CN104569274A - 一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，包括步骤：1、提取生物组织中的粗多糖；2、所述粗多糖利用三氟乙酸水解，所得水解物除酸；3、步骤2所得残余物，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，制备糖的衍生物；4、对已鉴定含有糖醛酸的多糖以步骤2和3的方法制备对照品溶液；5、以液相色谱-质谱技术分析提取步骤3糖的衍生物和4对照品溶液，通过比对，实现鉴定生物组织中含糖醛酸多糖。本发明可以对生物组织中的多糖直接进行检测，避免了繁琐的分离纯化过程，使用样品量较少，可在较短时间内获得结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测生物大分子的方法，更具体，涉及鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法。
背景技术
多糖及其缀合物，如糖蛋白、糖脂、糖胺聚糖等作为信息分子参与了各种生命现象和生理过程，它们广泛存在于生命体中。已有研究证实很多多糖具有种属和脏器专一性，而且生物体内的多糖不仅与遗传因素有关，还与生物体的生理状态有关。所以，对多糖的鉴定能够为生物样品来源、生理状态等提供信息。而且，多糖还是评价食品营养的重要指标，它不仅能够为人体提供能量，还可能具有重要的生理功能。
对生物组织样品中多糖的鉴定，通常需要经过繁琐的分离纯化后，再采用多种化学和光谱学的方法进行结构解析。一些色谱手段，如电泳、凝胶过滤色谱等，能够根据分子量和电荷分离多糖，但难以准确鉴别出它们的种类。对降解产生的寡糖片段进行分析以确定多糖种类是一条捷径，但目前只有极少数有相应降解酶的多糖应用了该方法，例如肝素和硫酸软骨素，但降解酶和寡糖标准品价格都十分昂贵，难以广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其中的含糖醛酸多糖具体是指结构中包含由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖组成的重复二糖片段的多糖的检测。本发明具有效率高的特点，可以对生物组织中的多糖直接进行检测。
为了达到上述目的，本发明提供一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，包括如下步骤：
S1、提取生物组织中的粗多糖；
S2、所述粗多糖利用三氟乙酸水解，所得水解物除酸；
S3、步骤S2所得残余物，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，制备糖的衍生物；
S4、对已鉴定含有糖醛酸的多糖以步骤S2和S3的方法制备对照品溶液；
S5、以液相色谱-质谱技术分析提取步骤S3糖的衍生物和S4对照品溶液，通过比对，实现鉴定生物组织中含糖醛酸多糖。
其中，本发明方法用于鉴定生物组织中由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖组成的重复二糖片段的多糖。优选方式下，步骤S4中所述含糖醛酸的多糖为硫酸软骨素、肝素、透明质酸或鲍鱼多糖。
优选方式下，本发明方法的具体步骤为：
S1、取生物组织，匀浆后，用蛋白酶酶解；将酶解液离心，取上清液加入乙醇醇沉，收集沉淀，干燥，得粗多糖样品；
S2、取粗多糖样品10～200mg，1mL 1～2mol/L的三氟乙酸100～120℃，水解1～4h；酸水解液加入1mL水，使用减压除去溶剂，重复三次，达到除酸目的；
S3、加入200～2000μL的氨水溶解残渣，取出200～400μL溶液加入到具塞试管中，再向具塞试管中加入200～400μL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，70℃水浴30min，加入3mL甲醇，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为鉴定液；
S4、所述含糖醛酸的多糖取样量为0.5～5mg，按照S2和S3进行酸水解和衍生化，得对照品溶液；
S5、以乙腈/20mM乙酸铵水溶液为流动相，使用配备反相硅胶柱的液相色谱-质谱；采用正离子模式，选择含糖醛酸二糖的衍生物的准分子离子，色谱峰保留时间和质谱数据与对照品比对，从而推断生物样品中含糖醛酸多糖的种类。
上述优选方式下，最优情况为：
步骤S2中三氟乙酸浓度为1.3mol/L，水解温度105℃，水解时间为3h。
