CN102813907B - 一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗脑血管意外后遗症药物组合物及其制备方法和应用。本发明的如意珍宝药有效部位物组合物是由挥发油包合物，总蛋白水解物，红花总黄酮提取物，荜茇总生物碱提取物，人工牛黄包合物，人工麝香包合物、适宜制成微丸剂的基质和增溶剂制成。在原如意珍宝丸基础上，对组方进行了精炼，在保证疗效的前提下大大减少了用药量，服用方便。对组方中药材进行了提取精制，制备了其有效部位，可根据临床需要，开发成各种制剂。
Description
技术领域
发明涉及一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种如意珍宝药物组合物的制备方法和应用。
背景技术
随着社会的进步，人们的物质生活和文化生活不断改善，生活节奏加快和某些新的生活方式的出现，导致脑血管意外的发病率不断提高。
脑血管意外是由高血压和动脉硬化所引起脑血管损害的一种疾病，可分为出血性中风、缺血性中风两类。脑溢血和蛛网膜下腔出血属出血性中风；脑栓塞和脑血栓形成属于缺血性中风。脑血管意外后遗症，是指脑出血、脑血栓形成、脑梗塞、蛛网膜下腔出血等度过急性期后，出现肢体功能障碍、语言障碍、疼痛等症候群，其中最常见的是肢体半瘫。该病随着年龄的增长，发病率也升高，常见于中、老年人，发病率、致残率较高，严重危害人们身体健康。
西医在治疗出血性脑血管意外方面主要采取以下措施：适当控制血压，降低颅内压，止血，保护脑细胞等。
西医对缺血性脑血管意外的处理方法主要有：改善微循环，用丹参、川穹；血管扩张药，如烟酸、葛根针；抗凝疗法，用肝素、新抗凝等。
出血在50ml以上，采用手术治疗，开颅吸出或取出瘀血。到目前为止，经上述方法治疗，很少治愈，多留有后遗症。
中医认为脑血管意外是以整齐亏虚，饮食、情志、劳倦内伤等引起气血逆乱产生风、火、痰、瘀，导致脑脉痹阻或血瘀脑脉之外为基本病机。治疗后遗症常用大活络丸，华佗再造丸，祛风活络，，不知是脑动脉血管破裂出血或血栓形成而至，这些后遗症病人中，有的长期卧床不起，生活不能自理，病情稍轻者也需坐轮椅或拄拐杖，手脚运动障碍，成终身后遗症。
传统藏药如意珍宝丸起源于公元十五世纪，并沿用至今，现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准藏药》第一册，标准编号为WS3-BC-0314-95。经临床验证，如意珍宝丸对脑血管意外后遗症有很好的止痛效果，且组方综合考虑了患者的生理、病理特点，标本兼治，也未见明显毒副作用。
但如意珍宝丸由30味药材组方而成，药味含量多，在制剂生产、加工中有诸多不便。因此，结合植物化学成分研究和对谷氨酸致PC12细胞损伤的影响试验研究，对神经病理性痛重新辩证，在原如意珍宝丸组方基础上进行精炼，得到一种组方简单，疗效确切的新的治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，并提供这种药物组合物有效部位的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，所述药物组合物的重量份组成为：挥发油包合物30-60份，总蛋白水解物0.5-3份，红花总黄酮提取物1-8份，荜茇总生物碱提取物0.1-3份，人工牛黄包合物3-10份，人工麝香包合物3-10份；
一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，所述药物组合物的重量份组成优选为：挥发油包合物38份，总蛋白水解物1份，红花总黄酮提取物2.5份，荜茇总生物碱提取物0.3份，人工牛黄包合物5.5份，人工麝香包合物5.5份；
一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，所述药物组合物的重量份组成还可以优选为：挥发油包合物45份，总蛋白水解物1.5份，红花总黄酮提取物3.2份，荜茇总生物碱提取物0.6份，人工牛黄包合物5份，人工麝香包合物5份；
一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，所述药物组合物的重量份组成还可以优选为：挥发油包合物50份，红花总黄酮提取物3份，荜茇总生物碱提取物0.5份，总蛋白水解物1.2份，人工牛黄包合物5份，人工麝香包合物5份；
所述药物组合物的有效组分制备方法为：
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的4~10倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油3~6h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发油溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比4-8%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:4-8g，搅拌条件下，保持温度40-60℃，搅拌2～4h，0-4℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40-60℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的4-10倍的1-4mol/L的硫酸溶液，60-90℃水解4-12小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材0.5-2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏12-48小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数50-70%的乙醇为溶剂，50-70℃温浸提取1-4次，每次提取0.5-2小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的6-10倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5-2g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附4-10小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积4-10倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