BRPI0314654B1 - método de análise de heparinas ou de heparinas de baixo peso molecular, para buscar a presença de cadeias de oligossacarídeos cuja terminação é modificada por uma ligação 1,6-anidro, e derivados das mesmas - Google Patents
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Abstract
"método de determinação de grupamentos específicos que constituem as heparinas ou as heparinas de baixo peso molecular". a presente invenção refere-se a um método de análise das heparinas ou heparinas de baixo peso molecular, caracterizado pelo fato de a amostra a dosar ser despolimerizada por ação de heparinases, depois, se for o caso, o despolimerizado obtido ser reduzido, depois se fazer uma análise por cromatografia líquida de desempenho.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE ANÁLISE DE HEPARINAS OU DE HEPARINAS DE BAIXO PESO MOLECULAR, PARA BUSCAR A PRESENÇA DE CADEIAS DE OLIGOSSACA-RÍDEOS CUJA TERMINAÇÃO É MODIFICADA POR UMA LIGAÇÃO 1,6-ANIDRO, E DERIVADOS DAS MESMAS". A presente invenção refere-se a um método de análise de grupamentos específicos que constituem as heparinas ou as heparinas de baixo peso molecular.
Quando do processo de preparo da Enoxaparina (Lovenox ®) (US 5.389.618), a partir da heparina pura, a etapa de processo de despoli-merização alcalina em fase aquosa produz uma transformação parcial mais característica das glicosaminas das terminações redutoras das cadeias oli-gossacarídicas. A primeira etapa dessa transformação consiste em uma epimeri-zação glicosamina <-> manosamina (T. Toida and ai., J. Carbohydrate Che-mistry, 15(3), 351-360 (1996)); a segunda etapa é uma 6-0 dessulfatação da glicosamina que conduz à formação de derivados chamados «1,6 anidro» (pedido de patente internacional WQ01/29055).
Esse tipo de derivado é obtido apenas para as cadeias oligossa-carídicas cuja glicosamina terminal é 6-0 sulfatada. A percentagem de cadeias oligossacarídicas cuja terminação é modificada por uma ligação 1,6-anidro é uma característica estrutural da mistura de oligossacarídeo do Lovenox e deve poder ser medida. A presente invenção consiste, portanto, em um método de análise das heparinas, heparinas de baixo peso molecular e mais particularmente do Lovenox. O método de análise, de acordo com a invenção, é o seguinte: a amostra a dosar é despolimerizada por ação de heparinases, depois, se for o caso, o despolimerizado obtido é reduzido, depois se faz uma análise por cromatografia líquida Alto Desèmpenho. O método tal como definido mais acima é, portanto, caracterizado pelo fato de se buscar a presença de cadeias oligossacarídeas cuja terminação é modificada por uma ligação 1,6-anidro ("grupamentos 1,6 anidro").
Em particular, a amostra a dosar é inicialmente despolimerizada de forma exaustiva por uma mistura de heparinases e notadamente de hepa-rinase 1 (EC 4.2.2.7), de heparinase 2 (heparin liase II) e de heparínase 3 (EC4.2.2.8). Essas enzimas são comercializadas pela sociedade Grampian Enzymes). A invenção tem, portanto, por objeto um método de análise das heparinas ou heparinas de baixo peso molecular, caracterizado pelo fato de se passar pelas seguintes etapas: 1. despolimerização da amostra por ação de heparinases; 2. se for o caso, redução do despolimerizado; 3. dosagem por cromatografia líquida de Alto Desempenho. A invenção tem mais particularmente por objeto o método, tal como definido mais acima, caracterizada pelo fato de as heparinas estarem sob a forma de uma mistura de heparinase 1 (EC 4.2.2.7), de heparinase 2 (heparin liase II) e de heparinase 3 (EC.4.2.2.8.). 0 despolimerizado assim preparado é em seguida tratado, de preferência, por uma solução de NaBH4 no acetato de sódio. Esta última operação permite reduzir especificamente as extremidades redutoras que não estão sob a formam 1,6 anidro (produto descrito no pedido de patente WO 01/72762). Enfim, para poder quantificar os dissacarídeos 1 e 2 descritos mais abaixo, a amostra de heparina de baixo peso molecular, despolime-rizada pelas heparinases, deve ser reduzida pela ação de um agente redu-tor, tal como NaBH4. A invenção tem, portanto, mais particularmente por objeto o método tal como definido mais acima, caracterizado pelo fato de a heparina despolimerizada ser em seguida reduzida. A invenção tem particularmente por objeto o método tal como definido anteriormente caracterizado pelo fato de o agente de redução ser o NaBH4. Poder-se-á eventualmente utilizar um outro sal de metal alcalino do boro-hidreto, tal como o lítio ou o potássio. A dosagem das terminações 1,6 anidro é em seguida feita por CLED (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho) e, em particular, por cromatografia trocadora de ânions. O método de dosagem, de acordo com a invenção, permite diferenciar bem o Lovenox das outras heparinas de baixo peso molecular que não contêm esses derivados «1,6-anidro». Inversamente, o método de dosagem, de acordo com a invenção, permite se ter certeza de que as heparinas de baixo peso molecular não preenchem as características físico-químicas do Lovenox e, portanto, são de natureza diferente. O método de dosagem, de acordo com a invenção, pode ser aplicado ao processo industrial quando dos controles de amostras durante o processo, a fim de assegurar uma padronização do processo de fabricação do Lovenox e de obter lotes uniformes.
