去除分子量大于一定值的大分子物质。

2.根据权利要求1所描述的清开灵注射剂安全性提高方法，所用大分子截滤膜的截留分子量为3 k~30 k，以10 k较佳。

3.根据权利要求1所描述的清开灵注射剂安全性提高方法，可以采用正压方式和负压方式截留大分子物质。