CN117209617A - 一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖，其多糖结构特征为单糖组成以阿拉伯糖和半乳糖醛酸为主，分子量为23kDa，其连接方式为→3,5)‑α‑Araf‑(1→3,5)‑α‑Araf‑(1→3,4)‑α‑GalpA‑(6‑OMe)‑(1→为其主链，并含有阿拉伯糖支链、HG结构域和末端半乳糖醛酸。其制备方法包括小秦艽粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子及利用弱阴离子交换树脂吸附，然后用0.1M浓度的盐溶液洗脱，得到高纯的小秦艽多糖。上述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖具有良好的抗氧化活性以及免疫调节活性，具备多种疾病治疗药物应用价值，而且结构明确、活性良好，为开发小秦艽多糖的药用价值奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
秦艽为龙胆科龙胆属Gentiana(Tourn.)L.秦艽(Sect.Cruciata Gaudin)多年生草本植物的干燥根，《中国药典》2020年版规定其法定来源为植物秦艽(Gentianamacrophylla Pall.)、麻花秦艽(G.straminea Maxim.)、粗茎秦艽(G.crassicaulisDuthie ex Burk.)或小秦艽(G.dahurica Fisch.)。其中小秦艽又叫达乌里秦艽，在中国分布于四川北部及西北部、西北、华北、东北等地区。生长于海拔870-4500米的田边、路旁、河滩、湖边沙地、水沟边、向阳山坡及干草原等地。秦艽始载于《神农本草经》列为中品，至今已有2000多年的药用历史。秦艽是重要的中药，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效。目前秦艽的抗炎、抗风湿活性成分主要集中在其环烯醚萜类、黄酮类及三萜类等成分，有关秦艽大分子多糖结构及活性研究的报道较为少见。
目前关于秦艽多糖的研究多集中在其化学成分组成以及活性方面。例如，陈克克等人运用了HPLC方法分析了秦艽多糖的单糖组成，结果表明秦艽多糖含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖七种单糖，其摩尔比为0.06：0.25：0.03：1.00：1.23：0.87：3.52。从麻花秦艽中被分离出来的粗多糖则被认为主要以葡萄糖为主，且具有一定的抗炎作用。Zou从粗茎秦艽干燥根茎中分离到两种果胶样多糖，分别含有半乳糖(66.2％和36.1％)、半乳糖醛酸(15.8％和24.0％)和阿拉伯糖(7.8％和32.0％)，分子量分别为627kDa和471.3kDa，并且具有天然免疫调节作用。然而，秦艽多糖的明确结构至今尚未阐明。因此，为了进一步开发秦艽多糖的应用，需要对其明确的结构和药理活性进行深入系统研究，以开发其药用价值。
发明内容
本发明目的是提供一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖及其制备方法和应用。
本发明的技术方案是：
一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖，所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的分子量为23kDa、所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖中的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的主链以→3,5)-Araf-(1→和→3,4)-GalpA-(1→为连接，支链有α-Araf-(1→、→5)-α-Araf-(1→、α-GalpA-(1→、→4,6)-β-Galp-(1→和→4)-β-Glcp-(1→；所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的结构式为：
进一步的，所述阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸的摩尔比为50～60：25～35：2～3：5～6：4～5：0.5～1.5：1～2，所述n选自10～30之间。
本发明的另一技术方案是：
一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的制备方法，该方法包括：
(1)粗制：取干燥的小秦艽的根茎，粉碎，获得小秦艽粉末，所述小秦艽粉末经乙醇回流提取，去除小分子后，经热水回流提取得到小秦艽水提液，再加入乙醇沉淀，得到小秦艽粗多糖；
(2)精制：将所述小秦艽粗多糖上样到弱阴离子交换树脂，经2倍柱体积水洗脱除杂后，用0.1M的盐溶液洗脱得到多糖溶液，经脱盐、减压浓缩及冷冻干燥，得到阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖。
进一步的，在步骤(1)中，所述小秦艽粉末与所述乙醇的重量体积比为1g:7.26mL。
进一步的，在步骤(2)中，所述弱阴离子交换树脂的基质为琼脂糖、葡聚糖、聚甲基丙酰胺基质中的任意一种，表面键合相为二乙基氨基乙基。
本发明的第三种技术方案是：
一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖在制备治疗由氧化损伤引起的疾病的药物中的应用。
一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖在制备免疫调节药物中的应用。