步骤S5中液相色谱-质谱技术选择m/z 686.26±0.5，m/z 687.25±0.5的离子。大部分情况下是m/z 686.26±0.5，m/z 687.25±0.5的离子，但也可能有其他离子。
此外，步骤S1中，所用蛋白酶优选为胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，其他类可行蛋白酶也适用。
本发明方法适用于结构中包含由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖组成的重复二糖片段的多糖的检测。这种多糖在生物组织中存在广泛，可以存在于动物、植物、微生物组织中，而且具有多种生物活性。如糖胺聚糖中的肝素、硫酸软骨素、透明质酸等，都是由糖醛酸与氨基己糖连接而成的重复二糖片段构成。另外在一些贝类、海藻、细菌中发现了结构中存在糖醛酸与己糖连接而成的重复二糖片段的多糖。
酸水解法成本低,操作简单，而且对各种多糖都有降解作用。本发明是根据糖醛酸的糖苷键较难被酸水解这一特点，获得二糖片段产物，供检测分析，间接实现对含糖醛酸多糖的鉴定。
本发明可以对生物组织中的多糖直接进行检测，避免了繁琐的分离纯化过程，使用样品量较少，可在较短时间内获得结果。
附图说明
图1是实施例1的不同TFA浓度得到的二糖PMP衍生物的峰面积
图2是实施例1的不同酸水解温度得到的二糖PMP衍生物的峰面积
图3是实施例1的不同酸水解时间得到的二糖PMP衍生物的峰面积
图4是实施例2对照品的选择离子色谱图；
图5是实施例2样品的选择离子色谱图。
图6是实施例3样品的选择离子色谱图。
具体实施方式
本发明一种生物组织中含有糖醛酸的多糖的快速分析方法，具体步骤如下：
Step1、取生物样品，匀浆后，用蛋白酶酶解；将酶解液离心，取上清液加入乙醇醇沉，收集沉淀，干燥，得粗多糖样品；
Step2、取粗多糖样品10～200mg，1mL 1～2mol/L的三氟乙酸100～120℃,水解1～4h；酸水解液加入1mL水，使用减压除去溶剂，重复三次，达到除酸目的；
Step3、加入200～2000μL的氨水溶解残渣，取出200～400μL溶液加入到具塞试管中，再向具塞试管中加入200～400μL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，70℃水浴30min，加入3mL甲醇，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液；
Step4、以硫酸软骨素、肝素、透明质酸、鲍鱼多糖等含糖醛酸的多糖为对照品，取样量为0.5～5mg，按照Step2和Step3进行酸水解和衍生化，得对照品溶液；
Step5、液相色谱-质谱分析：以乙腈/20mM乙酸铵水溶液为流动相，使用反相硅胶柱色谱；采用正离子模式，提取m/z 686.26±0.5，m/z 687.25±0.5的离子色谱峰，保留时间和质谱数据与对照品比对，从而推断生物样品中含糖醛酸多糖的种类。
其中，Step2中最优条件为酸浓度为1.3mol/L，水解温度105℃，水解时间为3h；在最优条件下获得的二糖片段产物比例最高，检测的灵敏度最高。
Step5中采用液相色谱-质谱技术选择离子方式，能够避免杂质峰的干扰；结构中有己糖醛酸与氨基己糖组成的二糖片段的多糖，如硫酸软骨素、肝素、透明质酸，得到的二糖片段产物离子m/z 686.26，结构中有己糖醛酸与己糖组成的二糖片段的多糖，如鲍鱼多糖AGSP，得到的二糖片段产物离子m/z 687.25。
实施例1
(1)配置一系列含有2mg/mL的硫酸软骨素和2mg/mL鲍鱼多糖AGSP的TFA溶液，TFA浓度分别为0.10，0.30，0.90，1.30，1.70mol/L，在110℃的条件下水解2h；
(2)配置一系列含有2mg/mL的硫酸软骨素和2mg/mL鲍鱼多糖AGSP的1mol/L TFA溶液，分别在90℃，100℃，110℃，120℃，130℃条件下水解2h；
(3)配置一系列含有2mg/mL的硫酸软骨素和2mg/mL鲍鱼多糖AGSP的1mol/L TFA溶液，在110℃条件下分别水解1h，2h，3h，4h，5h；
(4)采用L4(23)正交表对TFA浓度(0.9mol/L1.3mol/L)、酸水解温度(105℃，115℃)、酸水解时间(2h，3h)进行正交试验。
(5)步骤(1)～(4)获得的酸水解液加入1mL水，旋蒸除去TFA，重复三次，达到除酸目的；
(6)向旋干后的样品中加入2mL的氨水震荡，使样品完全溶解，在溶解后的溶液中取出400μL于水解管中，再向水解管中加入400μL的0.3moL/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，混匀后在70℃条件下水浴30min；加入3mL甲醇，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液。