Após despolimerização enzimática e redução das extremidade redutoras, encontram-se os derivados 1,6-anidro do Lovenox sob 4 formas essenciais. A invenção tem, portanto, também por objeto o método tal como descrito anteriormente caracterizado pelo fato de os resíduos 1,6-anidro obtidos, quando da reação de despolimerização, serem os seguintes Todos os oligossacarídeos ou polissacarídeos que comportam a extremidade 1,6-anidro sobre, a unidade dissacarídica terminal e que não possuem um 2-0 sulfato sobre o ácido urônico, desse dissacarídeo terminal, são totalmente despolimerizados pelas heparinases e sob a forma de dissa-carídeos 1 e 2. Ao contrário, quando esse sacarídeo terminal comporta um 2-0 sulfato sobre o ácido urônico e está sob a forma manosamina, o derivado 1,6 anidro se acha sob a forma do tetrassacarídeo 1 (forma resistência às heparinases). O trissacarídeo 1 (ver mais abaixo) está também presente na mistura. Ele é proveniente de um outroprocesso de degradação que leva à estrutura apresentada a seguir (fenômeno de peeling observado quando da despolimerização química do Lovenox.
Os outros constituintes da mistura não são características unicamente do Lovenox. Encontram-se naturalmente os 8 dissacarídeos elementares da cadeia heparínica. Esses 8 dissacarídeos elementares são comercializados entre outros pela sociedade Sigma.
Outros dissacarídeos foram identificados na mistura pelo méto- do, de acordo com a invenção: os dissacarídeos AllSgai e AIVS2gai que têm por origem a 2-0 dessulfatação alcalina de -ldoA(2S)-G1cNS(6S)- e de -ldoA(2S) -G1cNS- levando à formação de 2 ácidos galacturônicos. Não estão habitualmente presentes na estrutura original da heparina (U.M. Desai et Coll. Arch. Biochem. Biophys., 306 (2) 461-468 (1993).
Os oligossacarídeos que comportam glicosaminas 3-0 sulfatados resistem à divagem pelas heparinases e continuam presentes sob a forma de tetrassacarídeos.
No caso da maior parte das heparinas de baixo peso molecular, a heparina é extraída do muco de porco, e esses tetrassacarídeos principais estão representados mais embaixo. São resistentes à despolimerização en-zimática e são o reflexo das seqüências afins da antitrombina III. São simbolizados assim: Alia-llsgiu e Alia-IVSgiu. (S.YAMADA, K. YOSHIDA, M. SU-GIURA, K.SUGAHARA, K-H LHOO, H.R. MORRIS, A. DELL, J.Biol.Chem.; 270(7), 4780-4787(1993) |( Ο último constituinte da mistura clivada pelas heparinases é a terminação glicoserina ΔΘ1 cA-Gal-Gal-Xyl-Ser (K. SUGAHARA, H.TSUDA, K.YOSHIDA, S.YAMADA, J.Biol.Chem.; 270 (39), 22914-22923 (1995); K.SUGAHARA, S.YAMADA, K.YOSHIDA, P. de WAARD, J.F.G. VLIEGEN-THART; J.Biol. Chem.; 267(3), 1528-1533 (1992). Este está geralmente compreendido quase ausente do Lovenox (Ver RMN no exemplo 5).
Um outro aspecto da invenção se situa no nível do processo de cromatografia utilizado para a determinação dos grupamentos 1,6-anidro. Inicialmente, trata-se de separar os diferentes polissacarídeos obtidos após despolimerização e tratamento por um agente redutor, tal como o NaBFU. A cromatografia de troca de ânions (SAX) é o método separativo o mais adaptado a essa mistura complexa.
