JP4373917B2 - ヘパリンを形成している特異基の測定方法 - Google Patents

ヘパリンを形成している特異基の測定方法 Download PDF

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Description

本発明の主題は、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンを構成している特異基の分析方法である。
純粋なヘパリンからエノキサパリン（enoxaparin）（ロベノックス（R)（Lovenox(R)））（ＵＳ５,３８９,６１８）を製造する工程中に、水相でのアルカリ性解重合化工程は、オリゴ糖鎖の還元末端のグルコサミンの、部分的ではあるが特徴的な、変換をもたらす。
この変換反応の最初の段階は、グルコサミン←→マンノサミンのエピマー化から成っており（T. Toida等、J. Carbohydrate Chemistry, 15巻(3号), 351-360頁 (1996年)）；二番目の段階は、グルコサミンの６−Ｏ−脱硫酸化であって、「１,６−アンヒドロ」（国際特許出願ＷＯ０１／２９０５５）と呼ばれる誘導体の生成をもたらす。
Figure 0004373917
このタイプの誘導体は、末端グルコサミンが６−Ｏ−硫酸化されているオリゴ糖鎖からのみ得られる。
末端が１,６−アンヒドロ結合で改変されているオリゴ糖鎖の比率（％）は、ロベノックスのオリゴ糖混合物の構造上の特徴であり、それを測定することが可能でなければならない。
それゆえ、本発明は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、および、より特定すればロベノックスを分析する方法から成っている。
本発明の分析方法は以下の様である：
測定すべきサンプルをヘパリナーゼにより解重合化し、次に、必要な場合には、得られた解重合体を還元し、次に高速液体クロマトグラフィーによる分析を行う。
それゆえに、上記の方法は、末端が１,６−アンヒドロ結合（「１,６−アンヒドロ基」）で改変されているオリゴ糖鎖の存在を調べることを特徴としている。
とりわけ測定されるべきサンプルは、最初にヘパリナーゼの混合物、特にヘパリナーゼ１（ＥＣ４.２.２.７.）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼII）およびヘパリナーゼ３（ＥＣ４.２.２.８.）（これらの酵素はGrampian Enzymesグループから市販されている）によって、完全に解重合化される。国際出願ＷＯ８８／０２４００は、ヘパリナーゼによるヘパリンの解重合化および血液サンプル中に含まれているヘパリンの抗凝固活性を中和する方法を記載している。
それゆえに、本発明の主題は、以下の工程：
１）ヘパリナーゼの作用によるサンプルの解重合化
２）必要な場合には、解重合化物の還元
３）高速液体クロマトグラフィーによるアッセイ
を実施することを特徴とする、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの分析方法である。
本発明の主題は、より特定すれば、ヘパリナーゼが、ヘパリナーゼ１（ＥＣ ４.２.２.７.）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼII）およびヘパリナーゼ３（ＥＣ.４.２.２.８.）の混合物の形態であることを特徴とする、上記の方法である。
こうして調製された解重合化物は、次に、好ましくは、酢酸ナトリウム中のＮａＢＨ4溶液中で処理される。後者の操作は、１,６−アンヒドロ型には存在しない還元末端を、特異的に還元することを可能にする（特許出願ＷＯ０１／７２７６２に記載された生成物）。最後に、下記の二糖類１および２を定量するために、ヘパリナーゼで解重合化した低分子量ヘパリンのサンプルを、ＮａＢＨ4のような還元剤の作用によって還元しなければならない。
それゆえに、本発明の主題は、より特定すれば、解重合化したヘパリンを次に還元することを特徴とする、上記の方法である。
本発明の主題を、最も特定すれば、還元剤がＮａＢＨ4であることを特徴とする、上記の方法である。他の、リチウムまたはカリウムのようなアルカリ金属のホウ化水素塩も場合によっては使用できる。
次に、１,６−アンヒドロ末端のアッセイを、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、特に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて実施する。
本発明によるアッセイ方法により、ロベノックスと、他のそうした「１,６−アンヒドロ」誘導体を含まない低分子量ヘパリンとを明瞭に識別できる。反対に、本発明によるアッセイ方法により、低分子量ヘパリンがロベノックスの物理化学的な性質を満たさずそれ故に性質を異にすることの確認を可能とするものである。
