CN116731213B

CN116731213B - 一种何首乌多糖及其提取方法和在制备保肝药物中的应用

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Publication number: CN116731213B
Application number: CN202310077751.2A
Authority: CN
Inventors: 马双成; 王莹; 金红宇; 辜冬琳; 姚令文; 范晶; 杨建波; 昝珂; 于健东; 魏锋
Original assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2023-01-17
Filing date: 2023-01-17
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2043-01-17
Also published as: CN116731213A

Abstract

本发明提供了一种何首乌多糖及其提取方法和在制备保肝药物中的应用，属于中药技术领域。本发明将何首乌药材与体积分数为70～90％的乙醇水溶液混合，在回流条件下进行第一提取，得到何首乌药渣；将所述何首乌药渣与水混合，在回流条件下进行第二提取，将所得何首乌提取液进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液与乙醇混合，至所得稀释液中乙醇的体积分数为70～95％，将所述稀释液依次进行静置和离心分离，将所得多糖沉淀进行除蛋白，得到何首乌多糖。采用本发明方法提取的何首乌多糖具有较好的保肝活性。

Description

一种何首乌多糖及其提取方法和在制备保肝药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种何首乌多糖及其提取方法和在制备保肝药物中的应用。

背景技术

何首乌为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便等功效。现代药理研究表明何首乌具有抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老、提高免疫力、抗炎等活性，因此，近年来何首乌在药品、保健品、化妆品等领域应用广泛。化学成分研究表明何首乌块根中主要含有二苯乙烯苷类、多糖类、蒽醌类、黄酮类、磷脂类等活性成分。《中国药典》2020年版何首乌项下，对何首乌和制何首乌中二苯乙烯苷及结合蒽醌的含量进行了限度要求。在何首乌的活性研究中，研究者们也多集中于二苯乙烯苷类、蒽醌类成分的结构分析以及活性毒性研究等。近年来研究发现何首乌中多糖成分具有抗衰老、抗疲劳、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、免疫调节等活性，并且多糖成分是何首乌中的主要成分之一，进一步开发何首乌多糖的提取方法并研究其潜在药用价值具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种何首乌多糖及其提取方法和在制备保肝药物中的应用，采用本发明方法提取的何首乌多糖具有较好的保肝活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种何首乌多糖的提取方法，包括以下步骤：

将何首乌药材与体积分数为70～90％的乙醇水溶液混合，在回流条件下进行第一提取，得到何首乌药渣；

将所述何首乌药渣与水混合，在回流条件下进行第二提取，将所得何首乌提取液进行浓缩，得到浓缩液；

将所述浓缩液与乙醇混合，至所得稀释液中乙醇的体积分数为70～95％，将所述稀释液依次进行静置和离心分离，将所得多糖沉淀进行除蛋白，得到何首乌多糖。

优选地，所述何首乌药材与乙醇水溶液的用量比为50g：(1～3)L；所述第一提取的时间为0.5～2h。

优选地，所述何首乌药渣与水的用量比为50g：(1～3)L；所述第二提取的时间为1～3h。

优选地，以所述何首乌药材的质量为基准，所述浓缩液的浓度为0.45～0.55kg/L。

优选地，所述静置的温度为4℃，时间为12～24h；所述离心分离的转速为3000～6000r/min，时间为3～10min。

优选地，所述除蛋白的方法为Sevag法，所述除蛋白的次数为5～10次。

优选地，所述除蛋白后还包括依次进行DEAE-52柱层析分离和Sephadex G-100柱层析分离。

优选地，所述DEAE-52柱层析分离所用洗脱剂依次为水和浓度为0.3mol/L的NaCl水溶液；所述Sephadex G-100柱层析分离所用洗脱剂为水。

本发明提供了上述技术方案所述提取方法提取得到的何首乌多糖。

本发明提供了上述技术方案所述何首乌多糖在制备保肝药物中的应用。

本发明提供了一种何首乌多糖的提取方法，包括以下步骤：将何首乌药材与体积分数为70～90％的乙醇水溶液混合，在回流条件下进行第一提取，得到何首乌药渣；将所述何首乌药渣与水混合，在回流条件下进行第二提取，将所得何首乌提取液进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液与乙醇混合，至所得稀释液中乙醇的体积分数为70～95％，将所述稀释液依次进行静置和离心分离，将所得多糖沉淀进行除蛋白，得到何首乌多糖。本发明经第一提取，能够有效去除何首乌药材中小分子物质和色素，经第二提取能够充分的提取其中的多糖成分，之后将所得何首乌提取液浓缩并利用乙醇稀释，再经静置以及离心分离，能够将多糖成分沉淀析出，再去除多糖沉淀中的蛋白成分，最终所得何首乌多糖具有较好的保肝活性。

