CN109596742B - 一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，旨在提供一种检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好的硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的检测方法；其方案是这样的：1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；4)用高效液相色谱方法检测定DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；5)计算HS含量；属于化学检测技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，属于化学检测技术领域。
背景技术
硫酸乙酰肝素(HeparinSulfate，简称HS)是一类广泛存在于动物组织基质及细胞膜的糖胺聚糖，其糖链由N～乙酰氨基葡糖胺通过α～(1～4)～糖苷键与葡糖醛酸或艾杜糖醛酸连接构成二糖单元，硫酸乙酰肝素成品中除主成分硫酸乙酰肝素外，还伴有少量的硫酸皮肤素(Dermatan Sulfate，DS)等杂质，由于硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的性质相近，很难直接用液相方法分离开来，甚至在美国药典肝素钠色谱鉴别仪器色谱条件下硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素在同一出峰时间出峰，故无法直接测定硫酸乙酰肝素的含量。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好的硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的检测方法。
为此，本发明提供的方案是这样的：
一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，依次包括下述步骤：
1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；
2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；
3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；
4)用高效液相色谱方法检测定DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；
5)计算HS含量。
优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，步骤1)硫酸皮肤素降解为DS双糖的方法是：将硫酸乙酰肝素成品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成2mg/ml的硫酸乙酰肝素母液，取2μl母液到50mM Tris-HCl缓冲液中稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100℃煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，步骤2)具体方法是：取DS标准品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成1mg/ml的DS母液，取母液0μl、1μl、3μl、6μl、9μl和12μl，分别溶于Tris-HCl缓冲液稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，作为一系列浓度梯度的标准溶液；再在各管分别加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100℃煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到一系列待检测标准溶液；再将各个浓度的标准溶液分别注入高效液相色谱仪检测，将检测到的前3个主要的DS双糖峰的峰面积相加，采用峰面积之和对DS双糖浓度作图，得到方程式和相关系数。
优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述的50mMTris-HCl缓冲液，含10mM CaCl2，pH7.0。
优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述的高效液色谱条件为：色谱柱：Waters Spherisorb S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm；流速1.40ml/min；波长为234nm，柱温：40℃，进样量50μl；流动相A是pH3.0的磷酸二氢钠溶液，流动相B是pH3.0的高氯酸钠和磷酸二氢钠溶液；梯度洗脱程序：0～2min，97％A、3％B；2～26min，97％～62％A、3％～38％B；26～30min，62～20％A、38～80％B；30～34min，20～97％A、80～3％B。
优选的，上述的的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述的流动相A的制备方法为：称取820mg的磷酸二氢钠溶于约1900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至2000ml，用0.22μm的滤膜过滤；所述的流动相B制备方法为：称取139g的一水合高氯酸钠和410mg的磷酸二氢钠，溶于约900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至1000ml，用0.22μm的滤膜过滤。
优选的，上述的的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，步骤3)具体步骤为：取硫酸乙酰肝素母液，采用HPLC检测条件检测该样品，将检测到的峰面积相加，然后用步骤2)得到的工作曲线计算出DS浓度，即为硫酸乙酰肝素中的DS含量。
优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，用高效液相色谱方法检测定DS+HS的总色谱峰峰面积的方法为：
1)标准溶液配制
2mg/ml的HS标准溶液的配制：精密称取20mg HS标准品至10ml容量瓶，用纯水溶解并定容；
2)样品处理
硫酸乙酰肝素成品25mg/ml待检测样品溶液：称取250mg样品于10ml容量瓶中，用纯水溶解并定容；
