RU2359037C2 - Способ определения специфических групп, образующих гепарины - Google Patents

Способ определения специфических групп, образующих гепарины Download PDF

Info

Publication number
RU2359037C2
RU2359037C2 RU2005112240/13A RU2005112240A RU2359037C2 RU 2359037 C2 RU2359037 C2 RU 2359037C2 RU 2005112240/13 A RU2005112240/13 A RU 2005112240/13A RU 2005112240 A RU2005112240 A RU 2005112240A RU 2359037 C2 RU2359037 C2 RU 2359037C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
deoxy
heparins
acid
sulfo
anhydro
Prior art date
Application number
RU2005112240/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2005112240A (ru
Inventor
Пьер МУРЬЕ (FR)
Пьер Мурье
Кристиан ВИСКОВ (FR)
Кристиан ВИСКОВ
Original Assignee
Авентис Фарма С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0211724A external-priority patent/FR2844808B1/fr
Application filed by Авентис Фарма С.А. filed Critical Авентис Фарма С.А.
Publication of RU2005112240A publication Critical patent/RU2005112240A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2359037C2 publication Critical patent/RU2359037C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу анализа гепаринов или низкомолекулярных гепаринов, и может быть использовано при контроле образцов, для обеспечения стандартизации способа Lovenox и получения однородной продукции. Способ количественного определения гепаринов или низкомолекулярных гепаринов осуществляют через следующие стадии: образец деполимезируют гепариназами, затем полученный деполимеризат восстанавливают, после чего проводят анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Данное изобретение позволяет четко отличать Lovenox от других низкомолекулярных гепаринов, не содержащих производных "1,6-ангидро ". 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к способу анализа специфических групп, образующих гепарины или низкомолекулярные гепарины.
При осуществлении способа получения Еноксапарина (Lovenox®) (US389618) из чистого гепарина, на стадии способа щелочной деполимеризации в водной фазе происходит частичное, но характерное преобразование глюкозаминов восстанавливающих концов олигосахаридных цепочек.
Первая стадия такой деполимеризации заключается в эпимеризации глюкозамин ↔ маннозамин (T.Toida and al, J.Carbohydrate Chemistry, 15(3), 351-360 (1996)), вторая стадия заключается в 6-0 десульфатировании глюкозамина с образованием производных, называемых “1,6-ангидро” (международная заявка на патент WO01/29055).
Figure 00000001
Производное такого типа получают только для олигосахаридных цепочек, конечный глюкозамин которых является 6-0 сульфатированным.
Процентное содержание олигосахаридных цепочек, конец которых изменен связью 1,6-ангидро, является структурной характеристикой смеси олигосахарида Lovenox, и необходимо иметь возможность его измерения.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу анализа гепаринов, низкомолекулярных гепаринов и более конкретно Lovenox.
Способ анализа согласно изобретению заключается в следующем.
Образец, количественное определение которого осуществляют, деполимеризуют под действием гепариназ, затем в случае необходимости, полученный деполимеризат восстанавливают, после чего проводят анализ путем высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Описанный выше способ, следовательно, отличается тем, что выявляют присутствие олигосахаридных цепочек, конец которых изменен связью 1,6-ангидро (“группы 1,6-ангидро”).
Более конкретно, образец, количественное определение которого осуществляют, сначала подвергают исчерпывающей деполимеризации смесью гепариназ и, в частности, гепариназы 1 (ЕС 4.2.2.7.), гепариназы 2 (гепарин лиаз II) и гепариназы 3 (ЕС 4.2.2.8.). (Эти ферменты выпускает фирма Grampian Enzymes). В международной заявке WO88/02400 описан способ деполимеризации гепарина с помощью гепариназы и нейтрализации антикоагулянтной активности гепарина, содержащегося в образце крови.
Таким образом, объектом изобретения является способ анализа гепаринов или низкомолекулярных гепаринов, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
1) деполимеризация образца под действием гепариназ;
2) в случае необходимости, восстановление деполимеризата;
3) количественное определение посредством ВЭЖХ.