进一步地，本发明在除蛋白后依次进行DEAE-52柱层析分离和Sephadex G-100柱层析分离，能够进一步去除杂质，获得两种均一化的何首乌多糖组分，为进一步研究其潜在药用价值奠定了基础。

附图说明

图1为何首乌粗多糖对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠肝组织病理损伤的影响结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种何首乌多糖的提取方法，包括以下步骤：

在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品；所用水均为去离子水。

本发明将何首乌药材与体积分数为70～90％的乙醇水溶液混合，在回流条件下进行第一提取，得到何首乌药渣。本发明对所述何首乌药材的来源没有特殊限定，本领域技术人员鉴定基源为何首乌的药材或饮片均可；在本发明的实施例中，具体是采用何首乌饮片作为原料。在本发明中，所述何首乌药材进行提取前优选依次经粉碎和过筛，本发明优选采用三号筛对粉碎后的何首乌药材进行过筛，取筛下何首乌粉末进行后续提取。在本发明中，所述乙醇水溶液的体积分数优选为70～90％，更优选为80％。在本发明中，所述何首乌药材与乙醇水溶液的用量比优选为50g：(1～3)L，更优选为50g：2L。在本发明中，所述第一提取在回流条件下进行，具体温度为80～90℃；所述第一提取的时间优选为0.5～2h，更优选为1h。所述第一提取后，本发明优选将所得体系进行过滤，弃去提取液后，将所得固体物料挥干，得到何首乌药渣。本发明在上述条件下进行第一提取，能够有效去除何首乌药材中小分子物质和色素。

得到何首乌药渣后，本发明将所述何首乌药渣与水混合，在回流条件下进行第二提取，将所得何首乌提取液进行浓缩，得到浓缩液。在本发明中，所述何首乌药渣与水的用量比优选为50g：(1～3)L，更优选为50g：2L。在本发明中，所述第二提取在回流条件下进行，具体温度为100℃；所述第二提取的时间优选为1～3h，更优选为2h。本发明在上述条件下进行第二提取，能够充分的提取何首乌药渣中的多糖成分。所述第二提取后，本发明优选将所得体系进行离心，上清液为何首乌提取液，然后将所述何首乌提取液进行浓缩，得到浓缩液。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压浓缩。在本发明中，以所述何首乌药材的质量为基准，所述浓缩优选是使所述浓缩液的浓度为0.45～0.55kg/L(具体指每升浓缩液中含何首乌药材0.45～0.55kg)，更优选为0.5kg/L。

得到浓缩液后，本发明将所述浓缩液与乙醇混合，至所得稀释液中乙醇的体积分数为70～95％，将所述稀释液依次进行静置和离心分离，将所得多糖沉淀进行除蛋白，得到何首乌多糖。在本发明中，所述稀释液中乙醇的体积分数为70～95％，优选为80％。本发明将稀释液中乙醇体积分数限定在上述范围，能够充分的将多糖成分沉淀析出。在本发明中，所述静置的温度为4℃，时间优选为12～24h，更优选为12～15h。在本发明中，所述离心分离的转速优选为3000～6000r/min，更优选为5000r/min；时间优选为3～10min，更优选为5min。本发明优选将离心分离所得沉淀物用无水乙醇洗涤，然后再将所得多糖沉淀进行除蛋白。在本发明中，所述除蛋白的方法优选为Sevag法，所述除蛋白的次数优选为5～10次，更优选为8次。在本发明中，所述Sevag法的具体操作为：将多糖沉淀与水混合，得到多糖沉淀料液；将所述多糖沉淀料液与Sevag试剂按照体积比为5：1的比例充分混匀60min后离心，收集上清液继续采用Sevag法进行下一次处理；所述Sevag试剂优选为三氯甲烷与正丁醇混合试剂，所述三氯甲烷与正丁醇的体积比优选为4:1；最后一次处理后，本发明优选将所得上清液用透析袋(10kMWCO)在去离子水中透析24h，之后经冷冻干燥48h，得到何首乌多糖(记为何首乌粗多糖)。