As colunas cheias de uma fase estacionária do tipo Spherisorb SAX de granulometria 5 pm e de um comprimento de 25 cm podem ser utilizadas. Todos os diâmetros de coluna clássicos, compreendidos entre 1 mm e 4,6 mm são utilizáveis. A aparelhagem utilizada pode ser um cromatógrafo, que permite a formação de gradiente de purificação com um detector UV, mais preferencialmente munido de uma barra de diodos, a fim de poder realizar espectros UV dos constituintes e registrar sinais complexos, resultantes da diferença entre as absorbâncias com 2 comprimentos de ondas diferentes e permitindo a detecção específica dos oligossacarídeos acetilados. Para permitir esse tipo de detecção, fases móveis transparentes no UV até 200 nm são preferíveis. Isto exclui as fases móveis clássicas à base de NaCI que têm, por outro lado, o inconveniente de necessitar de um cromatograma passivado, a fim de resistir ao poder corrosivo dos cloretos. A fase móvel utilizada, no caso, será, de preferência, à base de perclorato de sódio, mas os sais de metano sulfonato ou fosfato podem também ser utilizados. O pH preconizado para a separação é de 2 a 6,5. Preferencialmente, utilizar-se-á um pH próximo de 3. Ele é controlado no caso por adição de um sal, tal como o fosfato que possui um poder tampão com pH = 3 melhor do que aquele dos percloratos. A título de exemplo, são dadas a seguir as condições padrão de separação cromatográfica;
Solvente A: NaH2P04, 2,5 mM levado a pH 2,9 por adição de H3PO4.
Solvente B: NaCI04, 1N- NaH2P04 2,5 mM levado a pH 3,0 por adição de H2P04. O gradiente de purificação pode ser o seguinte: T = 0 min: % B = 3; T = 40 min: % B = 60; T = 60 min: % B = 80 A presente invenção tem, portanto, também por objeto um método de análise, tal como definido mais acima por separação por cromatografia por troca de ânions, caracterizado pelo fato de se utilizar a fase móvel transparente no UV até 200 nM. A invenção tem mais particularmente por objeto uma fase móvel tal como definida mais acima à base de perclorato de sódio, de sais de metano sulfonato ou de sais de fosfato.
Um outro aspecto inteiramente importante se acha no método de detecção.
Um método foi desenvolvido a fim de aumentar a especificidade da detecção UV. Como os polissacarídeos não acetilados têm todos, com um pH determinados, um espectro UV bastante próximo, é possível detectar seletivamente os açúcares acetilados, tomando-se como sinal a diferença entre a absorbância com 2 comprimentos de onda escolhidos de tal maneira que a absorção dos sacarídeos não acetilados se anula.
No caso abaixo, escolher-se-ão 202 nm e 230 nm como comprimentos de onda de detecção e de referência e anotar-se-á o sinal 202 -230 nm. A escolha naturalmente dependente do pH da fase móvel (ajustes de alguns nm podem ser necessários para estar no ótimo dessas condições). O detector o máis adaptado a essa técnica é o detector DAD 1100 da sociedade Agilent Technologies. Nesse caso, umá dupla detecção será feita em 234 nm, por um lado, e em 202-230 nm, por outro lado. O princípio de detecção seletiva dos oligossacarídeos acetilados é ilustrado na figura abaixo, na qual o espectro UV de um dissacarídeo sulfatado Delta 1s é comparado com aquele de um dissacarídeo acetilado Delta 1a A presente invenção tem, portanto, também por objeto um método de análise tal como definido mais acima por separação por cromatografia por troca de ânions, caracterizado pelo fato de que o método de detecção permite a detecção seletiva de açúcares acetilados. A presente invenção também tem por objeto um método de análise, como definido mais acima, por meio de uma separação por cromatografia de troca, caracterizado pelo fato de que a detecção seletiva dos açúcares acetilados ser feita tomando-se como sinal a diferença entre a absorbância com 2 comprimentos de onda escolhidos de tal maneira que a absorção dos sacarídeos não acetilados se anula. A quantificação dos 4 resíduos 1,6-ànidro descritos mais acima necessita de uma seletividade suficiente do sistema cromatográfico face a todos os outros constituintes da mistura. Ora, os 2 dissacarídeos 1 e 2, em geral co-purificados, são mal resolvidos em relação a Alia, sobretudo pelo fato de este último estar presente sob a forma de seus 2 anômeros α e β. A identidade dos 2 dissacarídeos 1 e 2 pode ser facilmente verificada, pois eles se formam em algumas horas à temperatura ambiente em uma solução aquosa de Alls levada ao pH 13 por adição de NaOH. Todavia, se a dupla detecção for utilizada, os oligossacarídeos acetilados Alva, Alia, Allla, Ala, Alla-IVSgiu e Alla-IISgiu são facilmente identificáveis.