Более конкретно объектом изобретения является способ, описанный выше, отличающийся тем, что гепариназы представляют собой смесь гепариназы 1 (ЕС 4.2.2.7.), гепариназы 2 (гепарин лиаз II) и гепариназы 3 (ЕС 4.2.2.8.).
Затем полученный таким образом деполимеризат обрабатывают предпочтительно раствором NaBH4 в ацетате натрия. Эта последняя операция позволяет специфически восстанавливать восстановительные концы, которые не имеют форму 1,6-ангидро (продукты, описанные в заявке на патент WO 01/72762). Наконец, для количественного определения дисахаридов 1 и 2, описанных выше, образец низкомолекулярного гепарина должен быть восстановлен под действием восстановителя, такого, как NaBH4.
Таким образом, более конкретно изобретение относится к способу, описанному выше, отличающемуся тем, что в качестве восстановителя используют NaBH4. В случае необходимости, можно использовать другую соль щелочного металла - боргидрид, например, лития или калия.
Количественное определение концов 1,6-ангидро осуществляют посредством ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) и, в частности, анионообменной хроматографией.
Способ количественного определения согласно изобретению позволяет четко отличать Lovenox от других низкомолекулярных гепаринов, которые не содержат таких производных “1,6-ангидро”. И наоборот, способ количественного определения согласно изобретению позволяет убедиться в том, что низкомолекулярные гепарины не обладают физико-химическими свойствами Lovenox и, следовательно, имеют другую природу.
Способ количественного определения согласно изобретению можно применять при осуществлении промышленного способа для контроля образцов в процессе осуществления способа с тем, чтобы обеспечить стандартизацию способа производства Lovenox и получать однородную продукцию.
После ферментативной деполимеризации и восстановления восстановительных концов, производные 1,6-ангидро Lovenox представлены в 4 основных формах. Таким образом, изобретение относится также к способу, описанному выше, отличающемуся тем, что в ходе реакции деполимеризации получают следующие остатки 1,6-ангидро:
Figure 00000002
Все олигосахариды или полисахариды, имеющие конец 1,6-ангидро на дисахаридном концевом участке и не имеющие 2-0 сульфата на уроновой кислоте указанного концевого дисахарида, полностью деполимеризуются гепариназами в виде дисахаридов 1 и 2. И наоборот, если указанный концевой сахарид имеет 2-0 сульфат на уроновой кислоте и имеет форму маннозамина, производное 1,6-ангидро находится в виде тетрасахарида 1 (форма, устойчивая к гепариназам).
Трисахарид 1 (см. ниже) также входит в состав смеси. Он образуется в ходе другого процесса разложения, который приводит к образованию нижеуказанной структуры (явление peeling, наблюдаемый в процессе химической деполимеризации Lovenox.
Figure 00000003
Другие компоненты смеси не являются характерными только для Lovenox. Конечно, имеются 8 элементарных дисахаридов гепариновой цепочки. Эти 8 элементарных дисахаридов производит фирма Sigma.
Другие дисахариды были идентифицированы в смеси способом согласно изобретению: дисахариды ΔIIsgal и ΔIVsgal, которые образуются при 2-0 щелочной десульфатации -IdoA(2S)-GlcNS(6S)- и -IdoA(2S)-GlcNS-, в результате которой образуются 2 галактуроновые кислоты. Они обычно не присутствуют в первоначальной структуре гепарина (U.M.Desai et Coll. Arch. Biochem. Biophys., 306(2) 461-468 (1993).
Figure 00000004
Олигосахариды, содержащие 3-0 сульфатированные глюкозамины являются устойчивыми в отношении расщепления гепариназами и остаются в форме тетрасахаридов.
