KR20050057550A - 헤파린을 형성하는 특정 그룹의 측정 방법 - Google Patents

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KR20050057550A
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Abstract

본 발명은 헤파린 또는 저분자량 헤파린을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 분석하고자 하는 샘플을 헤파리나제에 의해 탈중합시키고, 필요에 따라, 수득된 탈중합체를 환원시킴을 특징으로 한다. 이어서, 고성능 액체 크로마토그래피 분석을 수행한다.

Description

헤파린을 형성하는 특정 그룹의 측정 방법{Method of determining specific groups forming heparins}
본 발명의 주제는 헤파린 또는 저분자량 헤파린을 구성하는 특정 그룹을 분석하는 방법에 관한 것이다.
순수한 헤파린으로부터 에녹사파린(로베녹스(LovenoxR))을 제조하는 공정[참조: 미국 특허 제5,389,618] 동안, 수성상 알칼리성 탈중합 공정은 부분적이지만 특징적인, 올리고사카라이드 쇄의 환원 말단의 글루코사민의 전환을 야기한다.
상기 전환법의 제1 단계는 글루코사민만노사민 에피머화[참조: T. Toida et al., J. Carbohydrate Chemistry, 15(3), 351-360 (1996)]로 이루어지며, 제2 단계는 "1,6-안하이드로"[참조: 국제특허출원 제WO 01/29055]로 지칭되는 유도체의 형성을 유도하는 글루코사민의 6-O-탈황산화이다.
이러한 종류의 유도체는 말단 글루코사민이 6-O-황산화된 올리고사카라이드 쇄의 경우에만 수득된다.
말단이 1,6-안하이드로 결합으로 변형된 올리고사카라이드의 비율은 로베녹스의 올리고사카라이드 혼합물의 구조적 특징이며 이를 측정하는 것이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명은 헤파린, 저분자량 헤파린 및 특히 로베녹스의 분석 방법으로 이루어진다.
본 발명에 따른 분석 방법은 다음과 같다:
분석하고자 하는 샘플을 헤파리나제의 작용에 의해 탈중합시킨 다음, 경우에 따라, 수득된 탈중합체를 환원시키고, 이어서 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분석을 수행한다.
따라서, 상기 정의한 바와 같은 방법은, 말단이 1,6-안하이드로 결합("1,6-안하이드로 그룹")으로 변형된 올리고뉴클라이드 쇄의 존재에 대해 조사함을 특징으로 한다.
특히, 분석하고자 하는 샘플은 우선 첫째로 헤파리나제, 특히 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7.), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8.)(이들 효소는 그램피안 엔자임(Grampian Enzymes) 그룹에 의해 시판되고 있다)의 혼합물로 철저히 탈중합시킨다.
따라서, 본 발명의 주제는 다음 단계들이 수행됨을 특징으로 하는, 헤파린 또는 저분자량 헤파린의 분석 방법이다:
(1) 샘플을 헤파리나제의 작용에 의해 탈중합시키는 단계,
(2) 경우에 따라, 탈중합체를 환원시키는 단계 및
(3) 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 단계.
본 발명의 주제는 보다 특히, 헤파리나제가 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7.), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8.)의 혼합물 형태임을 특징으로 하는, 상기 정의한 바와 같은 방법이다.
이어서, 이렇게 제조된 탈중합체는 바람직하게는 나트륨 아세테이트 중의 NaBH4 용액으로 처리한다. 나중의 조작은 1,6-안하이드로 형태(특허 출원 제WO 01/72762호에 기술된 생성물)가 아닌 환원 말단을 특이적으로 환원시킬 수 있도록 한다. 마지막으로, 하기 기술하는 디사카라이드 1 및 2를 정량할 수 있도록, 헤파리나제로 탈중합된 저분자량 헤파린 샘플을 NaBH4와 같은 환원제의 작용에 의해 환원시켜야 한다.
따라서, 본 발명의 주제는 보다 특히, 탈중합된 헤파린이 후속적으로 환원됨을 특징으로 하는, 상기 정의한 바와 같은 방법이다.
본 발명의 주제는 가장 특히, 환원제가 NaBH4임을 특징으로 하는 상기 정의한 바와 같은 방법이다. 리튬 또는 칼륨과 같은, 수소화붕소의 다른 알칼리 금속 염이 임의로 사용될 수 있다.
이어서, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 및 특히 음이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 1,6-안하이드로 말단의 분석을 수행한다.