本発明によるアッセイ方法は、ロベノックスを製造する工程の標準化を提供するため、および、均一なバッチを得るために、サンプルの工程管理の間の工業的工程に適用するこ
とができる。
酵素的解重合化および還元末端の還元の後、ロベノックスの１,６−アンヒドロ誘導体は４個の基本的な形態で存在する。それゆえに、本発明の主題は、また、解重合化反応で得られた１,６−アンヒドロ基が下記のものであることを特徴とする、上記の方法である：
Figure 0004373917
１,６−アンヒドロ末端を末端の二糖単位に含み、かつ、該末端二糖のウロン酸は２−Ｏ−硫酸基を持たない、全てのオリゴ糖類または多糖類は、完全にヘパリナーゼにより解重合化され、二糖１および二糖２の形態となる。他方、この末端糖がウロン酸上に２−Ｏ−硫酸基を含み、かつ、マンノサミン型であるとき、１,６−アンヒドロ誘導体は四糖１（ヘパリナーゼに耐性の形態）の形態をとる。
三糖１（下記参照）もまた混合物の中に存在する。それは、下記（ロベノックスの化学的解重合化の間に観察される剥離現象）の構造をもたらす、他の分解工程に由来する。
Figure 0004373917
混合物の他の構成成分は、ロベノックスのみに特徴的なものではない。もちろん、ヘパリン鎖の８個の基本的な二糖類が存在している。これら８個の基本的な二糖類は、特にシグマ社から市販されている。
本発明による方法を用いて、他の二糖類が混合物中で同定された：２個のガラクツロン酸の生成をもたらす、−ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）−、および、−ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ−のアルカリ性２−Ｏ−脱硫酸化に起源を持つ、二糖類、ΔIIＳgalおよびΔIVＳgalである。それらは通常ヘパリンの当初の構造の中には存在しない（U. M. Desai 等、 Arch. Biochem. Biophys., 306巻 (2号) 461-468頁 (1993年)）。
Figure 0004373917
３−Ｏ−硫酸化グルコサミンを含有するオリゴ糖類はヘパリナーゼによる分解に耐えて、四糖類の形態のまま存在している。
ほとんどの低分子量ヘパリンの場合、ヘパリンはブタ粘膜から抽出され、それらの基本的な四糖類を以下に示した。それらは、酵素による解重合化反応に抵抗性であり、アンチトロンビンIIIに対する親和性を有する配列を反映している。それらは次のようにシンボル化されている：ΔIIａ−IIｓ glu およびΔIIａ−IVｓ glu 。（S. YAMADA, K. YOSHIDA, M. SUGIURA, K-H KHOO, H. R. MORRIS, A. DELL, J. Biol. Chem.; 270巻(7号), 4780-4787頁 (1993年)）。
Figure 0004373917
ヘパリナーゼにより分解された混合物の最後の構成成分は、グリコセリンおよびΔＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒである（K. SUGAHARA, H. TSUDA, K. YOSHIDA, S. YAMADA, J. Biol. Chem. ; 270巻 (39号), 22914-22923頁 (1995年)； K.SUGAHARA, S. YAMADA, K. YOSHIDA, P. de WAARD, J. F. G. VLIEGENTHART ; J. Biol. Chem. ; 267巻 (3号), 1528-1533頁 (1992年)）。後者は通常ロベノックスにはほとんど存在しない（実施例５のＮＭＲを参照）。
Figure 0004373917
本発明の他の局面は、１,６−アンヒドロ基を測定するために用いるクロマトグラフィー工程よりなる。とり分け、解重合化反応およびＮａＢＨ4のような還元剤の処理の後、得られた種々の多糖類の分離に関する。
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）は、そうした複雑な混合物に最も適した分離方法である。
粒子径が５μmで長さが２５cmであるスフェリソルブ（Spherisorb）ＳＡＸ型の固定相を充填したカラムを用いることができる。直径１mm〜４.６mmの間の常用のカラムを用いることができる。
使用する装置は、ＵＶ検出器を備え、溶出勾配を形成できるクロマトグラフィーであり、より特定すれば、構成成分のＵＶスペクトルを生成し、２個の異なった波長での吸光度の差異から生じる複雑なシグナルを記録し、特異的なアセチル化オリゴ糖類の検出ができるための、配列したダイオードを備えたものである。このタイプの検出を可能にするために、２００nmまでのＵＶ領域が透明である移動相が好ましい。これについて、常用のＮａＣｌを基にした移動相は、塩素の腐食能に耐えるための保護化クロマトグラム（passivated chromatogram）を必要とするという欠点を有するために、除外する。ここで用いた移動層は、好ましくは過塩素酸ナトリウムを基にしているが、メタンスルホネートまたはリン酸塩もまた使用できる。
