CN103713057B - 一种降解硫酸乙酰肝素及检测其二糖组成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域涉及一种降解硫酸乙酰肝素及检测其二糖组成的方法，包括如下步骤：(1)用化学降解法将硫酸乙酰肝素降解为二糖；(2)用衍生试剂衍生硫酸乙酰肝素二糖；(3)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。本发明涉及的两种化学降解方法可将硫酸乙酰肝素完全降解为二糖，能够最大程度的得到硫酸乙酰肝素二糖的结构信息。降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，适用范围广，检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种降解硫酸乙酰肝素及检测其二糖组成的方法。
背景技术
硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)是一类广泛存在于动物组织基质及细胞膜的糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)，其与17种蛋白质构成的蛋白聚糖，主要有黏附蛋白聚糖、纤维蛋白聚糖、糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖、β2蛋白聚糖及CD44等。它们在动物细胞的信号传导、增生与分化、免疫调节、细胞黏附以及神经细胞的信息传递等方面具有重要的生物学功能。HS糖链由氨基葡糖(GlcN)通过α(1→4)糖苷键与葡糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)连接构成二糖重复单元，HS与肝素的主要区别在于二糖重复单元的硫酸化修饰程度及乙酰化程度不同。HS是自然界中结构最复杂的生物大分子之一，其结构的复杂性和多样性是其参与各种生命活动的基础。与肝素相比，HS具有抗栓活性强、抗凝血活性弱的优点，因此HS日益引起研究者的兴趣。几乎所有动物组织中均含有HS，目前的HS原料主要取自于动物的肺、胰、脾及十二指肠等，不同来源的HS其结构及药理作用均有明显差异。但是由于技术与试剂的限制，现有二糖组成测定方法亟需改进以推进HS的研究、开发与应用。
现分析HS二糖组成的方法主要依靠肝素酶。肝素酶是一类来自微生物的裂解酶，如肝素酶I、II和III。这三种酶具有不同的糖结构选择性，可以使肝素及HS在不同的糖苷键处断裂。将肝素及HS降解成二糖需将三种肝素酶联合使用，再通过强阴离子交换柱或反相柱分离酶解得到的不同二糖，与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质的量的标准曲线进行定量来确定该多糖的结构。吕慧中等用酶解方法对猪肝组织中的硫酸乙酰肝素进行了二糖分析(吕惠中，于广利，赵峡，等.猪肝组织中硫酸乙酰肝素的分离纯化及二糖组成分析[J].中国生化药物杂志，2007(5)：297～300)。传统方法中的酶、强阴离子交换柱和二糖标准品都非常昂贵，酶容易失活、性质不稳定，检测步骤繁琐，而且该方法分析结果的重复性差。如果样品中混有其它糖胺聚糖，如硫酸软骨素，肝素酶不能将其降解，故不能检测到这一类的杂质。所以亟需一种全面、高效、简单、稳定且成本低廉的检测硫酸乙酰肝素类二糖的方法。
发明内容
针对以上现有技术存在的不足，本发明提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的检测硫酸乙酰肝素的方法，本发明的另一目的是提供一种可以最大程度地得到硫酸乙酰肝素二糖的方法。
实现上述发明的技术方案是：
1.一种检测硫酸乙酰肝素二糖组成的方法，包括如下步骤：
(1)用化学降解法将硫酸乙酰肝素降解为二糖
①将硫酸乙酰肝素脱乙酰基，得脱乙酰产物；
②用亚硝酸降解步骤①所得脱乙酰产物；
(2)用衍生试剂衍生硫酸乙酰肝素二糖
将步骤(1)所得二糖浓缩至干并溶解于水中，调节pH值为碱性，加入0.5mol/L吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(3)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。
2.一种检测硫酸乙酰肝素二糖组成的方法，步骤(1)包括用酶解与化学降解结合的方法将硫酸乙酰肝素降解为二糖
①将硫酸乙酰肝素酶解为硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
②用亚硝酸降解步骤①所得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。
3.一种检测硫酸乙酰肝素二糖的方法，所述的脱乙酰步骤包括：
将硫酸乙酰肝素溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90-111℃，反应4-20h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰产物；
所述的酶解步骤包括：
向硫酸乙酰肝素中加入含有20mmol/L的钙离子的肝素酶I、II和III，于37℃水浴中酶解48h，得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
所述的亚硝酸降解步骤包括：
将脱乙酰产物或硫酸乙酰肝素寡糖和二糖浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得硫酸乙酰肝素二糖。
化学降解反应方程式为：
酶解与化学降解结合反应方程式为：
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)可将硫酸乙酰肝素完全降解为二糖，可最大程度地得到硫酸乙酰肝素二糖的结构信息。
(2)降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低。
(3)适用范围广，适合于任何来源的硫酸乙酰肝素的检测分析。
(4)检测耗时短，可以同时对多种样品进行定量。
(5)样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好，检测限为ng级别。
附图说明
图1为HS二糖的D3PMP衍生LC图谱。
图2为HS化学降解所得二糖总离子流图(A)和质谱图(B)。
具体实施方式
实施例1-4的HS购自Celsus Laboratories公司
实施例1HS的化学降解
(1)将1mg HS溶于500uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应8小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得去乙酰产物。
(2)将步骤(1)所得产物浓缩至干，溶于100uL水中，加入100uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入100uLpH4.0的亚硝酸，0-5℃条件下反应10min，加入60uL氨水终止反应，得硫酸乙酰肝素二糖。
实施例2HS的化学降解