积4-10倍量的体积分数50-80%的乙醇洗脱，收集体积分数50-80%醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5-2g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.05-1.15的浓缩液，在进风口温度180℃，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取1-3次，每次1-3小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的3-8倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.10-1.20的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附5-12小时，用水洗脱至无色后，用质量分数1-5%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入1-4重量倍的β-环糊精，研磨包合2-5小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入1-4重量倍的β-环糊精，研磨包合2-5小时，得人工麝香包合物F；
（7）上述步骤（1）至（6）制得的挥发油包合物A、水解物B、红花总黄酮C、荜茇总生物碱D、人工牛黄包合物E、人工麝香包合物F混匀，得一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物。
加入常规辅料，按照常规工艺制备成药学上可接受的任何一种剂型，如片剂、胶囊剂、浓缩丸、颗粒剂、滴丸剂、微丸等。
所述辅料包括溶剂、稀释剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、基质中的一种或几种的组合。
所述药物组合物的有效组分制备方法优选为：
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mo l/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mo l/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180℃，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F；
（7）上述步骤（1）至（6）制得的挥发油包合物A、水解物B、红花总黄酮C、荜茇总生物碱D、人工牛黄和麝香的β-环糊精包合物E混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成微丸。
本发明治疗脑血管意外后遗症药物组合物的质量检测方法包括如下含量测定中的一种或几种：
挥发油含量测定
取本品挥发油包合物适量，加无水乙醇制成每l ml含2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取如意珍宝挥发油对照品，加无水乙醇制成每l ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法（附录W E)试验，以聚乙二醇(PEG-20M)毛细管柱，程序升温；初始温度50°C，保持3分钟，以每分钟25℃的速率升温至200℃，保持1分钟；进样口温度为200℃，检测器温度为220℃，分流比为20：1。分别取对照品溶液与供试品溶液各ll,注入气相色谱仪。供试品溶液色谱中应呈现与对照品溶液色谱峰保留时间相一致的色谱峰。
照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录ⅩD)测定，本品挥发油包合物应含挥发油不得少于17%。
总氨基酸含量测定
对照品溶液的制备精密称取L-精氨酸对照品5.02mg，置50ml容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含L-精氨酸100.4μg）。
标准曲线的制备精密量取L-精氨酸对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加入水至6.0ml，加磷酸盐缓冲液(pH8.0)0.5ml，再加3%茚三酮乙醇溶液0.5ml，摇匀，置沸水浴中加热15mi n，取出，放冷，分别加入蒸馏水至刻度，摇匀，以第1份为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在568nm波长处测定吸收度。以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
测定法取总蛋白水解物约0.1g，精密称定，置25ml量瓶中，加水使溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液2.0ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中L-精氨酸的含量，计算，即得。
本品总蛋白水解物总蛋白含量以含L-精氨酸（C6H14N4O2）计不得少于50.0%。红花总黄酮含量测定
对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5.25mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含芦丁0.21mg）。
标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加入水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以第1份为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在510nm波长处测定吸收度。以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
测定法取总黄酮提取物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液3.0ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的含量，计算，即得。
本品红花总黄酮含量以芦丁（C27H30O16）计不得少于70.0%。荜茇总生物碱含量测定
