CN116693711B - 一种何首乌多糖及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种何首乌多糖及其提取方法和应用，属于医药技术领域。本发明的何首乌多糖的提取方法，包括如下步骤：(1)将何首乌粉末依次经石油醚、乙醇溶液、水回流提取后，得到上清液；(2)将上清液经浓缩、醇沉、纯化、干燥后，得到何首乌粗多糖；(3)依次以水和氯化钠溶液为洗脱液，将所述何首乌粗多糖溶液用Q‑SepharoseFastFlow柱洗脱，经除杂、干燥，得到不同分子量的何首乌多糖RPMP‑N和何首乌多糖RPMP‑A。本发明提取到的何首乌多糖RPMP‑N和RPMP‑A，能够恢复相关抗氧化酶活性，保护脏器组织，改善脏器的衰老损伤，延缓机体衰老。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种何首乌多糖及其提取方法和应用。
背景技术
何首乌为蓼科植物何首乌(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便等功效。现代药理研究表明何首乌具有抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老、提高免疫力、抗炎等活性，因此，近年来何首乌在药品、保健品、化妆品等领域应用广泛。化学成分研究表明何首乌块根中主要含有二苯乙烯苷类、多糖类、蒽醌类、黄酮类、磷脂类等活性成分。在何首乌的活性研究中，研究者们也多集中于二苯乙烯苷类、蒽醌类成分的结构分析以及活性毒性研究等。近年来研究发现何首乌中多糖成分具有抗衰老、抗疲劳、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、免疫调节等活性，并且多糖成分是何首乌中的主要成分之一，进一步开发何首乌多糖的提取方法并研究其潜在药用价值具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种何首乌多糖及其提取方法和应用。本发明提取到的何首乌多糖RPMP-N和RPMP-A，能够恢复相关抗氧化酶活性，保护脏器组织，改善脏器的衰老损伤，延缓机体衰老。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种何首乌多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)将何首乌粉末依次经石油醚、乙醇溶液、水回流提取后，得到上清液；
(2)将上清液经浓缩、醇沉、纯化、干燥后，得到何首乌粗多糖；
(3)依次以水和氯化钠溶液为洗脱液，将所述何首乌粗多糖溶液用Q-SepharoseFastFlow柱洗脱，经除杂、干燥，得到不同分子量的何首乌多糖RPMP-N和何首乌多糖RPMP-A。
优选的，步骤(1)所述何首乌粉末依次经石油醚、乙醇溶液、水回流提取的过程具体为：将何首乌粉末经石油醚回流提取，得到药渣A；将药渣A经乙醇溶液回流提取，得到药渣B；将药渣B经水回流提取，得到上清液。
优选的，所述何首乌粉末与所述石油醚的质量体积比为(40～60)g：(0.5～1.0)L；所述石油醚的沸程为60～90℃；所述何首乌粉末经石油醚回流提取的温度为60～70℃，时间为2～4h；
所述何首乌粉末与乙醇溶液的质量体积比为(40～60)g：(1.5～2.5)L；所述乙醇溶液的体积分数为75～90％；所述药渣A经乙醇溶液回流提取的温度为80～90℃，时间为0.5～1.5h；
所述药渣B与水的质量体积比为(40～60)g：(1.5～2.5)L；将药渣B经水回流提取的温度为95～100℃，时间为1.5～3h。
优选的，所述浓缩后的上清液浓度为0.4～0.6kg/L；所述醇沉是指，将所述浓缩后的上清液与无水乙醇按照1：(3～5)的体积比混合；所述醇沉的温度为2～5℃，所述醇沉的时间为10～15h；所述纯化包括除蛋白和透析；所述除蛋白的方法为Sevag法，所述除蛋白的次数为5～10次；所述透析所用透析袋的截留分子量为10kDa；所述透析的时间为20～30h。
优选的，所述何首乌粗多糖溶液的18～22mg/mL。
优选的，所述洗脱的流速为0.5～2ml/min；所述洗脱的过程为：依次以水和氯化钠溶液为洗脱液，所述水的用量为350～500ml，所述氯化钠溶液的用量为350～500ml；所述氯化钠溶液的浓度为0.4～0.6mol/L；每10mL收集一管洗脱液，将第11～23管洗脱液除杂、干燥，得到所述何首乌多糖RPMP-N；将第42～46管洗脱液除杂、干燥，得到所述何首乌多糖RPMP-A。
优选的，所述除杂为透析除杂，所述除杂用的透析袋的截留分子量为10kDa，所述除杂的时间为40～60h，所述除杂的温度为2～5℃。
本发明还提供了一种上述提取方法提取得到的何首乌多糖RPMP-N。
本发明还提供了一种上述提取方法提取得到的何首乌多糖RPMP-A。