Что касается большей части низкомолекулярных гепаринов, гепарин экстрагируют из слизи свиней и эти основные тетрасахариды представлены ниже. Они устойчивы к ферментативной деполимеризации и являются отражением последовательностей, имеющих сродство к антитромбину III. Их обозначают следующим образом: ΔIIa-IIs glu и ΔIIa-IVs glu (S.YAMADA, K.YOSHIDA, M.SUGIURA, K. SUGAHARA, K-H KHOO, H.R.MORRIS, A.DELL, J.Biol.Chem.; 270(7), 4780-4787 (1993).
Figure 00000005
Последним компонентом смеси, расщепляемой гепариназами, является гликосериновое окончание ΔGLcA-Gal-Gal-Xyl-Ser (K.SUGAHARA, H.TSUDA, K.YOSHIDA, S.YAMADA, J.Biol.Chem.; 270(39), 22914-22923 (1995); K.SUGAHARA, S.YAMADA, K.YOSHIDA, P.de WAARD, J.F.G.VLIEGENTHART; J.Biol.Chem.; 267(3), 1528-1533 (1992). Этот последний компонент почти не содержится в Lovenox (см. ЯМР в примере 5)
Figure 00000006
Другой аспект изобретения относится к способу хроматографии, используемому для определения групп 1,6-ангидро. Прежде всего речь идет о разделении разных полисахаридов, полученных в результате деполимеризации и обработки восстановителем, таким как NaBH4.
Анионообменная хроматография (SAX) является методом разделения, наиболее подходящим для такой сложной смеси.
Можно использовать колонки длиной 25 см, наполненные стационарной фазой типа Spherisorb SAX, имеющей гранулометрию 5 мкм. Подходят любые диаметры традиционных колонок от 1 мм до 4,6 мм.
В качестве оборудования можно использовать хроматограф, обеспечивающий образование градиента элюирования с помощью УФ-детектора, предпочтительно снабженный диодной антенной для получения УФ-спектров компонентов и регистрации сложных сигналов, являющихся результатом разницы между коэффициентами поглощения двух волн разной длины, и обеспечивающий специфическое обнаружение ацетилированных олигосахаридов. Для осуществления такого вида обнаружения предпочтительными являются подвижные фазы, проницаемые для УФ до 200 нм. Это исключает использование традиционных подвижных фаз на основе NaCl, недостатком которых к тому же является необходимость в пассивированной хроматограмме с тем, чтобы сопротивляться коррозионному действию хлоридов. Используемая в данном случае подвижная фаза предпочтительно имеет в своей основе перхлорат натрия, но можно также использовать метансульфонатные или фосфатные соли.
рН, рекомендуемый для разделения, составляет от 2 до 6,5. Предпочтительным является рН, равный примерно 3. В данном случае его регулируют путем добавления соли, такой как фосфат, обладающей свойством буфера при рН 3, которое превосходит свойство перхлоратов.
В качестве примера ниже приведены стандартные условия осуществления хроматографического разделения:
Растворитель А: NaH2PO4 2,5 мМ, рН доводят до 2,9 путем добавления H3PO4.
Растворитель В: NaClO4 1N-NaH2PO4 2,5 мМ, рН доводят до 3,0 путем добавления H3PO4.
Градиент элюирования может быть следующим:
Т=0 мин: %В=3; Т=40 мин: %В=60; Т=60 мин: %В=80
Таким образом, изобретение относится к способу анализа, указанному выше, путем разделения анионообменной хроматографией, отличающемуся тем, что используют подвижную фазу, проницаемую для УФ до 200 нм.
Более конкретно изобретение касается подвижной фазы, указанной выше, на основе перхлората натрия, метансульфонатной или фосфатной солей.
Другой очень важный аспект изобретения заключается в способе детекции.
Способ был разработан с тем, чтобы повысить специфичность обнаружения УФ. Поскольку все неацетилированные полисахариды при заданном рН имеют довольно близкий УФ-спектр, можно селективно выявлять ацетилированные сахара, принимая в качестве сигнала разницу между коэффициентом поглощения при двух значениях длины волны, выбранных так, что коэффициент поглощения неацетилированных сахаридов аннулируется.