在本发明中，所述除蛋白后优选还包括依次进行DEAE-52柱层析分离和SephadexG-100柱层析分离，本发明优选通过DEAE-52柱层析分离和Sephadex G-100柱层析分离进一步获得均一化的多糖组分(即何首乌精制多糖)。下面进行详细说明。

所述除蛋白后，本发明优选将所得何首乌粗多糖进行DEAE-52柱层析分离，所述DEAE-52柱层析分离所用洗脱剂优选依次为水和浓度为0.3mol/L的NaCl水溶液。本发明优选收集洗脱过程中所得洗脱液，每10mL一管，每管取1mL作为样品溶液，向1mL样品溶液中加入1mL去离子水、1mL浓度为0.05g/mL的苯酚水溶液以及5mL浓硫酸(浓度为98％)，混合均匀后于70℃水浴中加热15min，取出后冰浴10min，按照紫外-可见分光光度法，在490nm测定吸光度值(A值)，以洗脱管数为横坐标，A值为纵坐标，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线合并同一洗脱峰对应的洗脱液，得到两种多糖溶液，分别记为PMP-1多糖溶液和PMP-2多糖溶液；将所述PMP-1多糖溶液和PMP-2多糖溶液分别采用截留分子量为10kDa的透析袋在4℃去离子水中透析48h，之后冷冻干燥，分别得到PMP-1多糖和PMP-2多糖。

得到PMP-1多糖和PMP-2多糖后，本发明优选将所述PMP-1多糖和PMP-2多糖分别进行Sephadex G-100柱层析分离，所述Sephadex G-100柱层析分离所用洗脱剂优选为水。本发明优选收集洗脱过程中所得洗脱液，每10mL一管，每管取1mL作为样品溶液，向1mL样品溶液中加入1mL去离子水、1mL浓度为0.05g/mL的苯酚水溶液以及5mL浓硫酸(浓度为98％)，混合均匀后于70℃水浴中加热15min，取出后冰浴10min，按照紫外-可见分光光度法，在490nm测定吸光度值(A值)，以洗脱管数为横坐标，A值为纵坐标，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线合并同一洗脱峰对应的洗脱液，经冷冻干燥，得到两种均一多糖组分，分别记为PMP-1均一多糖和PMP-2均一多糖。

本发明提供的提取方法操作简单，且不需要采用淀粉酶、木瓜蛋白酶等进行处理，尽可能充分的提取了何首乌中的多糖成分，保证最终所得何首乌多糖具有较好的保肝活性。

本发明提供了上述技术方案所述提取方法提取得到的何首乌多糖。本发明提供的何首乌多糖具有较好的保肝活性，能够用于制备保肝药物。

本发明提供了上述技术方案所述何首乌多糖在制备保肝药物中的应用。在本发明中，所述保肝药物优选包括活性成分以及药学上可接受的辅料，所述活性成分为所述何首乌多糖，本发明对所述药学上可接受的辅料的具体种类没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知种类的药学上可接受的辅料即可。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将何首乌饮片粉碎后过三号筛，取筛下何首乌粉末与体积分数为80％的乙醇水溶液混合，进行回流(温度为80～90℃)提取1h以去除小分子物质和色素，其中，所述何首乌粉末与乙醇水溶液的用量比为50g：2L；回流提取完成后过滤去除溶剂，将所得固体物料挥干，得到药渣；

将所述药渣与去离子水混合进行回流(温度为100℃)提取2h，其中，所述药渣与去离子水的用量比为50g：2L；回流提取完成后离心，将上清液进行减压浓缩得到浓缩液，以所述何首乌饮片的质量为基准，所述浓缩液的浓度为0.5kg/L(具体指每升浓缩液中含何首乌饮片0.5kg)；

将所述浓缩液与无水乙醇混合至乙醇体积分数为80％，将所得稀释液在4℃冰箱中静置12h后取出，在5000r/min条件下离心5min，沉淀用无水乙醇洗涤，得到多糖沉淀；

采用Sevag法去除所述多糖沉淀中的蛋白，具体是将所述多糖沉淀与水混合，得到多糖沉淀料液；将所述多糖沉淀料液与Sevag试剂按照体积比为5：1的比例充分混匀60min后离心，收集上清液继续采用Sevag法进行下一次处理；所述Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇按照体积比为4:1的比例混合得到；共采用Sevag法反复进行8次处理，最后一次处理后，将所得上清液用透析袋(10k MWCO)在去离子水中透析24h，之后经冷冻干燥48h，得到何首乌粗多糖。