本发明还提供了一种上述何首乌多糖RPMP-N和/或上述何首乌多糖RPMP-A在制备抗衰老药物中的应用。
本发明提供了一种何首乌多糖及其提取方法和应用。本发明分别以石油醚、乙醇和水为提取液，采用回流提取法，并利用Q-SepharoseFastFlow柱，以水和氯化钠为洗脱液，分离何首乌多糖组分，最终分离到具有抗衰老活性的何首乌多糖RPMP-N和RPMP-A。本发明的何首乌多糖RPMP-N和RPMP-A两个组分，能够通过恢复相关抗氧化酶活性，抵抗机体ROS的积累，保护脏器组织，改善脏器的衰老损伤，通过抑制P53-P21及CDKs表达中关键蛋白P16的表达，延缓衰老。
附图说明
图1为实施例1何首乌多糖的洗脱曲线。
图2为实施例2各组小鼠脑组织HE染色切片图。
图3为实施例2各组小鼠肝组织HE染色切片图。
图4为实施例2各组小鼠脑组织中MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT酶活性检测结果图。
图5为实施例2各组小鼠肝组织中MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT酶活性检测结果图。
图6为实施例2各组小鼠肝组织中P16、P21、P53蛋白表达水平测定结果图。
图7为实施例2各组小鼠脑组织中P16、P21、P53蛋白表达水平测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种何首乌多糖的提取方法，过程如下：
将何首乌饮片粉碎后过三号筛，取筛下何首乌粉末与石油醚(沸程60～90℃)按照50g：0.75L的比例混合，在65℃下回流提取3h，以脱去脂质。回流提取完成后过滤去除溶剂，挥干后得到药渣A。按照何首乌粉末：乙醇溶液(体积分数为80％)＝50g：2L，将药渣A与乙醇溶液混合，在85℃下回流提取1h，去除小分子物质和色素。回流提取完成后过滤去除溶剂，挥干后得到药渣B。将药渣B与去离子水按照50g：2L的比例混合，在100℃回流提取2h，回流提取完成后，以5000r/min离心5min，取上清液。将上清液进行减压浓缩，所得浓缩液的浓度为0.5kg/L(即每升浓缩液对应何首乌饮片0.5kg)。将浓缩液与无水乙醇混合至乙醇体积分数为80％，然后置于4℃冰箱中静置12h后取出，以5000r/min离心5min，得到沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2次，得到何首乌多糖沉淀。
用去离子水将所得何首乌多糖沉淀溶解成浓度为5mg/mL的多糖沉淀料液，采用Sevag法去除蛋白，具体操作为：将多糖沉淀料液与Sevag试剂(三氯甲烷与正丁醇按照体积比为4:1混合得到)按照体积比为5：1的比例混合，并于200r/min转速的摇床上混匀60min，然后于5000r/min条件下离心5min，取上清液。将上清液继续与Sevag试剂混合，重复上述操作。共处理8次，最后一次处理时，将所得上清液用透析袋(截留分子量为10kDa)在去离子水中透析24h，之后于-90℃、0.3mbar下冷冻干燥48h，得到何首乌粗多糖。
用去离子水将上述所得的何首乌粗多糖溶解成20mg/mL的多糖溶液，采用Q-SepharoseFastFlow柱进行分离，具体为：依次采用400ml的去离子水和400ml的氯化钠水溶液(0.5mol/L)进行洗脱，洗脱过程中的流速为1ml/min，收集洗脱液，每10mL一管。每管取1mL作为样品溶液，向1mL样品溶液中加入1mL去离子水、1mL浓度为0.05g/mL的苯酚水溶液以及5mL浓硫酸(浓度为98％)，混合均匀后于70℃水浴中加热15min，取出后冰浴10min，按照紫外-可见分光光度法，在490nm测定吸光度值(A值)，以洗脱管数为横坐标，A值为纵坐标，绘制洗脱曲线，如图1所示。根据图1所示的洗脱曲线，将同一洗脱峰的第11～23管洗脱液合并，用截留分子量为10kDa的透析袋在4℃去离子水中透析48h，于-90℃、0.3mbar下冷冻干燥48h，得到何首乌多糖RPMP-N。将同一洗脱峰的第42～46管洗脱液合并，用截留分子量为10kDa的透析袋在4℃去离子水中透析48h，于-90℃、0.3mbar下冷冻干燥48h，得到何首乌多糖RPMP-A。
对何首乌多糖RPMP-N和RPMP-A分别进行结构分析，结构特点为：RPMP-N总糖含量大于97％，相对分子量为167kDa，主要由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖组成；RPMP-A的总糖含量大于77％，相对分子量为47kDa，主要由葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖和阿拉伯糖组成。
实施例2
本实施例采用D-半乳糖(D-Gal)诱导小鼠衰老模型，验证了实施例1制备的何首乌多糖RPMP-N和RPMP-A的抗衰老功效，具体过程如下：