取荜茇总生物碱提取物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加入乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀，加入活性炭1g，振摇脱色10min，滤过，精密量取续滤液5ml至锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴定至黄色。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于5.71mg的胡椒碱（C17H19NO3）。
本品荜茇总生物碱含量以胡椒碱（C17H19NO3）计不得少于60.0%。
本发明重量份和体积份的关系为g/ml或kg/L。
本发明的特点是以植化成分为物质基础，以对谷氨酸致PC12细胞损伤的影响试验为参考，对脑血管意外后遗症重新辩证，在原如意珍宝丸基础上，对组方进行了精炼，在保证疗效的前提下大大减少了用药量，服用方便。对组方中药材进行了提取精制，制备了其有效部位，可根据临床需要，开发成各种制剂。
具体实施方式
下述实施例和实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实施例4-6药物组合物组分的重量份配比如下：
挥发油包合物38份，总蛋白水解物1份，红花总黄酮提取物2.5份，荜茇总生物碱提取物0.3份，人工牛黄包合物5.5份，人工麝香包合物5.5份。
作为对比用的原市售如意珍宝丸为青海金诃藏药药业股份有限公司产品，
批号：20110420。
实施例1、本发明的治疗脑血管意外后遗症的药物有效部位组合物
挥发油包合物38份 总蛋白水解物1份
红花总黄酮提取物2.5份 荜茇总生物碱提取物0.3份
人工牛黄包合物5.5份 人工麝香包合物5.5份。
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mo l/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mo l/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F。
实施例2、本发明的治疗脑血管意外后遗症的药物有效部位组合物
挥发油包合物45份 总蛋白水解物1.5份
红花总黄酮提取物3.2份 荜茇总生物碱提取物0.6份
人工牛黄包合物5份 人工麝香包合物5份。
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mo l/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mo l/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F。
实施例3、本发明的治疗脑血管意外后遗症的药物有效部位组合物
挥发油包合物50份 总蛋白水解物3份
红花总黄酮提取物0.5份 荜茇总生物碱提取物1.2份
人工牛黄包合物5份 人工麝香包合物5份。
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mol/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F。
实施例4、一种治疗脑血管意外后遗症的药物有效部位组合物微丸的制备
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mo l/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180℃，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F；
（7）上述步骤（1）至（6）制得的挥发油包合物A、水解物B、红花总黄酮C、荜茇总生物碱D、人工牛黄和麝香的β-环糊精包合物E混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成微丸。
实施例5、一种治疗脑血管意外后遗症的药物有效部位组合物胶囊的制备
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mo l/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mo l/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F；
（7）上述步骤（1）至（6）制得的挥发油包合物A、水解物B、红花总黄酮C、荜茇总生物碱D、人工牛黄和麝香的β-环糊精包合物E混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制备成胶囊剂。
实施例6、一种治疗脑血管意外后遗症的药物有效部位组合物片剂的制备
（1）挥发油包合物：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发A溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物A；
（2）总蛋白水解物：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mo l/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得水解物B；
（3）红花总黄酮提取物：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180℃，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮C；
（4）荜茇总生物碱提取物：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱D；
（5）人工牛黄包合物：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物E；
（6）人工麝香包合物：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物F；
（7）上述步骤（1）至（6）制得的挥发油包合物A、水解物B、红花总黄酮C、荜茇总生物碱D、人工牛黄和麝香的β-环糊精包合物E混匀，加入常规辅料，按照常规工艺制成片剂，包薄膜衣或糖衣。
实验例1、实施例1所述一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物的含量测定挥发油含量测定