实施例2

每次取实施例1制备的何首乌粗多糖400mg，采用DEAE-52柱进行分离，具体是依次采用去离子水和浓度为0.3mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，收集洗脱液，每10mL一管，每管取1mL作为样品溶液，向1mL样品溶液中加入1mL去离子水、1mL浓度为0.05g/mL的苯酚水溶液以及5mL浓硫酸(浓度为98％)，混合均匀后于70℃水浴中加热15min，取出后冰浴10min，按照紫外-可见分光光度法，在490nm测定吸光度值(A值)，以洗脱管数为横坐标，A值为纵坐标，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线合并同一洗脱峰对应的洗脱液，依次得到PMP-1多糖溶液和PMP-2多糖溶液；将所述PMP-1多糖溶液和PMP-2多糖溶液分别采用截留分子量为10kDa的透析袋在4℃去离子水中透析48h，之后冷冻干燥，分别得到PMP-1多糖和PMP-2多糖；

将所述PMP-1多糖和PMP-2多糖分别采用Sephadex-G100柱进行分离，具体是采用去离子水进行洗脱，收集洗脱液，每10mL一管，每管取1mL作为样品溶液，向1mL样品溶液中加入1mL去离子水、1mL浓度为0.05g/mL的苯酚水溶液以及5mL浓硫酸(浓度为98％)，混合均匀后于70℃水浴中加热15min，取出后冰浴10min，按照紫外-可见分光光度法，在490nm测定吸光度值(A值)，以洗脱管数为横坐标，A值为纵坐标，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线合并同一洗脱峰对应的洗脱液，经冷冻干燥，得到两种均一多糖组分，分别记为PMP-1均一多糖和PMP-2均一多糖。

测试例

采用对乙酰氨基酚(APAP)诱导小鼠肝损伤模型探索实施例1制备的何首乌粗多糖的肝脏保护作用，具体如下：

1、随机将32只雄性昆明小鼠分为正常对照组(NC，连续21天用0.9％生理盐水灌胃治疗)、APAP肝损伤模型组(Model，连续21天用0.9％生理盐水灌胃治疗，并在最后一次治疗后6h口服400mg/kgBWAPAP盐水溶液)、何首乌粗多糖低剂量组(LPMP)、何首乌粗多糖高剂量组(HPMP)，每组8只。LPMP组和HPMP组分别按每天200mg/g和100mg/g灌胃给予实施例1制备的何首乌粗多糖，最后一次治疗后6h口服400mg/kg BWAPAP盐水溶液。末次给药12h后，试验小鼠眼球采血并快速取出肝脏。

采用试剂盒检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平，以评价肝损伤程度。具体是按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定血清中ALT、AST、ALP和LDH水平，其中，ALT和AST在510nm处测吸收值，ALP在520nm处测吸收值，LDH在340nm处测吸收值；结果如表1所示。由表1可知，与对照组相比，模型组动物血清ALT、AST、ALP和LDH活性显著升高(P<0.05)，表明肝损伤模型成功；与模型组相比，多糖实验组LPMP和HPMP组动物血清ALT、AST、ALP和LDH活性呈剂量依赖性显著降低(P<0.05)。

表1何首乌粗多糖对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠AST、ALT、ALP和LDH水平的影响(x±s，n＝8)

组别	AST(U/L)	ALT(U/L)	ALP(U/L)	LDH(U/L)
					对照组	25.64^#±3.63	28.63^#±3.84	54.67^#±7.42	208.21^#±47.07
模型组	147.83±23.25	50.39±4.63	149.31±6.63	759.29±81.46
					LPMP	82.50^#±1.11	38.81^#±2.96	93.86^#±2.75	375.99^#±39.41
HPMP	43.59^#±1.52	29.49^#±4.35	54.30^#±5.15	243.53^#±28.23