1、小鼠模型构建
随机将70只ICR雄性小鼠(SPF级，体重18～22g，3～4周龄，购自斯贝福生物技术有限公司)分为正常对照组(NC)、模型组(Model)、阳性对照组(PCA)、RPMP-N低剂量组(LRPMP-N)、RPMP-N高剂量组(HRPMP-N)、RPMP-A多糖低剂量组(LRPMP-A)、RPMP-A多糖高剂量组(HRPMP-A)，每组10只。除正常组外，每天将100mg/kgD-Gal注入小鼠腹腔，持续6周。对于正常组，同样剂量的生理盐水也注射6周。测定血液中丙二醛(MDA)含量，并与正常组比较。MDA含量的增加具有统计学意义，可以作为衡量模型是否成功的指标。衰老模型成功后，从第七周开始，除注射D-Gal外，阳性对照组每天向小鼠腹腔注射100mg/kg小鼠体重的维生素C。对于RPMP-N和RPMP-A两个剂量组，分别以50mg/kg、100mg/kg的剂量样品灌胃，持续4周。
2、模型小鼠病理检测
将小鼠禁食过夜，第二天摘眼球取血，4℃下4000rpm/min离心10分钟，上清液即为血清。脱颈处死后解剖，剥离脑组织、肝脏，立即置于4％的多聚甲醛中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，进行连续切片，厚5μm，每片相距30μm，常规脱蜡后苏木精-伊红染色，高倍镜下进行全景扫描。观察各实验组小鼠脑组织、肝脏组织病理变化情况，如图2～3所示。图2为小鼠脑组织病理变化情况，图3为小鼠肝组织病理变化情况。
从图2和图3可以看出，RPMP-N多糖和RPMP-A多糖能对D-gal造成的肝、脑组织的损伤起到一定的修复与保护作用，改善了D-gal造成的肝索、肝血窦的排列紊乱，肝细胞水肿及炎细胞浸润，改善了脑部海马组织的神经毡水肿，炎细胞浸润及坏死。
3、模型小鼠MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT酶活性检测
采用试剂盒(购自江苏酶免实业有限公司)检测肝、脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及过氧化氢酶(CAT)含量，以评价肝脏、脑组织氧化应激程度。小鼠脑组织中MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT酶活性见图4，小鼠肝组织中MDA含量、SOD、GSH-PX、CAT酶活性见图5。
从图4和图5可以看出，较正常组，模型组小鼠脑、肝中MDA含量显著性增加，说明腹腔注射D-gal可致MDA产物的大量堆积，过氧化趋势明显；而SOD、GSH-Px、CAT抗氧化酶活性均下降，且有显著性差异，说明腹腔注D-gal可影响抗氧化酶活性，影响机体内ROS的平衡，造成相关器官的损伤。较模型组，阳性对照组及不同剂量RPMP-N多糖和RPMP-A多糖组MDA含量下降明显，SOD、GSH-Px、CAT抗氧化酶活性升高明显，均有显著性差异，说明小鼠脑、肝组织中过氧化损伤有所改善，RPMP-N多糖和RPMP-A多糖通过恢复相关抗氧化酶活性对抗ROS的过度积累，从而保护相关脏器组织，对抗D-gal所致小鼠肝、脑组织的衰老。
4、模型小鼠衰老相关蛋白表达水平检测
采用WesternBlot检测衰老小鼠肝、脑组织中衰老相关蛋白P16、P21、P53的表达水平，探讨RPMP-N多糖和RPMP-A多糖延缓D-gal模型小鼠衰老的可能机制。
取新鲜肝组织和脑组织，称重，按照W：V＝1：6的比例加入蛋白裂解液，用研磨器，把组织研磨成糊状后冰上放置30min，每10min震荡一次。用提前预冷至4℃的离心机12000g离心30min，取上清液，Bradford蛋白浓度测定试剂盒(购自武汉博士德生物科技有限公司)定量蛋白。配制SDS变性10％聚丙烯酰胺凝胶(下层分离胶，单面)，迅速灌胶至玻璃板总高度的约2/3位置，而后在凝胶上方加入水饱和正丁醇1mL以保证凝胶上层的平整，静置待胶凝固。配制SDS变性5％聚丙烯酰胺凝胶(上层积层胶，单面)迅速灌胶至填满玻璃板，插入梳子，静置待胶凝固。电泳前拔去梳子，将凝胶置于1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液中，并用注射器针头吹净上样孔。将蛋白样品与5×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)混合后，煮沸变性5min，冰浴5min。取合适量的蛋白样品上样，进行SDS变性10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，直至目的蛋白有效分离后停止电泳。电泳完毕后将凝胶取出，置于转膜专用的三明治夹中，凝胶置于负极，PVDF膜置于正极，于转膜缓冲液中4℃350mA恒流转膜2h，使凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上形成印迹。