分離のために推奨されるｐＨは２〜６.５である。好ましくは、３の範囲であるｐＨが使用されるだろう。ここでは、ｐＨ＝３で過塩素酸塩より良好なの緩衝能を有するリン酸のような塩を加えることによって、制御される。
例として、標準的なクロマトグラフィー分離の条件を以下に記す：
溶媒Ａ：Ｎａ2ＰＯ4、２.５mM、Ｈ3ＰＯ4を加えて、ｐＨ２.９とした。
溶媒Ｂ：ＮａＣｌＯ4、１Ｎ−ＮａＨ2ＰＯ4、２.５mM、Ｈ3ＰＯ4を加えて、ｐＨ３.０とした。
溶出勾配は以下のようにできる：
Ｔ＝０分： ％Ｂ＝３； Ｔ＝４０分： ％Ｂ＝６０； Ｔ＝６０分： ％Ｂ＝８０
それゆえに、本発明の主題は、また、２００nMまでのＵＶ領域が透明である移動相を用いることを特徴とする、陰イオンクロマトグラフィーの分離による、上記の分析方法である。
本発明の主題は、より特定すれば、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホネート塩またはリン酸塩をベースにした、上記の移動相である。
他の最も重要な局面は、検出方法からなる。
ＵＶ検出の特異性を高めるための方法を開発した。非アセチル化多糖類は、全て、与えられたｐＨで、かなり似通ったＵＶスペクトルを有するので、非アセチル化糖類の吸光率が相殺されるように選ばれた二つの波長の吸光度間の差異をシグナルとして得ることにより、アセチル化糖を選択的に検出することが可能になる。
下記の場合、２０２nmおよび２３０nmが検出および参照波長として選ばれ、そして２０２〜２３０nmのシグナルが記録される。この選択は、当然、移動相のｐＨに依存している（該条件の至適化のために若干のnmの調整が必要になるかもしれない）。この技術で最も適した検出器はアジレント・テクノロジー社（Agilent Technologies）のＤＡＤ１１００検出器である。この場合、一方では２３４nmで、他方では２０２〜２３０nmで二重の検出が行なわれる。アセチル化されたオリゴ糖類の選択的検出の原理は図１で例示され、硫酸化二糖デルタ１ｓのＵＶスペクトルがアセチル化二糖デルタ１ａのＵＶスペクトルと比較されている。
それゆえに、本発明の主題は、検出方法がアセチル化糖を選択的に検出できるようにされていることを特徴とする、陰イオンクロマトグラフィーで分離される、上で定義された分析方法である。
また、本発明の主題は、最も特定すれば、非アセチル化糖類の吸光率が相殺されるように選ばれた二つの波長の吸光度間の差異をシグナルとして得ることにより、アセチル化糖の選択的検出が実施されることを特徴とする、交換クロマトグラフィーで分離される、上で定義されたような方法である。
上記の４個の１,６−アンヒドロ残基の定量化は、全ての混合物の構成成分に関して、クロマトグラフィーシステムでの十分な選択性を必要とする。しかしながら、２個の二糖類１および２は、通常一緒に溶出し、特に後者は、その２個のαおよびβアノマーの型で
存在するために、ΔIIａに関して不十分にしか解析できない。
２個の二糖類１および２の同一性は、これらが、ＮａＯＨの添加によりｐＨ１３にされたΔIIｓの水溶液中で、室温で、数時間以内に形成されるために、容易に確認できる。しかし、もし二重検出法を用いれば、アセチル化オリゴ糖類、ΔIVａ、ΔIIａ、VIIIａ、ΔＩａ、VIIａ−IVｓ glu およびΔIIａ−IIｓ gluは容易に同定できる。
ピークの分裂の原因は、一方ではアノマー型であり、および、より少ない程度でグルコサミン←→マンノサミンのエピマー化であり、これはオリゴ糖鎖の末端位置にある場合にΔIIｓ、ΔIIIｓおよびΔＩｓに関して部分的に存在する。
二糖類１および２を定量化するために、ヘパリナーゼで解重合化された低分子量ヘパリンのサンプルをＮａＢＨ4の作用で還元する。
Figure 0004373917
この還元反応は、末端オリゴ糖環を開裂させることで、α←→βアノマー化を除去する利点がある。得られたクロマトグラムは、アノマー化が除去され、特にΔIIａの還元によりカラムへの保持が減少し、二糖類１および２が容易に測定できるために、より簡便である。
図２および図３に記載されたクロマトグラムの例は、これらの現象および該方法の利点を明確に説明している。
最後に、本発明の主題は、また、解重合化および還元工程を用いて得られた、二糖１、二糖２、二糖３および三糖１から選ばれた新規な糖誘導体である。
下記の実施例は、本発明を限定することなしに、説明するものである。
実施例１：
酵素的解重合化反応を、アッセイする低分子量ヘパリン２０mg／mLを含有する溶液５０μL、２mM酢酸カルシウムおよびＢＳＡを１mg／mLを含有するｐＨ７.０の１００mM酢酸／ＮａＯＨ溶液２００μlと、３個のヘパリナーゼの保存溶液５０μＬとを混合することによって、室温で４８時間かけて行った。
