CN105699578B - 一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法 - Google Patents

一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法，其特征在于包括(1)将玻璃酸钠用透明质酸酶酶解得到寡糖片段；(2)采用高效液相色谱‑质谱联用仪对步骤(1)中得到的寡糖片段进行分离、检测。该方法在流动相A(0.15％甲酸‑水)及流动相B(60％乙腈‑水(含0.15％甲酸))的梯度洗脱下即可将各个寡糖片段及其同分异构体完全分离。

Description

一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及玻璃酸钠的酶切及基于液质联用技术的糖型指纹图谱分析方法。
背景技术
玻璃酸钠(Sodium Hyaluronate，简称HAS)，又称透明质酸钠，是一种由D-葡萄糖醛酸(简称GlcA)和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖双糖单位通过(简称GlcNAc)β-(1→3)糖苷键和β-(1→4)糖苷键重复构成的无分支的透明质酸的钠盐。分子式：(C14H20NNaO11)n，分子量：(401.3)n Da，结构如下
玻璃酸钠是一种酸性粘多糖，平均分子量一般都大于1×106，想要直接了解其具体的结构信息尚存在较大困难。目前各国药典中均采用红外光谱及颜色反应来鉴别玻璃酸钠，上述方法主要是通过玻璃酸钠结构中某些基团的特征吸收光谱来鉴别其结构，如果在玻璃酸钠生物合成过程中葡萄糖醛酸及N-乙酰基-D-氨基葡萄糖聚合顺序发生错配(如：GlcA-GlcNAc-GlcNAc–GlcA)或稳定性试验中上述二糖因光照高温等条件发生变化(如氧化、还原、脱水、脱羧等)而产生杂质，红外光谱则无法表征此信息。
发明内容
本发明提供了一种将玻璃酸钠的酶切产物经亲水C18色谱柱分离的方法，通过紫外检测器及质谱形成糖型指纹图谱，不仅可以鉴别自制产品与玻璃酸钠对照品在结构上是否具有一致性，还可以表征玻璃酸钠组成糖型信息，有助于玻璃酸钠的稳定性研究及控制产品的质量。同时本发明还提供了酶解玻璃酸钠的条件，特别是利用牛睾丸透明质酸酶在用甲酸调节pH为4的条件下，减小后续色谱检测中溶剂峰对酶切产物信号的干扰。
一方面，本发明提供了一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将玻璃酸钠用透明质酸酶酶解得到寡糖片段；
(2)采用高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(1)中得到的寡糖片段进行分离、检测；
其中所述高效液相色谱检查采用C18反相色谱柱；流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为体积比0.15％的甲酸水溶液，流动相B为体积比为含0.15％甲酸的60％的乙腈水溶液；并采用流动相流速为0.8mL/min；柱温为35℃；检测波长为195nm；进样量为20μL；
所述质谱检测采用电喷雾电离源；毛细管电压为3500V；干燥气流速为12L/min；雾化室压力为60psi；干燥气温度为320℃；碰撞诱导解离为125，增益为1，阈值为150；MSD1：负离子模式扫描，范围：100～3000；MSD2：负离子模式选择离子监测。
本发明所建立的液质联用检测技术可利用常规的亲水C18色谱柱在较为简单的流动相条件下将各种寡糖片段及其异构体实现完全分离，并可同时监测酶切样品在储存过程中所生成的相关杂质，从而可直观的全面的表征玻璃酸钠水解产物的指纹信息。较体积排阻色谱柱具有明显优势，而体积排阻色谱柱无法分离异构体。本法所建立的玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法，不仅可以反映玻璃酸钠的结构信息，同时可监测到酶切样品在储存过程中所生成的相关杂质。
在一些实施例中，所述透明质酸酶为牛睾丸透明质酸酶，其中酶解过程用甲酸调节pH至4。
本发明用甲酸调节pH至4。在该条件下能有效的提高牛睾丸来源的透明质酸酶的酶切效率，且避免了使用磷酸等缓冲盐，使得酶解产物中不含大量无机盐等杂质，能够减小色谱检测中溶剂峰对酶切产物信号的干扰，从而简化色谱条件的摸索。
在一些实施例中，所述玻璃酸钠溶液浓度为1mg/mL，加入所述透明质酸酶的终浓度为2mg/mL。
在一些实施例中，所述酶解过程是在37℃下进行24小时后在100℃下进行5分钟以终止酶解，12000rpm离心5分钟，取上清过0.45um水系滤膜得到寡糖片段。
附图说明
图1：不同酶切反应体系下生成的酶切产物色谱信号；HAS-Freda-水-2mgHAase是指用超纯水配制终浓度为1mg/mL的玻璃酸钠溶液和2mg/mL的透明质酸酶酶切体系，玻璃酸钠为山东福瑞达公司；HAS-Freda-盐-2mgHAase是指用NaH2PO4-NaNO3缓冲液配制终浓度为1mg/mL的玻璃酸钠溶液和2mg/mL的透明质酸酶酶切体系，玻璃酸钠为山东福瑞达公司；HAS-NJ-151125-盐-2mgHAase是指用NaH2PO4-NaNO3缓冲液配制终浓度为1mg/mL的玻璃酸钠凝胶溶液和4mg/mL的透明质酸酶酶切体系，凝胶批号:151125，自研产品。
图2：不同pH值对酶切效率的影响
图3：玻璃酸钠组成糖型指纹图谱
图4：956.2969的相关物质的MS/MS图谱
图5：767.1968的相关物质的MS/MS图谱
具体实施方式
本发明实施例公开了一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法进行详细说明。
实施例
1、仪器与试剂
1.1仪器