将膜置于1×Blotto中，室温摇动封闭2h。将膜取出后按蛋白的印迹位置剪开，置于含P16、P21、P53(1：1000)一抗的Blotto中，4℃摇动作用过夜。隔天取出，置于1×TBST溶液中，摇动漂洗5min，共4次。放入含对应二抗(1：8000)Blotto中，室温作用1.5h后，TBST摇动漂洗5min，共4次。将膜置于ECL显色剂中30s，用化学发光成像及分析系统进行拍照，分析各组蛋白条带的亮度值，计算每个样品的蛋白条带亮度值与对应GAPDH(内参)条带亮度值的比值，得到校正后蛋白条带亮度值，以对照组为标准值1，并绘制柱状图，如图6和图7所示。图6为小鼠肝组织中P16、P21、P53蛋白表达水平测定结果，图7为小鼠脑组织中P16、P21、P53蛋白表达水平测定结果。
从图6和图7可以看出，较正常组，模型组小鼠肝、脑组织中P16、P21、P53蛋白表达量显著升高。不同剂量的RPMP-N多糖和RPMP-A多糖组均有明显的下调相关蛋白表达量的作用，且有一定的浓度依赖性；表明RPMP-N多糖和RPMP-A多糖可能通过抑制P53-P21及CDKs表达中关键蛋白P16的表达，进而延缓了D-gal模型小鼠衰老。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种何首乌多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将何首乌粉末依次经石油醚、乙醇溶液、水回流提取后，得到上清液；
(2)将上清液经浓缩、醇沉、纯化、干燥后，得到何首乌粗多糖；
(3)依次以水和氯化钠溶液为洗脱液，将所述何首乌粗多糖溶液用Q-SepharoseFastFlow柱洗脱，经除杂、干燥，得到不同分子量的何首乌多糖RPMP-N和何首乌多糖RPMP-A；所述洗脱的流速为0.5~2ml/min；所述洗脱的过程为：依次以水和氯化钠溶液为洗脱液，所述水的用量为350~500ml，所述氯化钠溶液的用量为350~500ml；所述氯化钠溶液的浓度为0.4~0.6mol/L；每10mL收集一管洗脱液，将第11~23管洗脱液除杂、干燥，得到所述何首乌多糖RPMP-N；将第42~46管洗脱液除杂、干燥，得到所述何首乌多糖RPMP-A。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述何首乌粉末依次经石油醚、乙醇溶液、水回流提取的过程具体为：将何首乌粉末经石油醚回流提取，得到药渣A；将药渣A经乙醇溶液回流提取，得到药渣B；将药渣B经水回流提取，得到上清液。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述何首乌粉末与所述石油醚的质量体积比为(40~60)g：(0.5~1.0)L；所述石油醚的沸程为60~90℃；所述何首乌粉末经石油醚回流提取的温度为60~70℃，时间为2~4h；
所述何首乌粉末与乙醇溶液的质量体积比为(40~60)g：(1.5~2.5)L；所述乙醇溶液的体积分数为75~90％；所述药渣A经乙醇溶液回流提取的温度为80~90℃，时间为0.5~1.5h；
所述药渣B与水的质量体积比为(40~60)g：(1.5~2.5)L；将药渣B经水回流提取的温度为95~100℃，时间为1.5~3h。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述浓缩后的上清液浓度为0.4~0.6kg/L；所述醇沉是指，将所述浓缩后的上清液与无水乙醇按照1：(3~5)的体积比混合；
所述醇沉的温度为2~5℃，所述醇沉的时间为10~15h；所述纯化包括除蛋白和透析；所述除蛋白的方法为Sevag法，所述除蛋白的次数为5~10次；所述透析所用透析袋的截留分子量为10kDa；所述透析的时间为20~30h。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述何首乌粗多糖溶液为18~22mg/mL。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述除杂为透析除杂，所述除杂用的透析袋的截留分子量为10kDa，所述除杂的时间为40~60h，所述除杂的温度为2~5℃。
7.一种权利要求1~6任一项所述提取方法提取得到的何首乌多糖RPMP-N。
8.一种权利要求1~6任一项所述提取方法提取得到的何首乌多糖RPMP-A。
9.一种权利要求7所述何首乌多糖RPMP-N和/或权利要求8所述何首乌多糖RPMP-A在制备抗衰老药物中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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