(1)将1mgHS溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90℃，反应4小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得去乙酰产物。
2)将步骤(1)所得产物浓缩至干，溶于100uL水中，加入100uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入100uLpH4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入60uL氨水终止反应，得硫酸乙酰肝素二糖。
实施例3HS化学降解
1)将1mgHS溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到111℃，反应20小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得去乙酰产物。
2)将步骤(1)所得产物浓缩至干，溶于100uL水中，加入100uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入100uLpH4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入60uL氨水终止反应，得硫酸乙酰肝素二糖。
对实施例1-3的降解产物进行检测，结果见表1。
表1化学降解产物分析
结果表明，实施例1和实施例3可以将HS完全化学降解，且实施例1所用的时间比实施例3节省了60％。实施例2中仍有7％聚合度大于2的寡糖存在。
实施例4HS的酶解与化学降解结合降解
(1)向50ugHS中加入200uL含肝素酶I、II和III，pH为7.3的缓冲液(50mmol/LTris-HCl、0.01％牛血清白蛋白、100mmol/LNaCl、20mmol/LCaCl2)，于37℃水浴中酶解48h，得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。
(2)将步骤(1)所得产物浓缩至干，溶于100uL水中，加入100uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入100uLpH4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入60uL氨水终止反应，得硫酸乙酰肝素二糖。
经第一步酶解获得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖，经计算，该化学降解法的硫酸乙酰肝素二糖的收率为99.98％，结果表明该化学降解法可将硫酸乙酰肝素完全降解为二糖。
实施例5-10涉及的硫酸乙酰肝素化学降解产物结构：
实施例5-10涉及的硫酸乙酰肝素二糖衍生产物的质量数：
表2硫酸乙酰肝素二糖衍生产物的质量数
实施例5-10涉及的衍生反应方程式：
Y＝H，Z＝H时为PMP；Y＝H，Z＝D时为D3PMP；Y＝D，Z＝H时为D5PMP；Y＝D，Z＝D时为D8PMP。实施例5HS酶解与化学降解结合降解所得二糖的D3PMP衍生及LC检测。
HS取自本实验室猪肠提取物。
(1)取50ugHS，按实施例4进行反应得降解产物。
(2)将降解产物浓缩至干，用50uL水溶解，加入3.5uL0.5mol/L D3PMP于2mL安瓿瓶中，调节pH值为8，于70℃条件下密封反应60min。反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂。
3)LC分析，液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。结果见图1。
结果显示，HS化学降解二糖产物在LC上可以分离得到9种组分，与理论一致。
实施例6HS酶解与化学降解结合降解所得二糖的D3PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
HS1和HS2分别取自本实验室猪肠提取物和猪肾提取物。
(1)取50ug HS1和HS2，按实施例4进行反应得降解产物。
(2)用35uL0.5mol/L D3PMP、35uL0.5mol/L D8PMP按照实施例5步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，HS1用D3PMP衍生，HS2用D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。将2种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表3。
表3HS酶解与化学降解结合降解所得二糖的D3PMP、D8PMP衍生LC-MS检测结果
由表可知，从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，HS1与HS2的每种二糖的含量是不同的，由比值可计算出各二糖占总糖的百分比。由此可以说明本方法可以对不同来源的HS进行二糖的定性及定量检测，可以同时对两种不同来源的样品进行分析。
实施例7HS化学降解所得二糖的PMP，D3PMP，D5PMP衍生及LC-MS检测
HS1，HS2和HS3分别来源于本实验室猪肠、猪肾提取物和Celsus Laboratories公司。
(1)取50ug HS1，HS2，HS3，按实施例1进行反应得到化学降解产物。
(2)用PMP，D3PMP，D5PMP按照实施例5步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，HS1用PMP衍生，HS2用D3PMP衍生，HS3用D5PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。将3种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表4。
表4HS化学降解所得二糖的PMP，D3PMP，D5PMP衍生LC-MS检测结果
由表可知，从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，HS1、HS2、HS3的每种二糖的含量是不同的，由比值可计算出各二糖占总糖的百分比。由此可以说明本发明方法可以对不同来源的HS进行二糖的定性及定量检测，可以同时对三种不同来源的样品进行分析。
实施例8HS化学降解所得二糖的PMP，D3PMP，D8PMP，D5PMP衍生及LC-MS检测
HS1，HS2，HS3，HS4分别来源于本实验室两种猪肠提取物，猪肾提取物和Celsus Laboratories公司。
(1)取50ugHS1，HS2，HS3，HS4，按实施例1进行反应得到化学降解产物。
(2)用PMP，D3PMP，D8PMP，D5PMP按照实施例5步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，HS1用PMP衍生HS2用D3PMP衍生HS3用D5PMP衍生HS4用D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。将4种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图2和表5。
表5HS化学降解所得二糖的PMP，D3PMP，D8PMP，D5PMP衍生LC-MS检测结果