본 발명에 따른 분석 방법은, 이러한 "1,6-안하이드로" 유도체를 함유하지 않는 다른 저분자량 헤파린으로부터 로베녹스를 명백히 구별할 수 있도록 한다. 환언하면, 본 발명에 따른 분석 방법은 저분자량 헤파린이 로베녹스의 약리화학적 특징을 충족시키지 않기 때문에 당연히 상이하다는 것을 규명할 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 분석 방법은 로베녹스 제조 공정의 표준화를 제공하고 균일한 뱃치를 수득하기 위해 샘플의 공정내부 제어(in-process control) 동안 산업 공정에 적용할 수 있다.
효소적 탈중합 및 환원 말단의 환원 후, 로베녹스의 1,6-안하이드로 유도체는 4가지의 필수적 형태로 존재한다. 따라서, 본 발명의 주제는 또한, 탈중합 반응 동안 수득된 1,6-안하이드로 잔기가 다음과 같음을 특징으로 하는, 상기한 바와 같은 방법이다.
최종 디사카라이드 단위에 1,6-안하이드로 말단을 함유하며 상기 최종 디사카라이드의 우론산에 2-O-설페이트를 지니지 않는 모든 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 헤파리나제에 의해 완전히 탈중합되어 디사카라이드 1 및 2 형태가 된다. 반면에, 상기 최종 사카라이드가 우론산에 2-O-설페이트를 함유하는 경우와 상기 최종 사카라이드가 만노스 형태인 경우에, 1,6-안하이드로 유도체는 테트라사카라이드 1의 형태(헤파리나제에 대해 내성인 형태)이다.
트리사카라이드 1(하기 참조)는 또한 혼합물로서 존재한다. 이는 하기 구조를 생성시키는 다른 분해 공정(로베녹스의 화학적 탈중합 동안 관찰된 박리 현상)으로부터 유도된다.
혼합물의 다른 성분은 오직 로베녹스만의 특징이다. 물론 헤파린 쇄의 8개의 기본 디사카라이드가 존재한다. 이러한 8개의 기본 디사카라이드는 특히 시그마(Sigma)사에 의해 시판되고 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 다음과 같은 다른 디사카라이드가 혼합물 형태로 동정되었다: 시초로서, 2-갈락투론산의 형성을 유도하는 -IdoA(2S)-GlcNS(6S)- 및 -IdoA(2S)-GlcNS-의 알칼리성 2-O-탈황산화를 갖는 디사카라이드 ΔIISgal 및 ΔIVSgal. 이들 디사카라이드는 통상적으로 헤파린의 본래 구조로 존재하지 않는다[참조: U.M. Desai et al., Arch. Biochem. Biophys, 306 (2) 461-468 (1993)].
3-O-황산화 글루코사민을 함유하는 올리고사카라이드는 헤파리나제에 의한 분해에 내성이 있으며 테트라사카라이드 형태로 지속적으로 존재한다.
저분자량 헤파린의 경우, 헤파린은 돼지 점액으로부터 추출되며, 이러한 주요 테트라사카라이드는 하기와 같이 표현된다. 이들 테트라사카라이드는 효소적 탈중합에 대해 내성이 있으며 안티트롬빈 III에 대한 친화성을 갖는 서열을 반영한다. 이들 테트라사카라이드는 다음과 같은 기호로 나타내진다: ΔIIa-IIs glu 및 ΔIIa-IVs glu[참조: S. YAMADA, K. YOSHIDA, M. SUGIURA, K-H KHOO, H.R. MORRIS, A. DELL, J. Biol. Chem.; 270(7), 4780-4787 (1993)].
헤파리나제로 분해된 혼합물의 최종 성분은 글리코세린 말단 ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser이다[참조: K. SUGAHARA, H. TSUDA, K. YOSHIDA, S. YAMADA, J. Biol. Chem.; 270 (39), 22914-22923 (1995); K. SUGAHARA, S. YAMADA, K. YOSHIDA, P. de WAARD, J.F.G. VLIEGENTHART; J. Biol. Chem.; 67(3), 1528-1533 (1992)]. 상기 최종 성분은 일반적으로 로베녹스 중에 거의 존재하지 않는다(실시예 5의 NMR 참조).
본 발명의 다른 측면은 1,6-안하이드로 그룹을 측정하기 위해 사용되는 크로마토그래피 공정이다. 우선 첫째로, 이는 탈중합 및 NaBH4와 같은 환원제 처리 후에 수득된 각종 폴리사카라이드를 분리시킴을 포함한다.