注：与模型组相比，^#P<0.05。

2、采用试剂盒检测肝脏匀浆液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及活性氧自由基(ROS)含量，以评价肝脏氧化应激程度。具体是按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定肝组织匀浆中SOD含量，采用可见分光光度计测定MDA、ROS和GSH-Px含量，其中，SOD在450nm处测吸收值，MDA在532nm处测吸收值，GSH-Px在412nm处测吸收值，ROS于488nm激发波长和525nm发射波长测定吸收值；结果如表2所示。由表2可知，与对照组相比，模型组肝脏组织标本中的GSH-Px和SOD含量显著降低(均P<0.05)；与模型组相比，多糖实验组LPMP和HPMP组的GSH-Px和SOD含量显著增加(P<0.05)；同时，模型组的肝组织中ROS和MDA含量明显高于对照组；然而，与模型组相比，LPMP和HPMP组的MDA和ROS含量显著降低(均P<0.05)。

表2何首乌粗多糖对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠SOD、MDA、GSH-Px和ROS含量的影响(x±s，n＝8)

注：与模型组相比，^#P<0.05。

3、采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及白介素1β(IL-1β)水平，本实验采用TRIzol试剂从肝脏中获得总RNA，RNA质量和数量在NanoDrop-Lite分光光度计上进行评估。具体的，RT-qPCR在95℃(30s)条件下进行，随后进行40个95℃(5S)和60℃(30S)循环；PCR引物为：

IL-6正向：5'-CTCCCACAGACCTGTCTATAC-3'(SEQ ID NO.1)和反向：5'-CCCATTGCACAACTTTTTCTCA-3'(SEQ ID NO.2)；

TNF-α正向：5'-ATCCGCGACGTGGAACTG-3'(SEQ ID NO.3)和反向：5'-ACCGCCTGGAGTTCTGGAA-3'(SEQ ID NO.4)；

IL-1β正向5'-GAGACCTTCTCCTTCATCTT-3'(SEQ ID NO.5)和反向：5'-TTCACACACCAGCAGGTTATCATC-3'(SEQ ID NO.6)。

2^-ΔΔCt法用于分析标准化为磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达的数据。

具体结果如表3所示。由表3可知，与对照组相比，模型组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA含量显著升高，而多糖实验组LPMP和HPMP组血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显下降(P<0.05)。

表3何首乌粗多糖对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响(x±s，n＝8)

组别	TNF-α	IL-6	IL-1β
				对照组	1.07^#±0.39	1.11^#±0.45	1.04^#±0.31
模型组	3.40±0.77	4.06±0.69	5.43±0.96
				LPMP	1.51^#±0.48	1.73^#±0.61	2.85^#±0.32
HPMP	1.19^#±0.30	1.18^#±0.26	1.99^#±0.42

注：与模型组相比，^#P<0.05。

4、制作肝脏病理切片，经苏木精伊红(HE)染色后观察肝脏病理变化。具体是将各组大鼠肝组织于4％多聚甲醛中固定72h，随后将已固定的肝组织置于20％乙二胺四乙酸中进行脱钙处理，将样品在梯度浓度的乙醇中脱水并包埋在石蜡中；将石蜡包埋的组织切成5mm切片，于室温条件下依次进行苏木精染色10min和伊红染色2min，使用光学显微镜观察肝组织病理学变化，结果如图1所示。由图1可知，对照组肝脏组织学正常，中心静脉周围排列有多边形肝细胞，细胞核清晰，胞质室均匀；在模型组中存在严重的病理变化，包括肝细胞排列异常、胞质室出现坏死和空泡，且中央静脉扩张和被动充血；在多糖实验组LPMP和HPMP组中，这些病理变化显著减轻。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种何首乌多糖在制备保肝药物中的应用，所述何首乌多糖的提取方法，按以下步骤进行：

将何首乌药材与体积分数为70~80%的乙醇水溶液混合，在回流条件下进行第一提取，得到何首乌药渣；

将所述浓缩液与乙醇混合，至所得稀释液中乙醇的体积分数为70~95%，将所述稀释液依次进行静置和离心分离，将所得多糖沉淀进行除蛋白，得到何首乌多糖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述何首乌药材与乙醇水溶液的用量比为50g：（1~3）L；所述第一提取的时间为0.5~2h。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述何首乌药渣与水的用量比为50g：（1~3）L；所述第二提取的时间为1~3h。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以所述何首乌药材的质量为基准，所述浓缩液的浓度为0.45~0.55kg/L。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述静置的温度为4℃，时间为12~24h；所述离心分离的转速为3000~6000r/min，时间为3~10min。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述除蛋白的方法为Sevag法，所述除蛋白的次数为5~10次。