Agilent 1260/6130高效液相色谱-质谱联用仪、多参数测试仪、分析天平。
1.2试剂
玻璃酸钠、透明质酸酶、甲酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯)。
2、玻璃酸钠酶切方法
2.1溶液配制
2.2.1空白对照溶液：取超纯水适量，甲酸调节pH至4。
2.2.2玻璃酸钠溶液：称取玻璃酸钠适量，加入2.2.1中空白对照溶液溶解，制成溶液为每毫升含玻璃酸钠1mg，甲酸调节pH至4。
2.2酶切反应
移取上述空白对照溶液、玻璃酸钠溶液适量，分别加入透明质酸酶，使透明质酸酶的终浓度为2mg/mL。立即混匀后于37℃恒温水浴24h，再经100℃沸水浴5min以终止酶切反应，12000rpm离心5min，取上清液过0.45um水系滤膜，即得。
3、酶切样品检测方法
3.1色谱条件
高效液相及质谱联用色谱仪，Agilent 1260/6130TI-00442
色谱柱：AgelaVenusil MP C18(4.6mm×250mm,3μm)；
流动相：A为0.15％甲酸-水；B为60％乙腈-水(含0.15％甲酸)；
流速：0.8mL/min；柱温：35℃；波长：195nm；进样量：20μL。
洗脱方法：如下表1所示。
表1
3.2质谱条件
离子源：ESI；毛细管电压：3500V；
干燥气流速：12L/min；雾化室压力：60psi；干燥气温度：320℃；
碰撞诱导解离：125；增益：1；阈值：150；
MSD1：负离子模式扫描，范围：100～3000；
MSD2：负离子模式选择离子监测。
4、实验结论：
4.1甲酸调节pH的水酶切体系
本发明以超纯水作为玻璃酸钠的溶媒，并用甲酸调节pH至4。在该条件下能有效的提高牛睾丸来源的透明质酸酶的酶切效率，且避免了使用磷酸等缓冲盐，使得水解产物中不含大量无机盐等杂质，能够减小色谱检测中溶剂峰对酶切产物信号的干扰，从而简化色谱条件的摸索(图1)。
在NaH2PO4-NaNO3缓冲液中生成的酶切产物，其色谱图中存在较大的溶剂峰，与保留较弱的二糖产物信号重叠，通过大量的色谱条件优化实验均无法将两者完全分离。本发明经过甲酸调节玻璃酸钠水溶液的pH至4时，酶切效率得到较大的提高，使得终产物主要以4糖的形式存在，也包括少量的2糖及6糖(图2)。
总之，该方法简化了酶切反应条件，提高了酶切效率，也在一定程度上净化了酶切产物，易化了色谱分析方法开发的同时，也简化了玻璃酸钠酶切产物的指纹图谱，使其能够简洁、直观的表征玻璃酸钠的结构组成信息。
●4.2基于简单色谱条件的异构体分离
本方法色谱条件简单，采用亲水C18色谱柱(WelchAQ C18或Agela Venusil MP C18，4.6mm×250mm,3μm)，在流动相A(0.15％甲酸-水)及流动相B(60％乙腈-水(含0.15％甲酸))的梯度洗脱下即可将各个寡糖片段及其同分异构体(目前尚无文献报道分离异构体的方法)完全分离(图3)，较体积排阻色谱柱具有明显优势，其无法分离异构体。
●4.3相关杂质的检测
本发明所建立的玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法，不仅可以反映玻璃酸钠的结构信息，同时可监测到酶切样品在储存过程中所生成的相关杂质。例如分子量为767、956的信号峰，该碎片信号并非为酶切的终产物，经过二维质谱结构解析，推测该片段为酶切产物在储存过程中所生成的相关物质。
分子量956.2969的相关物质的MS/MS图谱(图4)中，952.23是透明质酸酶切产物5糖片段的分子量(序列为：GlcA-GlcNAc-GlcA-GlcNAc-GlcA，简称dp5)，故推测分子量为956.2969相关物质为dp5的还原产物(加4H),由于该物质二维质谱中有4糖、3糖、2糖及葡萄糖醛酸单糖片段，故推测还原位点可能发生在dp5末端的GlcA和GlcNAc上，其结构及相互转换关系推测如下：
结果：按照上述推测及结构转换关系，分子量为956.2969的相关物质的MS/MS图谱得到较为完整的解释。
分子量为767.1968的相关物质的MS/MS图谱(图5)中，在二维质谱图中能找到单糖(GlcA)、二糖、三糖的片段，且该相关物质和三糖的分子量相差194.0904(为葡萄糖醛酸)，故推测该相关物质的序列为GlcA-GlcNAc-GlcA-GlcA(被修饰)，结构推测如下：
结果：三糖(573.13)及其结构转化关系见956.2969MS/MS解析项下。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种玻璃酸钠组成糖型指纹图谱分析方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将玻璃酸钠用透明质酸酶酶解得到寡糖片段，所述透明质酸酶为牛睾丸透明质酸酶，其中酶解过程用甲酸调节pH至4；
(2)采用高效液相色谱-质谱联用仪对步骤(1)中得到的寡糖片段进行分离、检测；
其中所述高效液相色谱检查采用C18反相色谱柱；流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为体积比0.15％的甲酸水溶液，流动相B为体积比为含0.15％甲酸的60％的乙腈水溶液；并采用流动相流速为0.8mL/min；柱温为35℃；检测波长为195nm；进样量为20μL；