4)将处理后的待检测样品溶液注入高效液相色谱仪，所述的色谱条件：色谱柱：戴安分析柱：IonPac AS11-HC4×250mm；戴安保护柱：IonPac AG11-HC4×50mm；流速0.50ml/min；波长为202nm，柱温：40℃，进样量20μl；流动相A和流动相B与权利要求6所述的流动相相同；梯度洗脱程序：0～10min，75％A、25％B；10～35min，75％～0％A、25％～100％B；35～40min，0～0％A、100～100％B；40～41min，0～75％A、100～25％B；41～60min，75～75％A、25～25％B。
优选的，上述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，所述HS含量计算方法为：HS％＝(HS+DS)％-DS％；
式中：
(HS+DS)％＝0.08×A 测试样品 /A HS标准 ×100％
A 测试样品 为202nm条件下，3次测试待检测样品溶液中HS+DS峰的峰面积的平均值；
A HS标准 为202nm条件下，前3针HS标准溶液中主峰面积的平均值；
DS％为根据DS工作曲线计算所得到的数据。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：
本发明提供的首先使用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素充分降解为以DS双糖为主的片段，用高效液相方法检测降解物中的DS双糖，计算峰面积和，采用外标法在标准曲线上读出样品的硫酸皮肤素含量，然后根据样品中的HS和DS在适当的离子色谱条件下同时出峰的特性测出样品的(DS+HS)的含量，最后再将该含量扣除DS含量从而得到样品的HS含量；检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好。
说明书附图
图1是DS酶解后的双糖色谱图；
图2是DS工作曲线；
图3是HS+DS的含量图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的权利要求做进一步的详细说明。
需要说明的是，本申请所检测的所有含量均为质量百分含量。
一、检测DS质量百分含量
原理：以硫酸软骨素酶B(DS酶)为工具，特异性地将硫酸乙酰肝素中的硫酸皮肤素充分降解为以DS双糖为主的片段，用高效液相法检测样品DS的双糖峰面积，从而计算出硫酸皮肤素的含量。
1.1、样品的DS双糖
取100mg某批号硫酸乙酰肝素成品，溶于50ml Tris-HCl缓冲液(50mM，含10mMCaCl2，pH7.0)，配制成2mg/ml的硫酸乙酰肝素母液，取2μl母液到50mM Tris-HCl缓冲液中稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100摄氏度煮沸使酶失活，最后0.22um微孔滤膜过滤除菌。
1.2、工作曲线所需的DS双糖
取50mgDS标准品溶于50mlTris-HCl缓冲液(50mM，含10mMCaCl2，pH7.0)，配制成1mg/ml的DS母液，分别取母液0μl、1μl、3μl、6μl、9μl和12μl，各以50mMTris-HCl缓冲液(含10mMCaCl2，pH7.0)稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，作为一系列浓度梯度的标准溶液。各管分别加入1IU的DS酶，在37℃水浴条件下温育酶解24h，接着100℃煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
1.3、标准品DS双糖检测
将各个梯度标准溶液分别注入高效液相色谱柱，进行HPLC检测，色谱条件如表1所示；洗脱梯度如表2所示。
表1
表2
流动相A：称取820mg的磷酸二氢钠溶于约1900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至2000ml，用0.22μm的滤膜过滤。
流动相B：称取139g的一水合高氯酸钠和410mg的磷酸二氢钠，溶于约900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至1000ml，用0.22μm的滤膜过滤。
1.4、DS双糖代表DS的最佳方式
DS酶解后的双糖峰有三种主要的峰：F1、F2和F3。
F1、F2和F3的结构分别是：
F1:
△UA-GalNAc,4S:
F2:
△UA-GalNAc,4S,6S
或者△UA,2S-GalNAc,6S
F3:
△UA,2S-GalNAc,4S
在本实施例中，按照所设色谱条件及洗脱方法分别进样，分别计算各图谱中F1、F2和F3的峰面积和，参阅图1；得到硫酸皮肤素重量和双糖峰面积和的对应关系，见表3。
表3
由上述三个双糖的峰面积之和，对DS重量作图，得到方程式和相关系数：Y＝277517X+28.653；R2＝0.9993。(Y为峰面积，X为DS重量)
1.5、DS含量的测定
取第1.1步骤中的样品酶解后的溶液，采用第1.3步骤中的HPLC方法检测该样品得到的F1、F2以及F3的峰面积之和，然后用第1.4步骤得到的工作曲线，计算出DS含量，即为该批次硫酸乙酰肝素成品中的DS含量:0.09％。
二、(DS+HS)含量的测定
原理：根据样品中的HS和DS在适当的离子色谱条件下同时出峰的特性测出样品的(DS+HS)的含量。
2.1、标准溶液配制
2mg/ml的HS标准溶液的配制：精密称取20mgHS标准品至10ml容量瓶，用纯水溶解并定容。
2.2、样品处理
25mg/ml硫酸乙酰肝素成品测试溶液：称取250mg样品于10ml容量瓶中，用纯水溶解并定容。
2.3、将测试溶液注入高效液相色谱中检测，色谱条件如表4所示；梯度洗脱程序(waters2695)如表5所示：
具体操作为：开启高效液相色谱仪后根据色谱条件设定好色谱系统，先用纯水清洗管路，再接上色谱柱用纯水冲洗。接着，用流动相A冲洗10min以上，然后用流动相B冲洗10min以上。打开紫外检测器并预热30分钟以上，观察到5分钟内检测器基线电信号波动幅度小于0.05AU时即可进样。
表4
表5
流动相A：称取820mg的磷酸二氢钠溶于约1900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至2000ml，用0.22μm的滤膜过滤。
流动相B：称取139g的一水合高氯酸钠和410mg的磷酸二氢钠，溶于约900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至1000ml，用0.22μm的滤膜过滤。
2.4、进样分析
首先，判断系统适应性：样品分析前，进样分析空白溶液(纯水)一次，然后进样分析3针HS标准溶液，进样量为20μl，积分求出HS标准溶液的HS峰面积，若HS标准溶液主峰面积的RSD≤5％时，表明系统适应性合格。