As causas de desdobramento dos picos são as formas anôme-ras, por um lado, e em uma menor medida a epimerização glicosamina <-> manosamina presente parcialmente para AIIS, AIIIS e AIS, quando estão em posição terminal na cadeia oligossacarídica.
Para poder quantificar os dissacarídeos 1 e 2, a amostra de he-parina de baixo peso molecular, despolimerizada pelas heparinases, é reduzido pela ação NaBH4. anômero α + anômero β Essa redução tem por vantagem suprimir as anomerias α <-> β por abertura do ciclo oligossacarídico terminal. O cromatograma obtido é mais simples, já que as anomerias são suprimidas e sobretudo a redução de Alia diminui sua retenção sobre a coluna e permite uma dosagem fácil dos dissacarídeos 1 e 2.
Os exemplos de cromatogramas descritos nas figuras 1 e >2 a seguir ilustram bem esses fenômenos e as vantagens desse método.
Enfim, a invenção tem também por objeto os derivados sacarídi-cos novos obtidos pela aplicação do processo de despolimerização e de redução escolhidos dentre o dissacarídeo 1, o dissacarídeo 2, o dissacarídeo 3 e o trissacarídeo 1.
Os exemplos abaixo ilustram a invenção, sem, todavia, ter um caráter limitativo. EXEMPLO 1: A despolimerização enzimática é realizada durante 48 horas à temperatura ambiente, misturando 50 μΙ de uma solução a 20 mg/ml da he-parina de baixo peso molecular a dosar, 200 μΙ de uma solução 100 mM ácido acético/NaOH com pH 7.0, contendo 2 mM de acetato de cálcio e 1 mg/ml de BSA com 50 μΙ da solução mãe das 3 heparinases. A redução é feita sobre 60 μΙ do produto despolimerizado pelas heparinases, acrescentando-se 10 μΙ de uma solução de NaB H2 a 30 g/l no acetato dè sódio 100 mM preparada extemporaneamente. Anotar-se-á que as heparinases são conservadas a -30°C. As heparinases são em solução tampão e seu título é de 0,5 Ul/ml (Composição da solução tampão: solução aquosa pH 7 de KH2PO4 a uma concentração 0,01 mol/l e adicionada de soro de albumina bovina (BSA) a 2 mg/ml). EXEMPLO 2 RMN do dissacarídeo 3 obtido segundo o processo descrito mais acima Espectro próton em D2O, 400 MHz, T=298K, δ em ppm: 3,34 (1H, dd, J=7 e 2Hz, H2), 3,72 (1H, t, J=8Hz, H6), 3,90 (1H, m, H3), 4,03 (1H, s, H4), 4,20 (1H, d, J=8Hz, H6), 4,23 (1H, t, J=5Hz, H3’), 4,58 (1H, m, H2’), 4,78 (1H, m, Η5), 5,50 (1Η, s, H1), 5,60 (1H, dd, J=6 e 1Hz, H1’), 6,03 (1H, d, J=5Hz, H4')] EXEMPLO 3 RMN do tetrassacarídeo 1 obtido segundo o processo descrito mais acima Espectro próton em D20, 400 MHz, T = 298K, δ em ppm: 3,15 (1H, s, H2), 3,25 (1H, m, H2"), 3,60 (1H, m, H3"), entre 3,70 e 4,70 (14H, maciço, H3/H4/H6, H27H37H47H5\ H4,7H5,7H6,,, H2"7H3m), 4,75 (1H, m, H5), entre 5,20 e 5,40 (2H, m, H1’ e H"), 5,45 (1H, m, H1m), 5,56 (1H, m, H1), 5,94 (1H, d, J=5Hz, H4) EXEMPLO 4: RMN do trissacarídeo 1 obtido segundo o processo descrito mais acima.