음이온-교환 크로마토그래피(SAX)는 이러한 복합 혼합물에 가장 적합한 분리 방법이다. 입자 크기가 5㎛이고 길이가 25cm인 스페리소르브(Spherisorb) SAX 유형의 정지상으로 충전된 컬럼을 사용할 수 있다. 직경이 1mm 내지 4.6mm인 모든 통상의 컬럼을 사용할 수 있다.
사용되는 장치는 UV 검출기, 보다 바람직하게는 성분들의 UV 스펙트럼을 생성시키고, 2가지의 상이한 파장에서의 흡광도 간의 차이로부터 발생하는 복합 시그날을 기록하기 위한 다이오드 어레이가 장착된 UV 검출기 사용시에 용출 구배가 형성될 수 있도록 하고 아세틸화 올리고사카라이드의 특이적 검출을 가능하게 하는 크로마토그래프일 수 있다. 이러한 유형의 검출이 가능하게 하기 위해, 200nm 이하의 UV 영역에서 투과성인 이동상이 바람직하다. 이는, 클로라이드의 부식력에 내성이 있기 위해서 부동태화된 크로마토그램을 필요로한다는 단점을 또한 갖고 있는 NaCl에 기초하는 통상의 이동상을 배제한다. 본원에서 사용되는 이동상은 바람직하게는 과염소산나트륨에 기초할 수 있지만, 메탄설포네이트 또는 포스페이트 염이 사용될 수도 있다.
분리를 위해 권장되는 pH는 2 내지 6.5이다. 바람직하게는, 3 범위의 pH가 사용될 수 있다. 본원에서 pH는 pH=3에서 완충력을 갖는 포스페이트와 같은 염을 첨가함으로써 조절하며, 포스페이트의 완충력은 과염소산염의 완충력보다 우수하다.
예를 들어, 표준 크로마토그래피 분리 조건은 하기에 기술한다:
용매 A: NaH2PO4, 2.5mM, H3PO4를 첨가하여 pH 2.9가 되도록 함.
용매 B: NaClO4 1N- NaH2PO4, 2.5mM, H3PO4를 첨가하여 pH 3.0이 되도록 함.
용출 구배는 다음과 같을 수 있다.
T= 0분: %B=3; T=40분: %B=60; T=60분: %B=80
따라서, 본 발명의 주제는 또한, 200nM 이하의 UV 영역에서 투과성인 이동상이 사용됨을 특징으로 하는, 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리에 의한 상기 정의한 바와 같은 분석 방법이다.
본 발명의 주제는 보다 특히, 과염소산나트륨, 메탄설포네이트 염 또는 포스페이트 염에 기초하는 상기 정의한 바와 같은 이동상이다.
또 다른 중요한 측면은 검출 방법이다.
UV 검출의 특이성을 증가시키기 위해 방법을 개발한다. 모든 비아세틸화 폴리사카라이드가 소정의 pH에서 상당히 유사한 UV 스펙트럼을 갖기 때문에, 비아세틸화 사카라이드의 흡광도가 소멸되도록 선택된 2가지 파장에서의 흡광도 간의 차이를 시그날로서 취함으로써 아세틸화 당을 선택적으로 검출할 수 있다.
하기의 경우에, 202nm 및 230nm가 검출 및 참조 파장으로서 선택될 수 있으며 202 내지 230nm 시그날이 주지될 것이다. 과정의 선택은 이동상의 pH에 따라 좌우된다(수 nm의 조정은 상기 조건이 최적화되기 위해 필수적일 수 있다). 이러한 기술에 가장 적합한 검출기는 DAD 1100 검출기(제조원: Agilent Technologies)이다. 이러한 경우에, 이중 검출은 한편으로는 234nm에서 수행할 수 있으며, 다른 한편으로는 202 내지 230nm에서 수행할 수 있다. 아세틸화 올리고사카라이드의 선택적 검출의 원리는 하기 도면에 예시되어 있으며, 하기 도면에서는 황산화 디사카라이드 델타 1s의 UV 파장을 아세틸화 디사카라이드 델타 1a의 UV 파장과 비교한다.
따라서, 본 발명의 주제는 또한 당해 검출 방법으로 아세틸화 당을 선택적으로 검출할 수 있음을 특징으로 하는, 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리를 이용한 상기 정의한 바와 같은 분석 방법이다.