由表5可知，从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，HS1、HS2、HS3、HS4的每种二糖的含量是不同的，从图2A可以看到九种组分，图2B中，每个质谱图都有四组峰，从左到右分别是HS1、HS2、HS3、HS4同种二糖的不同衍生物的离子峰。说明本方法可以对不同来源的HS进行二糖的定性及定量检测，可以同时对四种不同来源的样品进行分析。
实施例9HS化学降解所得二糖的D3PMP，D8PMP，D5PMP衍生及LC-MS检测
HS1，HS2，HS3分别来源于本实验室两种猪肾提取物和Celsus Laboratories公司。
(1)取50ugHS1，HS2，HS3，按实施例1进行反应得到化学降解产物。
(2)用D3PMP，D8PMP，D5PMP按照实施例5步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，HS1用D3PMP衍生，HS2用D5PMP衍生，HS3用D8PMP衍生
(3)LC-MS分析，液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。将3种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表6。
表6HS化学降解所得二糖的D3PMP，D8PMP，D5PMP衍生LC-MS检测结果
由表可知，从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，HS1、HS2、HS3的每种二糖含量是不同的，由比值可计算出各二糖占总糖的百分比。说明本方法可以对不同来源的HS进行二糖的定性及定量检测，可以同时对三种样品进行分析。
实施例10HS化学降解所得二糖的PMP，D8PMP衍生及LC-MS检测
HS1，HS2分别来源于本实验室猪肾提取物和Celsus Laboratories公司。
(1)取50ug HS1，HS2，按实施例1进行反应得到化学降解产物。
(2)用PMP，D8PMP按照实施例5步骤(2)的方法对降解产物进行衍生，HS1用PMP衍生，HS2用D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相条件：液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL；流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。将2种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表7。
表7HS化学降解所得二糖的PMP，D8PMP衍生LC-MS检测结果
由表可知，从MS上两种质量数的相对丰度比值一栏可以看出，HS1、HS2的每种二糖含量是不同的，由比值可计算出各二糖占总糖的百分比。说明本方法可以对不同来源的HS进行二糖的定性及定量检测，可以同时对两种样品进行分析。
Claims (5)
1.一种检测硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征于，包括如下步骤：
(1)用化学降解法将硫酸乙酰肝素降解为二糖
①将硫酸乙酰肝素脱乙酰基，得化学降解得到的脱乙酰产物；
②用亚硝酸降解步骤①所得化学降解得到的脱乙酰产物；
所述步骤①包括
将硫酸乙酰肝素溶于含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90～111℃，反应4～20h，反应完成后，冻干，除去N2H4得化学降解得到的脱乙酰产物；所述的硫酸乙酰肝素与N2H4·H2O的质量体积比mg/mL为1∶0.5～1；
步骤(1)还包括用酶解与化学降解结合的方法将硫酸乙酰肝素降解为二糖
③将硫酸乙酰肝素酶解为酶解得到的硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
④用亚硝酸降解步骤③所得酶解得到的硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
所述步骤③包括：
向硫酸乙酰肝素中加入含有20mmol/L的钙离子的肝素酶I、II和III，于37℃水浴中酶解48h，得酶解得到的硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；
上述步骤②和步骤④中所述的亚硝酸降解步骤包括：
将化学降解得到的脱乙酰产物或酶解得到的硫酸乙酰肝素寡糖和二糖浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0～5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0～5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得硫酸乙酰肝素二糖；所述的化学降解得到的脱乙酰产物或酶解得到的硫酸乙酰肝素寡糖和二糖的水溶液与亚硝酸钠水溶液、亚硝酸、氨水的体积比为1∶1∶1∶0.6；
(2)用衍生试剂衍生亚硝酸降解得到的硫酸乙酰肝素二糖
将亚硝酸降解得到的硫酸乙酰肝素二糖浓缩至干并溶解于水中，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂；
(3)用液相色谱法或液相色谱质谱联用法检测步骤(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。
2.如权利要求1所述的一种检测硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述步骤①包括：将硫酸乙酰肝素溶于含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应8h，反应完成后，冻干，除去N2H4得化学降解得到的脱乙酰产物；所述的硫酸乙酰肝素与N2H4·H2O的质量体积比mg/mL为1∶0.5～1。
3.如权利要求1所述的一种检测硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述亚硝酸降解得到的硫酸乙酰肝素二糖与吡唑啉酮类衍生试剂的质量之比为1∶6～60。
4.如权利要求1所述的一种检测硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述步骤③包括：向硫酸乙酰肝素中加入含肝素酶I、II和III，pH为7.3的50mmol/L Tris-HCl、0.01％牛血清白蛋白、100mmol/LNaCl和20mmol/L CaCl2的混合液，于37℃水浴中酶解48h，得酶解得到的硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。
5.如权利要求1所述的一种检测硫酸乙酰肝素二糖的方法，其特征在于，所述吡唑啉酮类衍生试剂包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮、1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-比唑啉酮中的一种或几种。
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