所述质谱检测采用电喷雾电离源；毛细管电压为3500V；干燥气流速为12L/min；雾化室压力为60psi；干燥气温度为320℃；碰撞诱导解离为125，增益为1，阈值为150；MSD1：负离子模式扫描，范围：100～3000；MSD2：负离子模式选择离子监测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述玻璃酸钠溶液浓度为1mg/mL，加入所述透明质酸酶的终浓度为2mg/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述酶解过程是在37℃下进行24小时后在100℃下进行5分钟以终止酶解，12000rpm离心5分钟，取上清液过0.45μm水系滤膜得到寡糖片段。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107561179B (zh) * 2017-08-18 2020-12-04 上海景峰制药有限公司 一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法
CN109298113B (zh) * 2018-12-11 2021-06-18 华熙生物科技股份有限公司 一种测定包含有柠檬酸的溶液中的透明质酸含量的方法
CN111562231B (zh) * 2020-06-22 2023-09-15 华熙生物科技股份有限公司 一种透明质酸分子量的测定方法
CN113287708A (zh) * 2021-07-12 2021-08-24 千世泰生物科技(青岛)有限公司 一种含透明质酸钠的固体饮料及其中透明质酸钠含量检测方法
CN114236014B (zh) * 2021-12-27 2022-11-15 珠海溪谷医疗科技有限公司 隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法
CN114609296B (zh) * 2022-03-29 2024-01-05 水羊化妆品制造有限公司 一种酶解透明质酸寡糖混合物的检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6279790A (ja) * 1985-09-30 1987-04-13 Toyo Jozo Co Ltd 改質されたヒアルロン酸の製造法
JP3932348B2 (ja) * 2001-03-28 2007-06-20 独立行政法人産業技術総合研究所 オリゴ糖の製造方法
CN102323344A (zh) * 2011-07-20 2012-01-18 山东福瑞达生物医药有限公司 一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法
CN102645504A (zh) * 2012-05-10 2012-08-22 江南大学 一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法
CN104215704A (zh) * 2013-06-05 2014-12-17 江苏中谱检测有限公司 掺假蜂蜜中寡糖的快速检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6279790A (ja) * 1985-09-30 1987-04-13 Toyo Jozo Co Ltd 改質されたヒアルロン酸の製造法
JP3932348B2 (ja) * 2001-03-28 2007-06-20 独立行政法人産業技術総合研究所 オリゴ糖の製造方法
CN102323344A (zh) * 2011-07-20 2012-01-18 山东福瑞达生物医药有限公司 一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法
CN102645504A (zh) * 2012-05-10 2012-08-22 江南大学 一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法
CN104215704A (zh) * 2013-06-05 2014-12-17 江苏中谱检测有限公司 掺假蜂蜜中寡糖的快速检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography method for bovine testicular hyaluronidase digests using postcolumn derivatization with 2-cyanoacetamide and ultraviolet detection;Jeffrey A.Cramer 等;《Analytical Biochemistry》;19910731;第196卷(第1期);183-191 *
Determination of Hyaluronic Acid in a Chitosan-Based Formulation by RP C18 and HILIC LC–ESI-MS: an Evaluation of Matrix Effect;Marco Vigliano 等;《Chromatographia》;20130906;第76卷(第23期);1761-1766 *
High-performance liquid chromatography of hyaluronic acid and oligosaccharides produced by bovine testes hyaluronidase;P.J. Knudsen 等;《Journal of Chromatography A》;19800118;第187卷(第2期);373-379 *
软骨素酶 ABC酶解-高效液相色谱法测定鱼翅中的透明质酸;鲍伦军 等;《色谱》;20021130;第20卷(第6期);557-559 *
高效液相色谱法测定玻璃酸钠的含量;王海英 等;《中国药学杂志》;20111231;第46卷(第23期);1844-1846 *

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