В описанном ниже случае выбирают 202 нм и 230 нм в качестве значений длины волны для выявления и сравнения и регистрируют сигнал 202-230 нм. Выбор, конечно, зависит от рН подвижной фазы (регулирование в пределах нескольких нм может быть необходимо для оптимизации указанных условий). Датчиком, наиболее подходящим для такой технологии, является датчик DAD 1100 фирмы Agilent Technologies. В этом случае детекцию осуществляют двукратно, с одной стороны, при 234 нм, а, с другой стороны, при 202-230 нм. Принцип селективной детекции ацетилированных олигосахаридов показан ниже на фигуре, на которой УФ-спектр сульфатированного дисахарида Delta 1s сравнивают с УФ-спектром ацетилированного дисахарида Delta 1а
Figure 00000007
Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу анализа, описанному выше, путем разделения анионообменной хроматографией, отличающемуся тем, что способ детекции позволяет селективно выявлять ацетилированные сахара.
Еще более конкретно настоящее изобретение относится к способу анализа, описанному выше, путем разделения анионообменной хроматографией, отличающемуся тем, что селективную детекцию ацетилированных сахаров осуществляют, принимая в качестве сигнала разницу между коэффициентом поглощения при двух значениях длины волны, выбранных так, что коэффициент поглощения неацетилированных сахаридов аннулируется.
Количественное определение четырех остатков 1,6-ангидро, описанных выше, требует достаточной селективности хроматографической системы в отношении всех других компонентов смеси. Оба дисахарида 1 и 2, обычно коэлюированные, имеют слабое разрешение по сравнению с ΔIIa, тем более, что последний присутствует в виде двух своих аномеров α и β.
Выявление двух дисахаридов 1 и 2 можно легко проверить, т.к. они образуются в течение нескольких часов при комнатной температуре в водном растворе ΔIIs, рН которого доводят до 13 путем добавления NaOH. Однако, если проводят двукратную детекцию, ацетилированные олигосахариды ΔIVa, ΔIIa, ΔIIIa, ΔIa, ΔIIa-IVs glu и
ΔIIa-IIs glu легко идентифицировать.
Причинами расщепления пиков являются, с одной стороны, аномерные формы и в меньшей степени эпимеризация глюкозамин ↔ маннозамин, частично затрагивающая ΔIIs, ΔIIIs и ΔIs, если они находятся на конце олигосахаридной цепочки.
Для количественного определения дисахаридов 1 и 2 образец низкомолекулярного гепарина, деполимеризованный гепариназами, восстанавливают под действием NaBH4.
Figure 00000008
Преимущество такого восстановления заключается в том, что позволяет устранить аномерность α ↔ β путем раскрытия олигосахаридного концевого цикла. Полученная хроматограмма является более простой, т.к. аномерности аннулированы и восстановление ΔIIa снижает его удерживание на колонке и позволяет легко осуществить количественное определение дисахаридов 1 и 2.
Примеры хроматограмм, изображенные ниже на фиг. 1 и 2, иллюстрируют эти феномены и преимущества такого способа.
Наконец, изобретение относится также к новых сахаридным производным, полученным способом деполимеризации и восстановления, выбранным из дисахарида 1, дисахарида 2, дисахарида 3 и трисахарида 1.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретение и не имеют ограничительного характера.
Пример 1
Ферментативную деполимеризацию проводят в течение 48 часов при комнатной температуре путем смешивания 50 мкл раствора 20 мг/мл низкомолекулярного гепарина, количество которого определяют, 200 мкл раствора 100 мМ уксусной кислоты/NaOH с рН, равным 7,0, содержащего 2 мМ ацетата кальция и 1 мг/мл BSA, с 50 мкл маточного раствора 3 гепариназ.