본 발명은 주제는 또한 가장 특히, 아세틸화 당의 선택적 검출을, 비아세틸화 사카라이드의 흡광도가 소멸되도록 선택된 2가지 파장에서의 흡광도 간의 차이를 시그날로서 취하면서 수행함을 특징으로 하는, 교환 크로마토그래피에 의한 분리를 이용한 상기 정의한 바와 같은 분석 방법이다.
상기한 4개의 1,4-안하이드로 잔기의 정량은 혼합물의 모든 다른 성분과 관련하여 크로마토그래피 시스템의 충분한 선택성을 필요로 한다. 그러나, 일반적으로 공동 용출되는 2개의 디사카라이드 1 및 2는 ΔIIa에 관해서 거의 분해되지 않는데, 이는 특히 디사카라이드 2가 이의 2개의 α 및 β아노머 형태로 존재하기 때문이다.
2개의 디사카라이드 1 및 2의 정체는, 이들이 NaOH를 첨가하여 pH 13이 된 ΔIIs의 수용액 속에서 실온에서 수시간 내에 형성되기 때문에 용이하게 검증될 수 있다. 그러나, 이중 검출이 사용되는 경우, 아세틸화 올리고사카라이드 ΔIVa, ΔIIa, VIIIa, ΔIa, VIIa-IVs glu 및 ΔIIa-IIs glu은 용이하게 동정할 수 있다.
피크의 분리 원인은 한편으로는 아노머 형태이며, 보다 적은 정도로는, ΔIIs, ΔIIIs 및 ΔIs가 올리고사카라이드 쇄의 최종 위치에 있을 때에 부분적으로 존재하는 글루코사민만노사민 에피머화이다.
디사카라이드 1 및 2를 정량할 수 있도록, 헤파리나제에 의해 탈중합된 저분자량 헤파린 샘플을 NaBH4의 작용에 의해 환원시킨다.
이러한 환원은 말단 올리고사카라이드 환을 개환시킴으로써 αβ 아노머화를 제거한다는 잇점을 갖고 있다. 수득된 크로마토그램은 보다 단순하였는데, 이는 아노머화가 제거되고 특히 ΔIIa의 환원이 컬럼상에서의 이의 체류를 감소시키고 디사카라이드 1 및 2가 용이하게 분석되도록 하기 때문이다.
하기 도 1 및 2에 기술된 크로마토그램의 예는 이러한 현상들과 본 방법의 잇점을 명료하게 예시한다.
마지막으로, 본 발명의 주제는 또한 디사카라이드 1, 디사카라이드 2, 디사카라이드 3 및 트리사카라이드 1로부터 선택된, 탈중합 및 환원 공정을 사용하여 수득한 신규한 사카라이드 유도체이다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만, 본 발명의 속성을 제한하지는 않는다.
실시예 1
효소적 탈중합을, 20mg/ml의 분석하고자 하는 저분자량 헤파린, 2mM 칼슘 아세테이트를 함유하는 pH 7.0의 100mM 아세트산/NaOH 용액 및 1mg/ml의 BSA를 3가지 헤파리나제의 모액 50㎕와 혼합하여 실온에서 48시간 동안 수행한다.
환원을, NaBH4 용액 10㎕를 사용하기 직전에 제조된 100mM 나트륨 아세테이트 속에 30g/ℓ로 첨가함으로써 헤파리나제로 탈중합된 생성물 60㎕에서 수행한다. 헤파리나제를 -30℃에서 저장함이 주지될 것이다. 헤파리나제는 완충액 속에 존재하며 이의 역가는 0.5 IU/ml(완충액의 조성: 2mg/ml의 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 0.01mol/l 농도의 KH2PO4의 수용액(pH 7))이다.
실시예 2
상기한 공정에 따라 수득된 디사카라이드 3의 NMR
D2O 중의 양성자 스펙트럼, 400 MHz, T=298K, δ(ppm): 3.34 (1H, dd, J=7 및 2Hz, H2), 3.72 (1H, t, J=8Hz, H6), 3.90 (1H, m, H3), 4.03 (1H, s, H4), 4.20 (1H, d, J=8Hz, H6), 4.23 (1H, t, J=5Hz, H3', 4.58 (1H, m, H2', 4.78 (1H, m, H5), 5.50 (1H, s, H1), 5.60 (1H, dd, J=6 및 1Hz, H1', 6.03 (1H, d, J=5Hz, H4'].