還元反応は、ヘパリナーゼで解重合化した生成物６０μLに、使用直前に調製した３０ｇ／Ｌ濃度のＮａＢＨ4の１００mM酢酸ナトリウム溶液を１０μL加えることによって行った。ヘパリナーゼは−３０℃で保存されていたことに注目されたい。ヘパリナーゼは緩衝液中であり、力価は０.５IU／mLである（緩衝液の組成：０.０１モル／Ｌの濃度のＫＨ2ＰＯ4のｐＨ７の水溶液で、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が２mg／mLの濃度で添加されている）。
実施例２：
上記工程で得られた二糖３のＮＭＲ
Ｄ2Ｏ中でのプロトンスペクトル、400 MHz、T=298K、ppmでのδ：3.34 (1H, dd, J=7 および 2 Hz, H2)、3.72 (1H, t, J=8 Hz, H6)、3.90 (1H, m, H3)、4.03 (1H, s, H4)、
4.20 (1H, d, J=8 Hz, H6)、4.23 (1H, t, J=5 Hz, H3')、4.58 (1H, m, H2')、4.78 (1H, m, H5)、5.50 (1H, s, H1)、5.60 (1H, dd, J=6 および 1 Hz, H1')、6.03 (1H, d, J=5 Hz, H4')]。
実施例３：
上記工程で得られた四糖１のＮＭＲ
Ｄ2Ｏ中でのプロトンスペクトル、400 MHz、T=298K、ppmでのδ：3.15 (1H, s, H2)、3.25 (1H, m, H2'')、3.60 (1H, m, H3'')、3.70と4.70の間(14H、未分解の複合体、H3/H4/H6, H2'/H3'/H4'/H5', H4''/H5''/H6'', H2'''/H3''')、4.75 (1H, m, H5)、5.20と5.40の間 (2H, m, H1'およびH1'')、5.45 (1H, m, H1''')、5.56 (1H, m, H1)、5.94 (1H, d, J=5 Hz, H4)。
実施例４：
上記工程で得られた三糖１のＮＭＲ
Ｄ2Ｏ中でのスペクトル、600 MHz, (ppmでのδ)：3.28 (1H, m)、3.61 (1H, t, 7 Hz)、3.79 (1H, t, 7 Hz)、3.95 (1H, d, 6 Hz)、4.00 (1H, s)、4.20 (1H, m)、4.28 (2H, m)、4.32 (1H, d, 4 Hz)、4.41 (1H, s)、4.58 (1H, s)、4.61 (1H, s)、4.90 (1H, 平坦なs)、5.24 (1H, s)、5.45 (1H, s)、5.95 (1H, s)。
実施例５：
ΔＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−ＳｅｒのＮＭＲ
Ｄ2Ｏ中でのスペクトル、500 MHz (ppmでのδ)：3.30 (1H, t, 7 Hz)、3.34 (1H, t, 8
Hz)、3.55 (1H, t, 7 Hz)、3.60 (1H, t, 7 Hz)、3.63と3.85の間(10H, m)、3.91 (2H, m)、3.96 (1H, dd, 7および2 Hz)、4.02と4.10の間 (3H, m)、4.12 (1H, d, 2 Hz)、4.18
(1H, m)、4.40 (1H, d, 6 Hz)、4.46 (1H, d, 6 Hz)、4.61 (1H, d, 6 Hz)、5.29 (1H, d, 3 Hz)、5.85 (1H, d, 3 Hz)。
実施例６：定量化の原理
本発明の方法において、混合物中に含まれている不飽和オリゴ糖類は全て同じモル吸光度、５５００mol-1・Ｌ・cm-1、を有しているという広く受け入れられている仮定を行った。
それゆえに、出発の低分子量ヘパリンの中の解重合化混合物の全ての構成成分を、質量％で測定することが可能である。ピーク７、８、１３および１９に対応する４個の１,６−アンヒドロ誘導体に関して、以下の質量％値が得られる：
Figure 0004373917
Ａｒｅａ7、Ａｒｅａ8、Ａｒｅａ13、およびＡｒｅａ19はそれぞれピーク７、８、１３および１９の面積に対応する。それらの４個の化合物のモル質量は４４３、４４３、５４５および１２１０である。ΣＭｗx・Ａｒｅａxは、対応する生成物のモル質量でクロマトグラムのそれぞれのピークの面積を除した値に相当する。
もし、Ｍwが、試験している低分子量ヘパリンのモル質量であれば、１,６−アンヒドロ環を有する末端のオリゴ糖鎖の割合（％）は以下のように求められる：
該構成成分の分子量は以下のようである：
Figure 0004373917
糖類の命名法および図２および図３によるピークとの対応
ＩｄｏＡ：α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸；
ＧｌｃＡ：β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸；
ΔＧｌｃＡ：４,５−不飽和酸：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸
Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース；
Ｘｙｌ：キシロース；