Восстановливают 60 мкл деполимеризованного гепариназами продукта путем добавления 10 мкл раствора NaBH4 из расчета 30 г/л в ацетате натрия 100 мМ, приготовленного пред самым употреблением. Следует отметить, что гепариназы хранят при -30°С. Гепариназы находятся в буферном растворе и их титр составляет 0,5 UI/мл (состав буферного раствора: водный раствор рН 7 KH2PO4 c концентрацией 0,01 моль/л с добавлением сыворотки бычьего альбумина (BSA) из расчета 2 мг/мл).
Пример 2
ЯМР дисахарида 3, полученного описанным выше способом
Протоновый спектр в D2O, 400 МГц, Т=298К, δ м.д.: 3,34 (1Н, дд, J=7 и 2 Гц, Н2), 3,72 (1Н, т, J=8 Гц, Н6), 3,90 (1Н, м, Н3), 4,03 (1Н, с, 4Н), 4,20 (1Н, д, J=8 Гц, Н6), 4,23 (1Н, т, J=5 Гц, Н3'), 4,58 (1Н, м, Н2'), 4,78 (1Н, м, Н5), 5,50 (1Н, с, Н1), 5,60 (1Н, дд, J= 6 и 1 Гц, Н1'), 6,03 (1Н, д, J=5 Гц, Н4').
Пример 3
ЯМР тетрасахарида 1, полученного описанным выше способом
Протоновый спектр в D2O, 400 МГц, Т=298К, δ м.д.: 3,15 (1Н, с, Н2), 3,25 (1Н, м, Н2''), 3,60 (1Н, м, Н3''), 3,70-4,70 (14Н, массив, Н3/Н4/Н6, H2'/H3'/H4'/H5', H4''/H5''/H6'', H2'''/H3'''), 4,75 (1Н, м, Н5), 5,20-5,40 (2Н, м, H1' и H1''), 5,45 (1H, м, H1'''), 5,56 (1Н, м, Н1), 5,94 (1Н, д, J=5 Гц, Н4).
Пример 4
ЯМР тетрасахарида 1, полученного описанным выше способом
Протоновый спектр в D2O, 600 МГц (δ м.д.): 3,28 (1Н, м), 3,61 (1Н, т, 7 Гц), 3,79 (1Н, т, 7 Гц), 3,95 (1Н, д, 6 Гц), 4,00 (1Н, с), 4,20 (1Н, м), 4,28 (2Н, м), 4,32 (1Н, д, 4 Гц), 4,41 (1Н, с), 4,58 (1Н, с), 4,61 (1Н, с), 4,90 (1Н, уш.с), 5,24 (1Н, с), 5,45 (1Н, с), 5,95 (1Н, с).
Пример 5
ЯМР ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser
Спектр в D2O, 500 МГц (δ м.д.): 3,30 (1Н, т, 7Гц), 3,34 (1Н, т, 8 Гц), 3,55 (1Н, т, 7 Гц), 3,60 (1Н, т, 7 Гц), 3,63-3,85 (10Н, м), 3,91 (2Н, м), 3,96 (1Н, дд, 7 и 2 Гц), 4,02-4,10 (3Н, м), 4,12 (1Н, д, 2Гц), 4,18 (1Н, м), 4,40 (1Н, д, 6 Гц), 4,46 (1Н, д, 6 Гц), 4,61 (1Н, д, 6 Гц), 5,29 (1Н, д, 3Гц), 5,85 (1Н, д, 3 Гц).
Пример 6: Принцип количественного определения
В способе согласно изобретению в качестве широкой гипотезы допускают, что все ненасыщенные олигосахариды, содержащиеся в смеси, имеют одинаковый молярный коэффициент поглощения, равный 5500 моль-1.1.см-1.
Следовательно, можно определить весовой процент всех компонентов смеси, деполимеризированной в исходном низкомолекулярном гепарине. Для 4 производных 1,6-ангидро, которые соответствуют пикам 7, 8, 13 и 19, получают следующее весовое процентное содержание:
Figure 00000009
Area7, Area8, Area13 и Area19 соответствуют площадям каждого из пиков 7, 8, 13 и 19. Молекулярные массы каждого из этих 4 соединений составляют соответственно 443, 443, 545 и 1210.