Espectro em D20, 600 MHz (δ em ppm): 3,28 (1H, m), 3,61 (1H, t, 7Hz), 3,79 (1H, t, 7Hz), 3,95 (1H, d, 6Hz), 4,00 (1H, s), 4,20 (1H, m), 4,28 (2H, m), 4,32 (1H, d, 4Hz), 4,41 (1H, s), 4,58 (1H, s), 4,61 (1H, s), 4,90 (1H, s largo), 5,24 (1H, s), 5,45 (1H, s), 5,95 (1H, s). EXEMPLO 5: RMN do AG1cA-Gal-Gai-Xyl-Ser Espectro em D20, 500 MHz (δ em ppm): 3,30 (1H, t, 7Hz), 3,34 (1H, t, 8Hz), 3,55 (1H, t, 7Hz), 3,60 (1H, t, 7Hz), entre 3,63 e 3,85 (10H, m), 3,91 (2H, m), 3,96 (1H, dd, 7 e 2Hz), entre 4,02 e 4,10 (3H, m), 4,12 (1H, d, 2Hz), 4,18 (1H, m), 4,40 (1H, d, 6Hz), 4,46 (1H, d, 6Hz), 4,61 (1H, d, 6Hz), 5,29 (1H, d, 3Hz), 5,85 (1H, d, 3Hz). EXEMPLO 6: princípio da quantificação No método, de acordo com a invenção, é considerada como hipótese, amplamente admitida, que todos os oligossacarídeos insaturados contidos na mistura têm a mesma absorção molar, igual a 5500 mol-1.1.cm'1.
Portanto, é possível determinar a percentagem em peso de todos os constituintes da mistura despolimerizada na heparina de baixo peso molecular de partida. Para os 4 derivados 1,6 anidro que correspondem aos picos 7,8,13 e 19, são obtidas as seguintes percentagens em peso: Areaz, Areae, Areai3 e areaig correspondem às áreas de cada um dos picos 7, 8, 13 e 19. As massas molares de cada um desses 4 compostos são respectivamente 443, 443, 545 e 1210. £ Pmx. Área corresponde à relação da área de cada pico do cromatograma pela massa molar do produto correspondente.
Se Mw for a massa média da heparina de baixo peso molecular estudada, a percentagem de cadeias oligossacarídicas que termina por um ciclo 1,6 anidro será obtida da seguinte maneira: ____________As massas moleculares dos constituintes são as seguintes: Nomenclatura dos sacarídeos e correspondência com os picos, segundo as figuras 1 e 2 IdoA: ácido - a-L-ldopiranosilurônico;
GlcA: ácido -β-D-Glicopiranosilurônico; AG1cA: ácido. 4,5-insaturado: ácido 4-desóxi-a-L-treohex-4-enopiranosilurônico Gal: D-Galactose;
Xyl: xilose GlcNAc: 2-desóxi-2-acetamido-a-D-glicopiranose;
GlcNS: 2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glicopiranose; 2S: 2-0 sulfato; 3S: 3-0 sulfato; 6S: 6-0 sulfato 1: AGIcAp1-3 Galp1-3 Galp1-4 Xylp1-0-Ser 2: Sal de sódio ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1 -> 4)-2-desóxi-2-acetamido- a-D-glicopiranosila 3: AGIcA p1 -3 Gal B1-3 Gal p1-4 Xyl p1-0-CH2-C00H 4: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex-4- enogalactopiranosilurônico-(1-> 4)-2-desóxi-2-sulfamido-p-D-glicopiranose 5: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex- enopiranosilurônico-(1-> 4)-2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glicopiranosila 6: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex- enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopirano-sila 7: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex-4- enopiranosilurônico-(1->4)-1,6-anidro-2-desóxi-2-sulfamido-p-D- glicopiranose (dissacarídeo 1) 8: Sal de dissódio ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex-4- enopiranosilurônico-(1->4)-1,6-anidro-2-desóxi-2-sulfamido-p-D-manopiranose (dissacarídeo 2) 9: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1-> 4)-2-desóxi-2-acetamido- a-D-glicopiranosila 10: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi- a-L-treo-hex-4-enegalactopirano-silurônico-(1-> 4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-p-D-glicopiranose 11: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex- enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo- a-D- glicopiranosila 12: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido- a-D-glicopiranosila. 13: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-4-enopiranosilurônico-(1->4)-1,6-anidro-2-desóxi-2-sulfamido-p-D-glicopirano-se (Dissacrídeo 3). 14: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopira-nosil. 15: Sal de pentassódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopira-nosil-(1-> 4) -ácido p-D-glicopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-3-O-sulfo-a-D-glicopiranosila. 16: ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo- α-D-glicopiranosila sal de tetrassódio. 17: Sal de hexassódio ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopira-nosil-(1-> 4) -ácido p-D-glicopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-3,6-d i-O-sulfo-a-D-g licopi ranosila. 18: Sal de hexassódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil- (1 -> 4) -ácido 2-O-sulfo- α -L-idopirano-silurônico. 19: Sal de heptassódio ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicopirano-sila-(1-> 4) -ácido-2-O-sulfo a-L-idopirano-silurônico-1(1->4)-1,6-anidro-2-desóxi-2-sulfamido- β-D-manopiranose, (tetrassacarídeo 1). 