실시예 3
상기한 공정에 따라 수득된 테트라사카라이드 1의 NMR
D2O 중의 양성자 스펙트럼, 400 MHz, T=298K, δ(ppm): 3.15 (1H, s, H2), 3.25 (1H, m, H2"), 3.60 (1H, m, H3"), 3.70 내지 4.70 (14H, 미분해된 착체, H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5', H4"/H5"/H6", H2'''/H3'''), 4.75 (1H, m, H5), 5.20 내지 5.40 (2H, m, H1' 및 H1"), 5.45 (1H, m, H1'''), 5.56 (1H, m, H1), 5.94 (1H, d, J=5Hz, H4)
실시예 4
상기한 공정에 따라 수득된 트리사카라이드 1의 NMR
D2O 중의 스펙트럼, 600 MHz, (δ(ppm)): 3.28 (1H, m), 3.61 (1H, t, 7Hz), 3.79 (1H, t, 7Hz), 3.95 (1H, d, 6Hz), 4.00 (1H, s), 4.20 (1H, m), 4.28 (2H, m), 4.32 (1H, d, 4Hz), 4.41 (1H, s), 4.58 (1H, s), 4.61 (1H, s), 4.90 (1H, 광역 s), 5.24 (1H, s), 5.45 (1H, s), 5.95 (1H, s).
실시예 5:
ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser의 NMR
D2O 중의 스펙트럼, 500 MHz (δ(ppm)): 3.30 (1H, t, 7Hz), 3.34 (1H, t, 8Hz), 3.55 (1H, t, 7Hz), 3.60 (1H, t, 7Hz), 3.63 내지 3.85 (10H, m), 3.91 (2H, m), 3.96 (1H, dd, 7 and 2Hz), 4.02 내지 4.10 (3H, m), 4.12 (1H, d, 2Hz), 4.18 (1H, m), 4.40 (1H, d, 6Hz), 4.46 (1H, d, 6Hz), 4.61 (1H, d, 6Hz), 5.29 (1H, d, 3Hz), 5.85 (1H, d, 3Hz).
실시예 6: 정량의 원리
본 발명에 따른 방법에서, 혼합물 중에 함유된 모든 불포화 올리고사카라이드는 5500mol-1.l.cm-1에 해당되는 동일한 몰 흡광도를 갖는 가설이 광범위하게 채택되었다.
따라서, 출발 저분자량 헤파린 중의 탈중합된 혼합물의 모든 성분의 중량%를 측정할 수 있다. 피크 7, 8, 13 및 19에 상응하는 4개의 1,6-안하이드로 유도체에 있어, 중량%는 다음과 같이 수득된다:
;
;
.
면적7, 면적8, 면적13 및 면적19는 각각의 피크 7, 8, 13 및 19의 면적에 상응한다. 이들 4개의 화합물 각각의 몰 질량은 각각 443, 443, 545 및 1210이다. ∑Mwx·면적x는 상응하는 생성물의 몰 질량을 기준으로 한 크로마토그램의 각각의 피크의 면적 비에 상응한다.
Mw가 연구된 저분자량 헤파린의 평균 질량인 경우, 1,6-안하이드로 환으로 종결되는 올리고사카라이드의 비율은 다음 방식으로 수득된다.