本发明提供了一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖及其制备方法和应用，有益效果为：通过在秦艽根茎中提取并纯化得到高纯的多糖，并经结构鉴定得出其结构单元和基本组成。通过自由基清除实验、RAW264.7氧化损伤和免疫调节模型发现本发明所得的阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖具有良好的抗氧化及免疫调节活性。本发明的方法不仅操作简单，耗时短并且成本低廉。采用该方法制备的小秦艽多糖纯度高，组分清晰，结构明确，具有多种潜在的应用价值，为开发小秦艽多糖的药用价值奠定基础。
附图说明
图1为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的红外光谱图；
图2为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的一维核磁共振波谱图(1H-NMR，13C-NMR)；
图3为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的二维核磁共振波谱图(1H-1HCOSY图，1H-13C HSQC图，1H-13C HMBC图，1H-1H NOESY图)；
图4为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖对自由基清除实验的结果图；
图5为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖对RAW 264.7氧化损伤保护活性的影响图；
图6为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖对NO释放水平的影响图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例按如下步骤展示一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的制备方法：
步骤1：提取
将市售秦艽干燥根茎粉碎，收取细粉。取688g细粉，加入95％乙醇5L，90℃回流提取2h，过滤取滤渣，重复两次。取滤渣按照1：10的料液比加入5L去离子水，100℃沸水提取2小时，重复提取2次，离心并合并2次提取所得的滤液，后过滤。
步骤2：初步纯化
采用膜截留分子量规格为10kDa的超滤膜，进行超滤截留浓缩至1L左右。将4L无水乙醇加入浓缩液中醇沉，边加边搅拌,4℃冰箱过夜沉淀，离心(3500rpm 15min)，取沉淀，即得秦艽粗多糖。复溶后将秦艽粗多糖溶液上样至大孔弱碱性阴离子交换树脂，收集流穿的组分，减压浓缩。向上述溶液中加入40mL Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝5：1)以除蛋白，分液漏斗内充分摇匀10min，离心，取上层水溶液，弃蛋白层和有机试剂层，重复以上步骤6次，旋蒸浓缩，彻底除去有机溶剂。用3500Da透析袋连续透析三天。
步骤3：精制
采用苏州汇通色谱分离纯化有限公司层析柱，基质为苏州赛分科技股份有限公司的琼脂糖DEAE填料进行纯化。多糖样本制成50mg/mL的样本溶液，膜过滤后进样，中压制备液相流速8mL/min，收集0.1M盐洗脱液，即为一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖(小秦艽)。用3.5kDa透析袋透析，离心、冷冻干燥样本，冻干后样本称重，阴凉干燥处保存。
上述方法所制备的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖(小秦艽多糖)的分子量为23kDa、单糖组成百分比为鼠李糖：阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：甘露糖:半乳糖醛酸:葡萄糖醛酸＝2.65：53.50：6.35：4.56：1.03：30.76：1.14，小秦艽多糖的主链以→3,5)-Araf-(1→和→3,4)-GalpA-(1→为连接，主链残基摩尔比为28.0:20.8，支链有α-Araf-(1→、→5)-α-Araf-(1→、α-GalpA-(1→、→4,6)-β-Galp-(1→和→4)-β-Glcp-(1→，支链残基摩尔比为11.6:12.3:13.4:4.3:4.6。小秦艽多糖的结构式为：
经测定，一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的蛋白含量1.05％，总糖含量82.27％。单糖组成以半乳糖醛酸和阿拉伯糖为主，还含有葡萄糖和半乳糖。
1、对实施例1中所得的产品分别进行红外分析，得到其主要功能基团和部分连接构型特征，结果请参阅图1，图1为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的红外光谱图。如图1所示，阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖为主要含有α型糖苷键连接，中间掺有部分β型糖苷键连接的聚糖；甲基化分析能够提供多糖分子中糖残基类型和比例，结果请参阅表1。如表1所示，在本发明所述的阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖中，GalA的连接方式有T-GalA,1,3,4-GalA这两种形式，Ara的连接方式有T-Ara,1,5-Ara,1,3,5-Ara这三种形式。二维核磁共振分析可以确定不同糖残基及其连接方式，其具体碳氢归属请参阅图2、图3和表2，表2为一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖核磁共振氢谱和碳谱的化学位移归属表，图2为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的一维核磁共振波谱图(1H-NMR，13C-NMR)；图3为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的二维核磁共振波谱图(1H-1H COSY图，1H-13C HSQC图，1H-13CHMBC图，1H-1H NOESY图)，结合甲基化结果，最终推断出糖链结构。