ＧｌｃＮＡｃ：２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノース；
ＧｌｃＮＳ：２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノース；
２Ｓ：２−Ｏ−硫酸、
３Ｓ：３−Ｏ−硫酸、
６Ｓ：６−Ｏ−硫酸、
１：ΔＧｌｃＡβ1-3Ｇａｌβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｘｙｌβ1−Ｏ−Ｓｅｒ
２：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノシル・ナトリウム塩
３：ΔＧｌｃＡβ1-3Ｇａｌβ1-3Ｇａｌβ1-4Ｘｙｌβ1−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ
４：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキサ−４−エンガラクトピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルコピラノース・二ナトリウム塩
５：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デ
オキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノシル・ナトリウム塩
６：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセタミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル・二ナトリウム塩
７：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸−（１→４）−１,６−アンヒドロ−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルコピラノース・二ナトリウム塩
（二糖１）
８：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸−（１→４）−１,６−アンヒドロ−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−マンノピラノース・二ナトリウム塩
（二糖２）
９：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノシル・二ナトリウム塩
１０：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキサ−４−エンガラクトピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルコピラノース・三ナトリウム塩
１１：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルコピラノシル・三ナトリウム塩
１２：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノシル・三ナトリウム塩
１３：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキサ−４−エンピラノシルウロン酸−（１→４）−１,６−アンヒドロ−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルコピラノース・三ナトリウム塩
（二糖３）
１４：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル・三ナトリウム塩
１５：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル・五ナトリウム塩
１６：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル・四ナトリウム塩
１７：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３,６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル・六ナトリウム塩
１８：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸・六ナトリウム塩
１９：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸−（１→４）−１
,６−アンヒドロ−２−デオキシスルファミド−β−Ｄ−マンノピラノース・六ナトリウム塩
（四糖１）
２０：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルシトール・ナトリウム塩
２１：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−β−Ｄ−グルシトール・二ナトリウム塩