성분의 분자 질량은 다음과 같다:
사카라이드의 명명법 및 도 1 및 2에 따른 피크와의 대응
IdoA: α-L-요오도피라노실우론산;
GlcA: β-D-글루코피라노실우론산;
ΔGlcA: 4,5-불포화 산: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산
Gal: D-갈락토스;
Xyl: 크실로즈;
GlcNAc : 2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루코피라노즈;
GlcNS : 2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루코피라노즈;
2S: 2-0-설페이트,
3S: 3-0-설페이트,
6S: 6-O-설페이트,
1: ΔGlcAβ1-3 Galβ1-3 Galβ1-4 Xyl β1-O-Ser
2: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루코피라노실 나트륨 염
3: ΔGlcAβ1-3 Galβ1-3 Galβ1-4 Xylβ1-O-CH2-COOH
4: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔갈락토피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루코피라노즈 이나트륨 염
5: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루코피라노실 나트륨 염
6: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실 이나트륨 염
7: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루코피라노즈 이나트륨 염(디사카라이드 1)
8: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시-2-설파미도-β-D-만노피라노즈 이나트륨 염(디사카라이드 2)
9 : 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루코피라노실 이나트륨 염
10: 4-데옥시-α-L-트레오헥스-4-엔갈락토피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-β-D-글루코피라노즈 삼나트륨 염
11: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-β-D-글루코피라노실 삼나트륨 염
12: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2--설파미도-α-D-글루코피라노실 삼나트륨 염
13: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥스-4-엔피라노실-우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루코피라노즈 삼나트륨염(디사카라이드 3)
14: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실 삼나트륨 염
15: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-3-O-설포-α-D-글루코피라노실) 오나트륨 염
16: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실 사나트륨 염
17: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-3,6-디-O-설포-α-D-글루코피라노실) 육나트륨 염
18: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-D-글루코피라노실-(1→4)-2-O-설포-α-L-요오도피라노실우론산 육나트륨 염
19: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-0-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-2-O-설포-α-L-요오도피라노실우론산-(1→4)-1,6-안하이드로-2-데옥시설파미도-β-D-만노피라노즈, 육나트륨 염(테트라사카라이드 1)
20: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루시톨 나트륨 염
21: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-β-D-글루시톨 이나트륨 염
22: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루시톨 이나트륨 염
23: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 이나트륨 염
24: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-α-D-글루시톨 이나트륨 염
25: 4-데옥시-α-L-트레오헥센갈락토피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-β-D-글루시톨 삼나트륨 염
26: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
27: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
28: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
29: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-3-O-설포-α-D-글루시톨) 오나트륨 염
30: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루시톨 삼나트륨 염
31: 4-데옥시-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세트아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2- 설파미도-3,6-디-0-설포-α-D-글루시톨) 육나트륨 염
32: 4-데옥시-2-O-설포-α-L-트레오헥센피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-0-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-2-O-설포-α-L-요오도피라노실우론산 육나트륨 염(NaBH4에 의해 환원된 형태)
도 1
NaBH4로 환원시키기 전과 후의, 헤파리나제로 탈중합된 에녹사파린의 크로마토그래피 분리(가는 흑색선의 시그날: 234nm에서의 UV; 굵은 흑색선의 시그날: 202 내지 234nm에서의 UV)
도 2
NaBH4로 환원시키기 전과 후의, 헤파리나제로 탈중합된 헤파린의 크로마토그래피 분리(가는 흑색선의 시그날: 234nm에서의 UV; 굵은 흑색선의 시그날: 202 내지 234nm에서의 UV)

Claims (15)

1- 헤파리나제의 작용에 의해 샘플을 탈중합시키는 단계,
2- 경우에 따라, 탈중합체를 환원시키는 단계 및
3- 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석하는 단계가 수행됨을 특징으로 하는, 헤파린 또는 저분자량 헤파린의 분석 방법.
제1항에 있어서, 말단이 1,6-안하이드로 결합으로 변형된 올리고사카라이드 쇄의 존재에 대해 조사를 수행함을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 헤파리나제가 헤파리나제 1(EC 4.2.2.7.), 헤파리나제 2(헤파린 리아제 II) 및 헤파리나제 3(EC 4.2.2.8.)의 혼합물 형태인 방법.
제1항에 있어서, 헤파리나제의 작용에 의해 탈중합된 헤파린(탈중합체)를 후속적으로 환원제에 적용시킴을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 환원제가 NaBH4 또는 수소화붕소 음이온의 알칼리 금속 염인 방법.
제1항에 있어서, 사용되는 크로마토그래피 방법이 음이온-교환 크로마토그래피인 방법.
제6항에 있어서, 200nm 이하의 UV 영역에서 투과성인 이동상이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 사용되는 이동상이 과염소산나트륨, 메탄설포네이트 염 또는 포스페이트 염임을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 아세틸화 당을 선택적으로 검출할 수 있도록 하는 검출 방법이 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 아세틸화 당의 선택적 검출을, 비아세틸화 사카라이드의 흡광도가 소멸되도록 선택된 2가지 파장에서의 흡광도 간의 차이를 시그날로서 취하면서 수행함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 탈중합 반응 동안 수득된 1,6-안하이드로 잔기가 임을 특징으로 하는 방법.
화학식 의 1,6-안하이드로 유도체(디사카라이드 1).
화학식 의 1,6-안하이드로 유도체(디사카라이드 2).
화학식 의 1,6-안하이드로 유도체(디사카라이드 3).
화학식 의 트리사카라이드 유도체.
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