其次，进样分析硫酸乙酰肝素测试溶液，进样3次，分别记录色谱图。
2.5、样品结果计算：每针样品中(HS+DS)的含量(％)(扣除空白溶液基线)
(HS+DS)％＝0.08×A 测试样品 /A HS标准 ×100％
A 测试样品 为202nm条件下，3次测试待检测样品溶液中HS+DS峰的峰面积的平均值；
A HS标准 为202nm条件下，前3针HS标准溶液中主峰面积的平均值；
DS％为根据DS工作曲线计算所得到的数据。
根据上述给出的方法，对该批次硫酸乙酰肝素成品进行计算，谱图参阅图3；计算得到该批次硫酸乙酰肝素成品的(HS+DS)％＝99.99％
三、HS含量
HS％＝(HS+DS)％-DS％
式中：(HS+DS)％为2.5项下计算结果，对于该批次硫酸乙酰肝素成品为99.99％；
DS％为1.5项下计算结果，对于该批次硫酸乙酰肝素成品为0.09％。
因此，对于该批次硫酸乙酰肝素成品，其主要成分硫酸乙酰肝素的含量：
HS％＝99.90％
以上内容是结合具体的优选实施方式，对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (6)
1.一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1）采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；
2）制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；
3）用高效液相色谱方法检测步骤1）降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；
4）用高效液相色谱方法检测DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；
5）计算HS含量；
步骤1）硫酸皮肤素降解为DS双糖的方法是：将硫酸乙酰肝素成品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成0.1-20mg/ml的硫酸乙酰肝素母液，取母液到Tris-HCl缓冲液中后稀释, 加入DS酶充分降解，在30-45℃水浴条件下温育酶解12-36h，接着煮沸使酶失活，最后微孔滤膜过滤除菌;
步骤2）所述的高效液色谱条件为：色谱柱：Waters Spherisorb S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm；流速1.40ml/min；波长为234nm，柱温：40℃，进样量50μl；流动相A是pH3.0的磷酸二氢钠溶液，流动相B是pH3.0的高氯酸钠和磷酸二氢钠溶液；梯度洗脱程序：0～2min，97％A、3％B；2～26min，97％～62％A、3％～38％B；26～30min，62～20％A、38～80％B；30～34min，20～97％A、80～3％B;
用高效液相色谱方法检测DS+HS的总色谱峰峰面积的方法为：
1）标准溶液配制
2mg/ml的HS标准溶液的配制：精密称取20mgHS标准品至10ml容量瓶，用纯水溶解并定容；
2）样品处理
硫酸乙酰肝素成品25mg/ml待检测样品溶液：称取250mg样品于10ml容量瓶中，用纯水溶解并定容；
3）将处理后的待检测样品溶液注入高效液相色谱仪，所述的色谱条件：色谱柱：戴安分析柱：IonPac AS11-HC 4×250mm；戴安保护柱：IonPac AG11-HC 4×50mm ；流速0.50ml/min；波长为202nm，柱温：40℃，进样量20μl；流动相A是pH3.0的磷酸二氢钠溶液，流动相B是pH3.0的高氯酸钠和磷酸二氢钠溶液；梯度洗脱程序：0～10min，75％A、25％B；10～35min，75％～0％A、25％～100％B；35～40min，0～0％A、100～100％B；40～41min，0～75％A、100～25％B；41～60min，75～75％A、25～25％B。
2.根据权利要求1所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，步骤2）具体方法是：取DS标准品溶于Tris-HCl缓冲液，配制成1mg/ml的DS母液，取母液0μl、1μl、3μl、6μl、9μl和12μl，分别溶于Tris-HCl缓冲液稀释成0.5ml，置于1.5ml离心管中，作为一系列浓度梯度的标准溶液；再在各管分别加入1IU的DS酶，在30-45℃水浴条件下温育酶解12-36h，接着煮沸使酶失活，最后0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到一系列待检测标准溶液；再将各个浓度的标准溶液分别注入高效液相色谱仪检测，将检测到的前3个DS双糖峰的峰面积相加，采用峰面积之和对DS双糖浓度作图，得到方程式和相关系数。
3.根据权利要求1或2所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，所述 Tris-HCl 缓冲液为 50mM Tris-HCl缓冲液，含10mMCaCl2，pH7.0。
4.根据权利要求1所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，所述的流动相A的制备方法为：称取820mg的磷酸二氢钠溶于约1900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至2000ml，用0.22μm的滤膜过滤；所述的流动相B制备方法为：称取139g的一水合高氯酸钠和410mg的磷酸二氢钠，溶于约900ml的纯水中，用磷酸调节pH到3.0，加水至1000ml，用0.22μm的滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，步骤3）具体步骤为：取步骤1）中的硫酸乙酰肝素母液，采用步骤2）中的HPLC检测条件检测该样品，将检测到的峰面积相加，然后用步骤2）得到的工作曲线计算出DS浓度，即为硫酸乙酰肝素中的DS含量。
6.根据权利要求1所述的检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，其特征在于，所述的HS含量计算方法为：HS%=(HS+DS)%-DS%；
式中：
(HS+DS)%=0.08×A 测试样品 /A HS标准 ×100%
A 测试样品 为202nm条件下，3次测试待检测样品溶液中HS+DS峰的峰面积的平均值；
A HS标准 为202nm条件下，前3针HS标准溶液中主峰面积的平均值；
DS%为权利要求1计算的结果。
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