２２：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルシトール・二ナトリウム塩
２３：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール・二ナトリウム塩
２４：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルシトール・二ナトリウム塩
２５：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンガラクトピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−β−Ｄ−グルシトール・三ナトリウム塩
２６：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール・三ナトリウム塩
２７：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルシトール・三ナトリウム塩
２８：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール・三ナトリウム塩
２９：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール・五ナトリウム塩
３０：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール・三ナトリウム塩
３１：４−デオキシ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３,６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルシトール・六ナトリウム塩
３２：４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオヘキセンピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸・六ナトリウム塩（ＮａＢＨ4で還元した形態）。
アセチル化されたオリゴ糖類の選択的検出を例示する。 ＮａＢＨ4での還元反応の前後のヘパリナーゼで解重合化したエノキサパリンのクロマトグラフィーによる分離（淡暗色のシグナル：２３４nmでのＵＶ；濃暗色のシグナル：２０２〜２３４nmでのＵＶ）を示す。 ＮａＢＨ4での還元反応の前後のヘパリナーゼで解重合化したヘパリンのクロマトグラフィーによる分離（淡暗色のシグナル：２３４nmでのＵＶ；濃暗色のシグナル：２０２〜２３４nmでのＵＶ）を示す。

Claims (6)

  1. 以下の工程：
    １）ヘパリナーゼの作用によるサンプルの解重合化、
    ２）解重合化物の還元、
    ３）高速液体クロマトグラフィーによる測定であって、使用したクロマトグラフィー方法が陰イオン交換クロマトグラフィーであり、２００ｎｍまでのＵＶ領域において透明である移動相を使用し、アセチル化された糖を選択的に検出できる二重の検出方法を用い、該方法が非アセチル化糖類の吸光率が相殺されるように選ばれた二つの波長の吸光度間の差異をシグナルとして得ることにより実施される該測定、
    を実施することを特徴とする、末端が１,６−アンヒドロ結合により改変されているオリゴ糖鎖の存在に関してサーチを実施する、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの分析方法であって、解重合化反応の間に得られた１,６−アンヒドロ残基が以下：
    Figure 0004373917
     で表されることを特徴とする、分析方法。
  2. ヘパリナーゼが、ヘパリナーゼ１（ＥＣ４.２.２.７.）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼII）およびヘパリナーゼ３（ＥＣ.４.２.２.８.）の混合物の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. ヘパリナーゼの作用により解重合化したヘパリン（解重合化物）を次に還元剤に付することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 還元剤が、ＮａＢＨ4またはホウ化水素アニオンのアルカリ金属塩であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 使用した移動相が、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホン酸塩またはリン酸塩をベースにしていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 式：
    Figure 0004373917
    で表される、三糖誘導体。
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