20: Sãl de sódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex- enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-a-D-glucitol. 21: ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enegalactopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-p-D-glucitol sal de dissódio. 22: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex- enopiranosilurôniço-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glucitol. 23: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex- enopiranosilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo- a-D-glucitol. 24: Sal de dissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-enopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-a-D-glucitol. 25: Sal de triissódio ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex- enegalactopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-p-D-glucitol. 26: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-enopirano-silurônico-(1 ->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo- a-D-glucitol. 27: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-enopiranó-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-a-D-glucitol. 28: Sal de trissódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo-a-L-treo-hex-enopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glucitol 29: Sal de pentassódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-enopiranossilurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil-(1->4)-ácido p-D-glicopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-3-O-sulfo- a-D-glucitol). 30: Sal de tetrassódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo- a-D-glucitol 31: Sal de hexassódio do ácido 4-desóxi-a-L-treo-hex-enopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil-(1->4)- ácido p-D-glicopiranossilurônico-( 1 ->4)-2-desóxi-2-sulfamido-3,6-di-0-sulfo-a-D-glucitol). 32: Sal de hexassódio do ácido 4-desóxi-2-0-sulfo- a-L-treo-hex-enopirano-silurônico-(1->4)-2-desóxi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glicopiranosil-(1->4)-ácido-2-0-sulfo a-L—idoopirano-silurônico (forma reduzida por NaBH4).
Figura 1 Separação cromatográfica da Enoxaparina despolimerizada pelas heparinases antes e depois da redução por NaBH4 (Sinal em negro fino: ÜV a 234 nm; sinal em negro espesso UV: 202 - 234 nm).
Figura 2: separação cromatográfica da heparina despolimerizada pelas heparinases antes e depois da redução por NaBH4 (Sinal em negro fino: UV a 234 nm; sinal em negro espesso: UV: 202 - 234 nm).
Claims (9)
1, Método de análise de he pari nas ou de he parirías de baixo peso molecular, para buscar a presença de cadeias de oligossacarídeos cuja terminação é modificada por uma ligação 1,6-anidro, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas são realizadas: (i) despolimerização da amostra por ação de heparinases; (ii) redução do despolimerizado por um agente redutor escolhido a partir de NaBH4, LiBH4, ou KBH4; (iii) ensaio por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), o método cromatográfico usado sendo uma cromatografia de troca iônica para a determinação dos grupos 1,6-anidro, na qual - uma fase móvel que é transparente em UV é usada ate 200 nm, e - uma detecção dupla a 234 nm, por um lado, e a 202-230 nm, por outro lado, que torna possível detectar seletivamente açúcares acetilados é empregada, o referido método sendo realizado através da tomada, como sinal, para detecção seletiva de açúcares acetilados, a diferença entre a absor-bância nestes dois comprimentos de onda (202 e 230 nm) escolhida de tal forma que a absorbância dos sacarídeos não acetilados é reduzida a zero, e em que os resíduos 1,6-anidro obtidos durante a reação de despolimerização são os seguintes:
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as heparinases estarem sob a forma de uma mistura de heparinase 1 (EC 4.2.2.7), de heparinase 2 (heparin liase II) e de heparinase 3 (EC.4.2.2.8.).
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a heparina despolimerizada por ação de heparinase (despolimeriza-do) ser em seguida submetida a um agente de redução.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fase móvel utilizada é à base de perclora-to de sódio, sais de metanossulfonato ou sais de fosfato.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os dois comprimentos de onda para detecção dos açúcares acetilados são 202 e 230 nm.
6. Derivado 1,6 anidro, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (dissacarídeo 1)
7. Derivado 1,6 anidro, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (dissacarídeo 2)
8. Derivado 1,6 anidro, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (dissacarídeo 3).
9. Derivado trissacarídeo, caracterizado pelo fato de que apre- senta a fórmula:
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