∑ Mwx.Areax соответствует отношению площади каждого пика хроматограммы к молекулярной массе соответствующего продукта.
Если Mw обозначает среднюю массу рассматриваемого низкомолекулярного гепарина, процентное содержание олигосахаридных цепочек, заканчивающихся кольцом 1,6-ангидро, получают следующим образом:
Молекулярные массы компонентов следующие:
Олигосахариды Олигосахариды после восстановления Молекулярная масса
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19		 1
20
3
21
22
23
7
8
24
25
26
27
13
28
29
30
31
32
19		 741
401
734
461
461
503
443
443
503
563
563
563
545
605
1066
665
965
1168
1210
Номенклатура сахаридов и соответствие с пиками по фиг.1 и 2
IdoA:-α-L-идопиранозилуроновая кислота;
GlcA:-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота;
ΔGlcA: 4,5-ненасыщенная кислота: 4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая кислота
Gal: D-галактоза;
Xyl: ксилоза;
GlcNAc: 2-деокси-2-ацетамидо-α-D-глюкопираноза;
GlcNS: 2-деокси-2-сульфамидо-α-D-глюкопираноза;
2S: 2-О сульфат
3S: 3-О сульфат
6S: 6-О сульфат
1: ΔGlcAβ1-3 Galβ1-3 Galβ1-4 Xyl β1-O-Ser
2: натриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→4)-2-дезокси-2-ацетамидо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
3: ΔGlcAβ1-3 Galβ1-3 Galβ1-4 Xyl β1-O-СН2-СООН
4: динатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-глюкопираноза)кислоты
5: динатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
6: динатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
7: динатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β- D-глюкопираноза)кислоты (дисахарид 1)
8: динатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β- D-маннопираноза)кислоты (дисахарид 2)
9: динатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-β-D-глюкопиранозил)кислоты
10: тринатриевая соль (4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-β-D-глюкопираноза)кислоты
11: тринатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
12: тринатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
13: тринатриевая соль(4-деокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гекс-4-енпиранозилуроновая-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-глюкопираноза)кислоты (дисахарид 3)
14: тринатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
15: пентанатриевая соль (4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)
16: тетранатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)кислоты
17: гексанатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3,6-ди-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил)
18: гексанатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-2-О-сульфо-α-L-идопиранозилуроновая кислота)
19: гептанатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-2-О-сульфо-α-L-идопиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-1,6-ангидро-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-маннопираноза)(тетрасахарид 1)
20: натриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-α-D-глюцит)кислоты
21: динатриевая соль(4-деокси-α-L-трео-гекс-4-енгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-β-D-глюцит)кислоты
22: динатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюцит)кислоты
23: динатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты
24: динатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-α-D-глюцит)кислоты
25: тринатриевая соль(4-деокси-α-L-трео-гексенгалактопиранозилуроновая-(1→ 4)-2-деокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-β-D-глюцит)кислоты
26: тринатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты
27: тринатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-α-D-глюцит)кислоты
28: тринатриевая соль (4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты
29: пентанатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота -(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота (1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3-О-сульфо-α-D-глюцит) кислоты
30: тетранатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая-(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюцит)кислоты
31: гексанатриевая соль(4-дезокси-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота-(1→ 4)-2-дезокси-2-ацетамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-β-D-глюкопиранозилуроновая кислота(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-3,6-ди-О-сульфо-α-D-глюцит) кислоты
32: гексанатриевая соль(4-дезокси-2-О-сульфо-α-L-трео-гексенпиранозилуроновая кислота -(1→ 4)-2-дезокси-2-сульфамидо-6-О-сульфо-α-D-глюкопиранозил-(1→ 4)-2-О-сульфо-α-L-идопиранозилуроновая кислота)(форма, восстановленная NaBH4).