(7)用去离子水将供试液稀释10倍经0.22μm微孔滤膜过滤后，进行液质分析。液质条件如下：AB/Sciex QTRAP 4000质谱仪，MRM模式，Synergi 4μFusion-RP(80A,50×2.0mm)色谱柱，柱温30℃，流速0.5mL/min流动相为20mmol乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，20分钟内B相比例由18％线性增加至35％。
(8)硫酸软骨素和鲍鱼多糖AGSP水解后产生的二糖分别是GlcA-(1→3)-GalN和GlcA-(1→2)-Man；不同TFA浓度得到的二糖PMP衍生物的峰面积如图1所示，其中TFA浓度为0.9mol/L和1.3mol/L时，二糖片段的得率最高；不同酸水解温度得到的二糖PMP衍生物的峰面积如图2所示，其中酸水解温度为110℃左右时，二糖片段的得率较高；不同酸水解时间得到的二糖PMP衍生物的峰面积如图3所示，其中酸水解时间为2h和3h时，二糖片段的得率较高；
(9)水解硫酸软骨素的正交实验结果如表1所示，水解鲍鱼多糖AGSP的正交实验结果如表2所示，其中二糖片段得率最高的条件均为1.3mol/L TFA，105℃，水解3h。
表1 水解硫酸软骨素的正交实验结果
表2 水解鲍鱼多糖AGSP的正交实验结果
实施例2
(1)取新鲜等边浅蛤、四角蛤蜊、中国蛤蜊、缢蛏、厚壳贻贝，去壳去内脏后匀浆，称取匀浆后的原料15g于75mL的pH＝8的KH2PO4缓冲溶液中，加入0.5％的胰蛋白酶酶解4h后，再加入0.5％的木瓜蛋白酶酶解3h，之后用100℃沸水灭酶5min；酶解液在10000r/min的条件下离心20min取上清液；在上清液中加入1.5倍体积的乙醇醇沉过夜；醇沉后以4000r/min离心15min取沉淀，沉淀冻干得粗多糖干粉。
(2)准确称取粗多糖干粉50mg于5mL水解管中，并在水解管中加入1mL的1.3mol/L的三氟乙酸在105℃的条件下水解3h；酸水解液加入1mL水，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂，重复三次，除酸。
(3)向旋干后的样品中加入2mL的氨水震荡，使样品完全溶解，在溶解后的溶液中取出400μL于具塞试管中，再向水解管中加入400μL的0.3moL/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，混匀后在70℃条件下水浴30min；加入3mL甲醇，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液。
(4)以硫酸软骨素、肝素、透明质酸、鲍鱼多糖等含糖醛酸的多糖为对照品，取样量为2mg，按照(2)和(3)进行酸水解和衍生化，得对照品溶液。
(5)取供试液和对照品溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，进行液质分析。液质条件如下：Silgreen ODS C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱；柱温30℃；流动相20mmol乙酸铵水溶液-乙腈(78:22，V/V)；流速1mL/min；离子源ESI源；喷雾电压4.5kV；毛细管温度为275℃；毛细管电压为37V；鞘气：40Au；辅助气：10Au；正离子模式检测；扫描方式为全扫描(Full Scan)；扫描范围为100-2000(m/z)。
(6)选择m/z 686.3和m/z 687.3离子的色谱图如图4所示，与标准品(图5)对照可知：等边浅蛤中含有硫酸软骨素和肝素；四角蛤蜊中含有硫酸软骨素和肝素；中国蛤蜊中含有硫酸软骨素和肝素；缢蛏中含有硫酸软骨素和肝素；厚壳贻贝中含有硫酸软骨素。
实施例3
(1)取海参水煮液冻干粉1g于25mL的pH＝8的KH2PO4缓冲溶液中，加入0.5％的胰蛋白酶酶解4h后，再加入0.5％的木瓜蛋白酶酶解3h，之后用100℃沸水灭酶5min；酶解液在10000r/min的条件下离心20min取上清液；在上清液中加入1.5倍体积的乙醇醇沉过夜；醇沉后以4000r/min离心15min取沉淀，沉淀冻干得粗多糖干粉。
(2)准确称取粗多糖干粉20mg于5mL水解管中，并在水解管中加入1mL的1.3mol/L的三氟乙酸在105℃的条件下水解3h；酸水解液加入1mL水，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂，重复三次，除酸。