取本品挥发油包合物适量，加无水乙醇制成每lml含2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取如意珍宝挥发油对照品，加无水乙醇制成每lml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法（附录W E)试验，以聚乙二醇(PEG-20M)毛细管柱，程序升温；初始温度50°C，保持3分钟，以每分钟25℃的速率升温至200℃，保持1分钟；进样口温度为200℃，检测器温度为220℃，分流比为20：1。分别取对照品溶液与供试品溶液各ll,注入气相色谱仪。供试品溶液色谱中应呈现与对照品溶液色谱峰保留时间相一致的色谱峰。
照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录ⅩD)测定，本品应含挥发油不得少于17%。
总蛋白含量测定
对照品溶液的制备精密称取L-精氨酸对照品5.02mg，置50ml容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含L-精氨酸100.4μg）。
标准曲线的制备精密量取L-精氨酸对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加入水至6.0ml，加磷酸盐缓冲液(pH8.0)0.5ml，再加3%茚三酮乙醇溶液0.5ml，摇匀，置沸水浴中加热15min，取出，放冷，分别加入蒸馏水至刻度，摇匀，以第1份为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在568nm波长处测定吸收度。以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
测定法取总蛋白水解物约0.1g，精密称定，置25ml量瓶中，加水使溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液2.0ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中L-精氨酸的含量，计算，即得。
本品总蛋白水解物总蛋白含量以含L-精氨酸（C6H14N4O2）计不得少于50.0%。红花总黄酮含量测定
对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5.25mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含芦丁0.21mg）。
标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加入水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以第1份为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在510nm波长处测定吸收度。以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
测定法取总黄酮提取物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液3.0ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的含量，计算，即得。
本品总黄酮含量以芦丁（C27H30O16）计不得少于70.0%。
荜茇总生物碱含量测定
取总生物碱提取物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加入乙醇使溶解，定容至刻度，摇匀，加入活性炭1g，振摇脱色10min，滤过，精密量取续滤液5ml至锥形瓶中，精密加入硫酸滴定液（0.01mol/l）15ml、水15ml与甲基红指示液3滴，使用氢氧化钠滴定液（0.02mol/l）滴定至黄色。每1ml硫酸滴定液（0.01mol/l）相当于5.71mg的胡椒碱（C17H19NO3）。
本品荜茇总生物碱含量以胡椒碱（C17H19NO3）计不得少于60.0%。
实验例2、实施例2所述一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物的含量测定挥发油含量测定
取本品挥发油包合物适量，加无水乙醇制成每lml含2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取如意珍宝挥发油对照品，加无水乙醇制成每lml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法（附录W E)试验，以聚乙二醇(PEG-20M)毛细管柱，程序升温；初始温度50°C，保持3分钟，以每分钟25℃的速率升温至200，保持1分钟；进样口温度为200，检测器温度为220，分流比为20：1。分别取对照品溶液与供试品溶液各ll,注入气相色谱仪。供试品溶液色谱中应呈现与对照品溶液色谱峰保留时间相一致的色谱峰。
照挥发油测定法(中国药典2010年版一部附录ⅩD)测定，本品应含挥发油不得少于17%。
总蛋白含量测定
对照品溶液的制备精密称取L-精氨酸对照品5.02mg，置50ml容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含L-精氨酸100.4μg）。
标准曲线的制备精密量取L-精氨酸对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加入水至6.0ml，加磷酸盐缓冲液(pH8.0)0.5ml，再加3%茚三酮乙醇溶液0.5ml，摇匀，置沸水浴中加热15mi n，取出，放冷，分别加入蒸馏水至刻度，摇匀，以第1份为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在568nm波长处测定吸收度。以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
测定法取总蛋白水解物约0.1g，精密称定，置25ml量瓶中，加水使溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液2.0ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中L-精氨酸的含量，计算，即得。
本品总蛋白水解物总蛋白含量以含L-精氨酸（C6H14N4O2）计不得少于50.0%。红花总黄酮含量测定