Фигура 1
Хроматографическое разделение Еноксапарина, деполимеризованного гепариназами до и после восстановления с помощью NaBH4 (сигнал, обозначенный тонкой черной линией: УФ - 234 нм; сигнал, обозначенный жирной черной линией: УФ от 202 до 234 нм).
Фигура 2:
Хроматографическое разделение гепарина, деполимеризированного гепариназами, до и после восстановления с помощью NaBH4 (сигнал, обозначенный тонкой черной линией: УФ - 234 нм; сигнал, обозначенный жирной черной линией: УФ от 202 до 234 нм).

Claims (7)

1. Способ количественного определения гепаринов или низкомолекулярных гепаринов в исследуемом образце для определения присутствия в нем олигосахаридных цепочек, конец которых изменен связью 1,6-ангидро, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
1) деполимеризация образца под действием гепариназ, которые находятся в виде смеси гепариназы 1 (ЕС 4.2.2.7.), гепариназы 2 (гепарин лиазы II) и гепариназы 3 (ЕС 4.2.2.8.);
2) восстановление деполимеризата, причем в качестве восстановителя используют NaBH4 или соль щелочного металла с анионом боргидрида;
3) количественное определение олигосахаридных остатков 1,6-ангидро путем ВЭЖХ,
причем используемый способ хроматографии представляет собой анионообменную хроматографию, при которой используют подвижную фазу, проницаемую для УФ до 200 нм, и при которой предпочтительно используют способ детекции, позволяющий селективно детектировать ацетилированные сахара, принимая в качестве сигнала разницу между коэффициентом поглощения при 2 значениях длины волны, выбранных таким образом, что коэффициент поглощения неацетилированных сахаридов аннулируется.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемая подвижная фаза имеет в своей основе перхлорат натрия, метансульфонатные соли или фосфатные соли.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в ходе реакции деполимеризации получают следующие олигосахаридные производные:
Figure 00000010

Figure 00000011

Figure 00000012

Figure 00000013
4. Дисахарид 1 формулы
Figure 00000014
5. Дисахарид 2 формулы
Figure 00000015
6. Дисахарид 3 формулы
Figure 00000016
7. Трисахарид формулы:
Figure 00000017
RU2005112240/13A 2002-09-23 2003-09-22 Способ определения специфических групп, образующих гепарины RU2359037C2 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0211724A FR2844808B1 (fr) 2002-09-23 2002-09-23 Methode de determination de groupements specifiques constituant les heparines ou les heparines de bas poids moleculaire
FR02/11724 2002-09-23
US42248202P 2002-10-31 2002-10-31
US60/422,482 2002-10-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2005112240A RU2005112240A (ru) 2005-11-20
RU2359037C2 true RU2359037C2 (ru) 2009-06-20

Family

ID=32031841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2005112240/13A RU2359037C2 (ru) 2002-09-23 2003-09-22 Способ определения специфических групп, образующих гепарины

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP1558755B1 (ru)
JP (1) JP4373917B2 (ru)
KR (1) KR20050057550A (ru)
CN (1) CN101747385B (ru)
AU (1) AU2003279430B2 (ru)
BR (1) BRPI0314654B8 (ru)
CA (1) CA2499537A1 (ru)
CO (1) CO5721022A2 (ru)
HK (1) HK1081601A1 (ru)
HR (1) HRP20050273A2 (ru)
IL (1) IL167569A (ru)
MA (1) MA27393A1 (ru)
MX (1) MXPA05001945A (ru)
NO (1) NO20051744L (ru)
PL (1) PL376709A1 (ru)
RS (1) RS20050230A (ru)
RU (1) RU2359037C2 (ru)
WO (1) WO2004027087A2 (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7575886B2 (en) 2002-03-11 2009-08-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Analysis of sulfated polysaccharides
EP1582531A1 (en) * 2004-03-24 2005-10-05 Aventis Pharma S.A. Process for oxidizing unfractionated heparins and detecting presence or absence of glycoserine in heparin and heparin products