(3)向旋干后的样品中加入2mL的氨水震荡，使样品完全溶解，在溶解后的溶液中取出400μL于水解管中，再向水解管中加入400μL的0.3moL/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，混匀后在70℃条件下水浴30min；加入3mL甲醇，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液。
(4)以硫酸软骨素、肝素、透明质酸、鲍鱼多糖等含糖醛酸的多糖为对照品，取样量为2mg，按照(2)和(3)进行酸水解和衍生化，得对照品溶液。
(5)取供试液和对照品溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，进行液质分析。液质条件如下：Silgreen ODS C18(250×4.6mm,5μm)色谱柱；柱温30℃；流动相20mmol乙酸铵水溶液-乙腈(78:22，V/V)；流速1mL/min；离子源ESI源；喷雾电压4.5kV；毛细管温度为275℃；毛细管电压为37V；鞘气：40Au；辅助气：10Au；正离子模式检测；扫描方式为全扫描(Full Scan)；扫描范围为100-2000(m/z)。
(6)选择m/z 686.3，m/z 687.3离子的色谱图如图6所示，与标准品(图5)对照可知，海参水煮液中含有硫酸软骨素。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取生物组织中的粗多糖；
S2、所述粗多糖利用三氟乙酸水解，所得水解物除酸；
S3、步骤S2所得残余物，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，制备糖的衍生物；
S4、对已鉴定含有糖醛酸的多糖以步骤S2和S3的方法制备对照品溶液；
S5、以液相色谱-质谱技术分析步骤S3糖的衍生物和S4对照品溶液，通过比对，实现鉴定生物组织中含糖醛酸多糖。
2.根据权利要求1所述鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，用于鉴定生物组织中由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖组成的重复二糖片段的多糖。
3.根据权利要求1或2所述鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，步骤S4中所述含糖醛酸的多糖为硫酸软骨素、肝素、透明质酸或鲍鱼多糖。
4.根据权利要求3所述鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，步骤具体为：
S1、取生物组织，匀浆后，用蛋白酶酶解；将酶解液离心，取上清液加入乙醇醇沉，收集沉淀，干燥，得粗多糖样品；
S2、取粗多糖样品10～200mg，1mL 1～2mol/L的三氟乙酸100～120℃，水解1～4h；酸水解液加入1mL水，使用减压除去溶剂，重复三次，达到除酸目的；
S3、加入200～2000μL的氨水溶解残渣，取出200～400μL溶液加入到具塞试管中，再向具塞试管中加入200～400μL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，70℃水浴30min，加入3mL甲醇，使用旋转蒸发仪减压除去溶剂；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为鉴定液；
S4、所述含糖醛酸的多糖取样量为0.5～5mg，按照S2和S3进行酸水解和衍生化，得对照品溶液；
S5、以乙腈/20mM乙酸铵水溶液为流动相，使用配备反相硅胶柱的液相色谱-质谱；采用正离子模式，选择含糖醛酸二糖的衍生物的准分子离子，色谱峰保留时间和质谱数据与对照品比对，从而推断生物样品中含糖醛酸多糖的种类。
5.根据权利要求4所述鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，步骤S2中三氟乙酸浓度为1.3mol/L，水解温度105℃，水解时间为3h。
6.根据权利要求4所述鉴定生物组织中含糖醛酸多糖的方法，其特征在于，S5中液相色谱-质谱技术选择m/z 686.26±0.5，m/z 687.25±0.5的离子。
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