对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5.25mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含芦丁0.21mg）。
标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加入水至6.0ml，加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以第1份为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA），在510nm波长处测定吸收度。以对照品加入量为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。
测定法取总黄酮提取物约0.2g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇使溶解，定容至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液3.0ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的含量，计算，即得。
本品总黄酮含量以芦丁（C27H30O16）计不得少于70.0%。
实验例3、对谷氨酸致PC12细胞损伤的影响试验研究
本研究采用一定浓度谷氨酸造成PC12细胞的损伤，模拟脑神经细胞因谷氨酸导致的损伤，然后使用MTT法观察各筛选药物对损伤的保护和修复作用，其次测定超氧化物歧化酶（SOD）活力、乳酸脱氢酶（LDH）含量，旨在从现象和机理两方面，筛选出对脑神经细胞有效的有治疗和修复作用的药物。
1.试验材料
1.1药物及试剂
待筛选样品：实施例1微丸新制剂及有效部位样品共5个，实施例2胶囊新制剂，实施例3片剂新制剂，由山东阿如拉药物研究开发有限公司提供，原市售如意珍宝丸为青海金诃藏药药业股份有限公司产品，批号：20110420；为实验方便，后附简称。例如：总黄酮1，即为实施例1微丸红花总黄酮提取物，终浓度为1μg/ml的样品；总黄酮10为其终浓度为10μg/ml的样品。总生物碱1，即为实施例1微丸荜茇总生物碱提取物，终浓度为1μg/ml的样品；总生物碱10为其终浓度为10μg/ml的样品。总挥发油1，为实施例1微丸丁香、豆蔻、檀香总挥发油提取物，终浓度为1μg/ml的样品；总挥发油10为其终浓度为10μg/ml的样品。总蛋白水解物1，为实施例1微丸水牛角、珍珠、螃蟹总水解物提取物，终浓度为1μg/ml的样品；总水解物10为其终浓度为10μg/ml的样品。
阳性对照药物：复方丹参滴丸，天津天士力制药有限公司，批号：100413；
细胞系：PC12细胞系（（来源：Rattμs norvegicμs肾上腺嗜铬细胞瘤，南京凯基生物科技发展有限公司提供。）；
试剂：H-DMEM细胞培养基（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）；胎牛血清（以色列Bioind）；胰酶细胞消化液（碧云天）,青霉素链霉素混合液双抗，注射用顺铂（齐鲁制药有限公司），柠檬酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司），多聚甲醛（solarbio），L-谷氨酸（Klonetech，Japan）。
1.2试验仪器
立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50FBS,上海申安）；双人单面净化工作台（SW-CJ-1C，苏州净化）；二氧化碳培养箱（BB16V/BB5060μV，HERAEμS）；台式离心机（H3，Sigma）；酶标仪(Mμltiskan MK3,Thermo Scientific)；电热恒温鼓风干燥箱（101，上海鹏顺科学仪器有限公司）；倒置显微镜（XDS-1B，重庆光学仪器厂）；水浴恒温振荡器（SHZ-82，金坛市医疗仪器厂）；移液器（Gilson，Eppendorf）；培养瓶（Corning）；96孔板（Costar,μSA）
2.试验方法
以谷氨酸制备PC12细胞化学损伤模型，采用噻唑蓝（MTT）法于570nm处测定吸收值，观察候选药物对PC12细胞损伤的修复作用。使用SOD、NO、LDH、MDA试剂盒检测各指标含量，阐明各药的作用机理。
造模：30mmol/l的谷氨酸（此为加样终浓度，溶于不完全培养基中）作用于PC12细胞24h。
分组：空白组、化学损伤模型组、化学损伤+药物组、化学损伤+阳性对照药组。因96孔板数目限制，样品量较大时采用两个板同时培养检测，每板各设模型组空白组和阳性对照组，以保证结果的可靠性和一致性。
3.试验内容
3.1细胞培养
从超低温冰箱中取冻存的PC12细胞复苏于培养瓶中，以含10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养。待PC12细胞生长至80%融合时，以0.25%的胰酶细胞消化液（含0.02%EDTA）进行消化，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，调零孔不加细胞。
3.2细胞损伤
待96孔板中的细胞长满单层后，弃掉培养基，无菌PBS液清洗2遍，除调零组、空白对照组外，每孔加入终浓度为30mmol/l的谷氨酸（溶于不完全培养基中）于培养箱内培养24h，即造成PC12细胞损伤模型。
3.3加药修复
弃掉培养基，用无菌PBS液清洗2遍，给药组每孔分别加入含筛选药物终浓度依次为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的DMEM培养基100μl，每个浓度的药物加6孔。以不含药物的DMEM培养基为空白对照组，阳性对照组加入不同浓度的复方丹参滴丸的无血清DMEM培养基100μl。然后将细胞置入37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h。
3.4指标测定
3.4.1MTT法测定细胞存活率
弃掉培养基后每孔加入100μl无血清DMEM培养基，再于每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl于培养箱内避光反应4h。弃掉培养基加入100μlDMSO用酶标仪于570nm测定OD值，计算细胞存活率：
计算公式：细胞存活率（％）＝（用药组或模型组A570／对照组A570）×100％。
3.4.2SOD、LDH含量测定
给药后24小时用无菌管收集细胞上清液，离心20分钟（2000r/mi n），仔细收集上清液，按试剂盒说明书操作测定LDH含量。