表1
表2
2、对实施例1中所得的产品分别进行体外抗氧化活性的研究。
(1)测定ABTS、DPPH、羟基自由基清除能力
结果请参阅图4，图4为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖对自由基清除实验的结果图。如图4所示，该小秦艽多糖具有很好的自由基清除能力，且呈浓度依赖性。
(2)对RAW264.7氧化损伤的活性保护分析
在RAW264.7中添加过氧化氢至终浓度1.2mM进行氧化损伤，后利用CCK-8试剂盒，在450nm下测定吸光度并计算细胞存活率。结果请参阅图5，图5为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖对RAW 264.7氧化损伤保护活性的影响图。如图5所示，该小秦艽多糖呈现很好的氧化损伤保护作用，且呈现一定的剂量依赖关系。当多糖的浓度从10μg/mL增加到500μg/mL时,其对RAW 264.7氧化损伤的保护率先增加然后略有降低。
3、对实施例1中所得的产品分别进行免疫调节活性的研究。
免疫调节活性分析(NO含量测定)
利用NO试剂盒对其促进RAW264.7释放NO含量进行测得。结果请参阅图6，图6为本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖对NO释放水平的影响图。如图6所示，当其质量浓度为10、50、500μg/mL时，具有一定的免疫调节活性；但是当其质量浓度为100和200μg/mL时，表明在此浓度下GDP-1表现出非常强的免疫刺激活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖及其制备方法和应用，所得到的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖不仅具有明确的结构、良好的活性，可为开发小秦艽多糖的药用价值奠定基础，而且具有良好的抗氧化活性以及免疫调节活性，具备制备多种疾病治疗药物应用价值。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖，其特征在于：所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的分子量为23kDa、所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖中的单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的主链以→3,5)-Araf-(1→和→3,4)-GalpA-(1→为连接，支链有α-Araf-(1→、→5)-α-Araf-(1→、α-GalpA-(1→、→4,6)-β-Galp-(1→和→4)-β-Glcp-(1→；所述阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的结构式为：
2.根据权利要求1所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖，其特征在于：所述阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸的摩尔比为50～60：25～35：2～3：5～6：4～5：0.5～1.5：1～2，所述n选自10～30之间。
3.一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)粗制：取干燥的小秦艽的根茎，粉碎，获得小秦艽粉末，所述小秦艽粉末经乙醇回流提取，去除小分子后，经热水回流提取得到小秦艽水提液，再加入乙醇沉淀，得到小秦艽粗多糖；
(2)精制：将所述小秦艽粗多糖上样到弱阴离子交换树脂，经2倍柱体积水洗脱除杂后，用0.1M的盐溶液洗脱得到多糖溶液，经脱盐、减压浓缩及冷冻干燥，得到阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖。
4.根据权利要求2所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述小秦艽粉末与所述乙醇的重量体积比为1g:7.26mL。
5.根据权利要求2所述的一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述弱阴离子交换树脂的基质为琼脂糖、葡聚糖、聚甲基丙酰胺基质中的任意一种，表面键合相为二乙基氨基乙基。
6.一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖在制备治疗由氧化损伤引起的疾病的药物中的应用。
7.一种阿拉伯糖半乳糖醛酸聚糖在制备免疫调节药物中的应用。
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