FR2880951B1 (fr) * 2005-01-19 2015-09-18 Aventis Pharma Sa Methode d'analyse d'oligosaccharides a partir de plasma sanguin
US8101733B1 (en) 2006-06-27 2012-01-24 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of evaluating mixtures of polysaccharides
WO2008068854A1 (ja) 2006-12-05 2008-06-12 Glycoscience Laboratories, Inc. 変形性関節症の治療剤
US7968082B1 (en) 2007-01-26 2011-06-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by NMR
US7790466B1 (en) 2007-01-26 2010-09-07 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating mixtures of low molecular weight heparins by chain profiles or chain mapping
US9139876B1 (en) 2007-05-03 2015-09-22 Momenta Pharmacueticals, Inc. Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin
WO2011090948A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
WO2012115952A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
CN103755823B (zh) * 2013-12-12 2016-09-28 中国海洋大学 一种硫酸软骨素中硫酸角质素的纯化与检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8102987A (en) * 1986-10-02 1988-04-21 Massachusetts Institute Of Technology Neutralizing anticoagulant activities of low molecular weight heparin
US6190875B1 (en) * 1997-09-02 2001-02-20 Insight Strategy & Marketing Ltd. Method of screening for potential anti-metastatic and anti-inflammatory agents using mammalian heparanase as a probe

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006500019A (ja) 2006-01-05
CO5721022A2 (es) 2007-01-31
HRP20050273A2 (en) 2006-05-31
CA2499537A1 (fr) 2004-04-01
KR20050057550A (ko) 2005-06-16
MA27393A1 (fr) 2005-06-01
BR0314654A (pt) 2005-08-02
WO2004027087A3 (fr) 2005-06-09
NO20051744L (no) 2005-04-08
BRPI0314654B8 (pt) 2021-05-25
EP1558755B1 (fr) 2012-10-24
PL376709A1 (pl) 2006-01-09
BRPI0314654B1 (pt) 2016-01-05
RS20050230A (en) 2007-06-04
RU2005112240A (ru) 2005-11-20
JP4373917B2 (ja) 2009-11-25
HK1081601A1 (en) 2006-05-19
AU2003279430B2 (en) 2008-09-11
EP1558755A2 (fr) 2005-08-03
AU2003279430A1 (en) 2004-04-08
IL167569A (en) 2010-12-30
CN101747385A (zh) 2010-06-23
CN101747385B (zh) 2013-03-06
WO2004027087A2 (fr) 2004-04-01
MXPA05001945A (es) 2005-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1730200B1 (en) Method for quantitatively determining specific constituting heparins or low molecular weight heparins using HPLC
EP2314632B1 (en) Oligosaccharidic compounds derived from heparin
JP4806394B2 (ja) 逆相カラムクロマトグラフィーを使用したヘパリンまたは低分子量ヘパリンを構成する特定グループの測定方法
ZA200501741B (en) Mehtod of determining specific groups forming heparins
RU2359037C2 (ru) Способ определения специфических групп, образующих гепарины
Nielsen et al. Determination of urinary oligosaccharides by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization–tandem mass spectrometry: application to Hunter syndrome
Ramsay et al. Determination of monosaccharides and disaccharides in mucopolysaccharidoses patients by electrospray ionisation mass spectrometry
US20040265943A1 (en) Method for quantitatively determining specific groups constituting heparins or low molecular weight heparins
Chi et al. Mass spectrometry for the analysis of highly charged sulfated carbohydrates
EP2697265A1 (en) Polysaccharides comprising two antithrombin iii-binding sites, preparation thereof and use thereof as antithrombotic medicaments
MXPA06010455A (es) Metodo para determinar cuantitativamente los especificos que constituyen heparinas o las heparinas de bajo peso molecular usando hplc
KAWARASAKI et al. Studies on the Structure of Polysaccharide from Trichophyton mentagrophytes
Desai et al. Measurement of the Antithrombin III Binding Sites in Low Molecular Weight Heparins by 13C NMR and Capillary Electrophoresis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20200923