给药后24小时弃去上清，加2%Trion-100X，于4℃静置12小时后混匀细胞悬液，离心20分钟（2000r/min），仔细收集上清液，按试剂盒说明书操作测定SOD含量。
4.试验结果
所有数据以X±SD表示，单因素方差分析及LSD多组均数两两比较组间差异的显著性，P<0.05为差异显著。
4.1对损伤的PC12细胞存活率的影响
表1 对损伤的PC12细胞存活率影响的结果（n=8）
注：与模型组相比，**P<0.01
表1结果显示，终浓度为10μg/ml时，总挥发油、总黄酮、总生物碱与总水解物组的细胞存活率与相应模型组相比，显著提高，有统计学差异。在终浓度1μg/ml时，各组细胞存活率和模型组相比，无有显著性差异。结果表明上述四种有效部位一定浓度时能显著提高PC12细胞存活率。
4.2各有效部位对PC12细胞LDH、SOD含量的影响
表2各有效部位对PC12细胞SOD含量与LDH含量测定结果（n=8）
注：与模型组相比，**P<0.01；模型组相比，*P<0.05；
表2结果显示，与模型组相比，复方丹参滴丸、总挥发油、总黄酮、总生物碱、总水解物高低剂量组SOD活力显著增加，P<0.01；与模型组相比，复方丹参滴丸高低剂量、总挥发油、总黄酮、总生物碱与总水解物高剂量组LDH浓度显著降低，P<0.01；总黄酮低剂量组LDH浓度显著降低，P<0.05。结果表明总挥发油、总黄酮、总生物碱、总水解物能够显著提高PC12细胞SOD活力，显著降低其LDH含量，具有一定的抗氧化修复细胞作用。
结论：上述研究结果表明：总挥发油、总黄酮、总生物碱及总水解物在一定浓度下均能够提高神经细胞存活率，增强受损细胞SOD活力，降低其LDH浓度，证实上述有效部位能够显著抗氧化，修复保护神经细胞。
验证试验
基于上述药理研究结果，按照如意珍宝有效部位的配方，将四种有效部位及麝香、牛黄混匀，获得实施例1微丸新制剂、实施例2胶囊新制剂、实施例3片剂新制剂。然后采用上述药理模型，对实施例1微丸新制剂、实施例2胶囊新制剂、实施例3片剂新制剂的有效性进行验证，结果如下：
表3各实施例新制剂对PC12细胞存活率的结果（n=8）
注：与模型组相比，**P<0.01；与模型组相比，*P<0.05；与如意珍宝丸组相比，##P<0.01
表3结果显示，与模型组相比，如意珍宝丸、实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂组，细胞存活率显著提高，P<0.01。结果表明如意珍宝丸、实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂能显著提高PC 12细胞存活率。与如意珍宝丸组相比，实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂组，细胞存活率显著提高，P<0.01，表明实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂在提高存活率方面显著优于原制剂如意珍宝丸。
表4各实施例对PC12细胞SOD与LDH的结果（n=8）
注：与模型组相比，**P<0.01；与模型组相比，*P<0.05；与如意珍宝丸组相比，#P<0.05，##P<0.01
表2结果显示，与模型组相比，如意珍宝丸终浓度为10μg/ml、实施例1微丸终浓度为10μg/ml、实施例2胶囊终浓度为10μg/ml、实施例3片剂终浓度为10μg/ml时，细胞SOD活力显著增加，LDH浓度显著降低，P<0.01；结果表明实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂能够显著提高PC12细胞SOD活力，显著降低其LDH含量，具有一定的抗氧化修复细胞作用。与如意珍宝丸组相比，实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂组，细胞SOD活力显著增加，LDH浓度显著降低，P<0.05，P<0.01，表明实施例1微丸、实施例2胶囊、实施例3片剂在增加SOD活力、降低LDH浓度方面显著优于原制剂如意珍宝丸。
Claims (5)
1.一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，其特征在于该组合物的原料药重量份组成为：挥发油包合物30-60份，总蛋白水解物0.5-3份，红花总黄酮提取物1-8份，荜茇总生物碱提取物0.1-3份，人工牛黄包合物3-10份，人工麝香包合物3-10份,其中所述的
（1）挥发油包合物由如下方法制得：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的4~10倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油3~6h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发油溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比4-8%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:4-8g，搅拌条件下，保持温度40-60℃，搅拌2～4h，0-4℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40-60℃真空干燥，得挥发油包合物；
（2）总蛋白水解物由如下方法制得：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的4-10倍的1-4mol/L的硫酸溶液，60-90℃水解4-12小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材0.5-2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏12-48小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得总蛋白水解物；
（3）红花总黄酮提取物由如下方法制得：取红花，以体积分数50-70%的乙醇为溶剂，50-70℃温浸提取1-4次，每次提取0.5-2小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的6-10倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5-2g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附4-10小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积4-10倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积4-10倍量的体积分数50-80%的乙醇洗脱，收集体积分数50-80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5-2g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.05-1.15的浓缩液，在进风口温度180℃，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮提取物；
（4）荜茇总生物碱提取物由如下方法制得：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取1-3次，每次1-3小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的3-8倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.10-1.20的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附5-12小时，用水洗脱至无色后，用质量分数1-5%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱提取物；
（5）人工牛黄包合物由如下方法制得：取人工牛黄，研成细粉，加入1-4重量倍的β-环糊精，研磨包合2-5小时，得人工牛黄包合物；
（6）人工麝香包合物由如下方法制得：去人工麝香，研成细粉，加入1-4重量倍的β-环糊精，研磨包合2-5小时，得人工麝香包合物。
2.如权利要求1所述的一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，其特征在于其中，所述的：
（1）挥发油包合物由如下方法制得：取降香、木香、肉桂、丁香、豆蔻、草果，分别粉碎成粗粉，将6味药材粗粉按重量比33:8:5:4:4:3混合，加药材粗粉总重量的8倍量的水，采用水蒸汽蒸馏法，提取挥发油4h，收集挥发油，得挥发油；
将挥发油溶于等量无水乙醇中，将挥发油的无水乙醇溶液加入重量体积百分比6%的β-环糊精水溶液中，挥发油与β-环糊精的体积重量比为1ml:6g，搅拌条件下，保持温度40℃，搅拌3h，2℃冷藏过夜，抽滤，得沉淀，40℃真空干燥，得挥发油包合物；
（2）总蛋白水解物由如下方法制得：取珍珠、水牛角、螃蟹，分别粉碎成细粉，按重量比10:4:5混合，加入3味药材总重量的8倍的2mol/L的硫酸溶液，80℃水解8小时，冷却后抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，加入氢氧化钡调节pH4-5，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH7左右，浓缩滤液至每毫升相当于原药材2g，加入体积浓度95%的乙醇，使乙醇的体积浓度为70%，冷藏24小时，抽滤，滤渣用水洗涤3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩，干燥，得总蛋白水解物；
（3）红花总黄酮提取物由如下方法制得：取红花，以体积分数70%的乙醇为溶剂，60℃温浸提取3次，每次提取1小时，每次加乙醇的量为红花药材重量的8倍，提取液减压回收乙醇，并浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，滤过，滤液用HPD-100型大孔树脂纯化，纯化工艺为用药液重量0.5倍的HPD-100型大孔树脂吸附5小时，然后用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的水洗脱，再用HPD-100型大孔树脂柱体积5倍量的体积分数50%的乙醇洗脱，收集体积分数50%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至每毫升浓缩液相当于0.5g红花药材，湿法装聚酰胺树脂柱，聚酰胺树脂柱的粒度为80-100目，先用水洗脱至无还原糖反应，再用乙醇洗脱至无盐酸-镁粉反应，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至50℃时相对密度1.10的浓缩液，在进风口温度180℃，出风口温度75℃下喷雾干燥，得红花总黄酮提取物；
（4）荜茇总生物碱提取物由如下方法制得：取荜茇，以体积分数70%的乙醇提取2次，每次1小时，每次加乙醇的量为荜茇药材重量的5倍，合并提取液，减压回收乙醇，再浓缩至50℃下相对密度1.15的浓缩液，用质量分数1%的盐酸溶液溶解，，滤过，滤液用732型阳离子树脂吸附8小时，用水洗脱至无色后，用质量分数3%的氯化钠的体积分数50%的乙醇溶液浸泡12小时，再用体积分数95%的乙醇洗脱，减压回收乙醇，浓缩，除去氯化钠，干燥，得荜茇总生物碱提取物；
（5）人工牛黄包合物由如下方法制得：取人工牛黄，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工牛黄包合物；
（6）人工麝香包合物由如下方法制得：去人工麝香，研成细粉，加入2重量倍的β-环糊精，研磨包合3小时，得人工麝香包合物。
3.如权利要求1所述的一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物，其特征在于该组合物的原料药重量份组成为：挥发油包合物38份，总蛋白水解物1份，红花总黄酮提取物2.5份，荜茇总生物碱提取物0.3份，人工牛黄包合物5.5份，人工麝香包合物5.5份；
或
挥发油包合物45份，总蛋白水解物1.5份，红花总黄酮提取物3.2份，荜茇总生物碱提取物0.6份，人工牛黄包合物5份，人工麝香包合物5份；
或
挥发油包合物50份，红花总黄酮提取物3份，荜茇总生物碱提取物0.5份，总蛋白水解物1.2份，人工牛黄包合物5份，人工麝香包合物5份。
4.如权利要求1-3任一所述的一种治疗脑血管意外后遗症的药物组合物的制备方法，其特征在于：取挥发油包合物、总蛋白水解物、红花总黄酮提取物、荜茇总生物碱提取物、人工牛黄包合物、人工麝香包合物混匀。
5.如权利要求1-4任一所述的治疗脑血管意外后遗症药物组合物在制备治疗脑血管意外后遗症神经修复保护药物中的应用。
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