MXPA06010455A - Metodo para determinar cuantitativamente los especificos que constituyen heparinas o las heparinas de bajo peso molecular usando hplc - Google Patents

Abstract

Un método para analizar heparinas o heparinas de bajo peso molecular, caracterizado porque la muestra que se va a ensayar se despolimeriza por la acción de heparinasas y después, cuando resulte apropiado, el despolimerizado obtenido se reduce y después se lleva a cabo un análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución.

Description

MÉTODO PARA DETERMINAR CUANTITATIVAMENTE LOS ESPECÍFICOS QUE CONSTITUYEN HEPARINAS O LAS HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR USANDO HPLC Una modalidad de la presente invención es un método para detectar o cuantificar la cantidad de componentes que tiene una estructura 1 -6 anhidro o de azúcares acetilados en una muestra de heparinas fraccionadas o de heparinas sin fraccionar. Las heparinas son agentes activos desde un punto de vista biológico de la familia de los glucosaminoglicanos, extraídas de fuentes naturales, y que tienen propiedades anticoagulantes y antitrombóticas valiosas. En particular, resultan útiles en el tratamiento de trombosis venosas postoperatorias. Para producir heparinas de bajo peso molecular (LMWH) a partir de una heparina de partida, las cadenas heparínicas de polisacárido más largas deben degradarse en cadenas más cortas con un peso molecular menor. Esto puede realizarse tanto mediante despolimerización química como enzimática. El resultado puede ser unos pesos moleculares medios para las cadenas de polisacárido de LMWH de aproximadamente 5.000 Da. Las LMWH, al igual que la heparina sin fraccionar, inhiben la coagulación mediante la unión a ATl II en secuencias de pentasacárido particulares distribuidas a lo largo de algunas de las cadenas de polisacárido. Cada fabricante de LMWH de un producto autorizado utiliza un procedimiento de despolimerización distinto. A no ser que dos fabricantes utilicen el mismo procedimiento, esta diferencia en el procedimiento resulta en LMWH con estructuras químicas distintas y, por lo tanto, con actividad farmacológica distinta y con indicaciones autorizadas distintas para su utilización clínica. Las LMWH resultantes se diferencian estructuralmente por el procedimiento de despolimerización utilizado en su fabricación (R.J. Linhardt et al. , Seminars in Thombosis and Hemostatis 1999; 25(3 Sup.): 5-16). Como resultado, las LMWH son más heterogéneas que la heparina. Cada procedimiento diferente produce modificaciones estructurales muy complejas y únicas de las cadenas de polisacárido. Estas modificaciones incluyen diferencias en las longitudes de las cadenas y en las secuencias de las cadenas, así como en huellas estructurales. Por consiguiente, las diferentes LMWH pueden tener perfiles farmacológicos distintos e indicaciones clínicas autorizadas distintas. La enoxaparina sódica está disponible a partir de Aventis y se vende en los Estados Unidos en la forma de inyección de enoxaparina sódica, bajo la marca registrada Lovenox® (Clexane® en otros paises). En general, la enoxaparina sódica se obtiene mediante la degradación alcalina del éster de bencilo de la heparina obtenido a partir de mucosa intestinal porcina. Su estructura se caracteriza, por ejemplo, por un grupo ácido 2-0-sulfo-4-enepiranosurónico en el extremo no reductor y por una 2-N,6-0-disulfo-D-gIucosamina en el extremo reductor de la cadena. El peso molecular medio es aproximadamente 4.500 daltones. La distribución del peso molecular es: <2.000 daltones <20% 2.000 a 8.000 daltones >68% >8.000 daltones <18% En la fabricación de la enoxaparina sódica, se produce una desulfatación en la posición 6-O de la glucosamina, que da lugar a la formación de derivados denominados "1 ,6 anhidro" (Solicitud de Patente Internacional WO 01 /29055), como se muestra más abajo: Este tipo de derivado sólo se obtiene en el caso de cadenas de oligosacárido cuya glucosamina terminal está sulfatada en la posición 6-O . El porcentaje de cadenas de oligosacárido cuyo extremo está modificado con u n enlace 1 ,6-anh idro es una característica estructural de la mezcla de oligosacáridos de la enoxaparina sódica y debería ser posible determinarlo. En base al conocimiento actual, entre el 1 5% y el 25% de los componentes de la enoxaparina sódica tienen u na estructura 1 ,6-an hidro en el extremo reductor de su cadena. Por lo tanto, una modalidad de la presente invención proporciona un método para analizar heparinas sin fraccionar y heparinas fraccionadas. Las "heparinas fraccionadas" como se emplea en esta memoria se refiere a cualq uier heparina que se somete a despolimerización , por ejemplo, heparinas de bajo peso molecular (LMWH), que incluyen enoxaparina sódica y cualquier LMWH para la que se busque autorización por una autoridad reguladora de acuerdo con una solicitud que cite Lovenox®/ Clexane® (inyección de enoxaparina sódica) como el medicamento registrado. En una modalidad , el método de análisis de acuerdo con la invención es el sigu iente: La muestra que se va a ensayar se despolimeriza mediante la acción de heparinasas y después, cuando resulte apropiado, el despolimerizado obtenido se reduce y después se lleva a cabo el análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución .

Por lo tanto, el método tal y como se ha definido más arriba, se caracteriza porque el despolimerizado se analiza para detectar la presencia de cadenas de oligosacárido cuyo extremo está modificado con un enlace 1 ,6-anhidro ("grupos 1 ,6-anhidro"). En una modalidad relacionada, la muestra que se va a ensayar se despolimeriza de manera exhaustiva en primer lugar con una mezcla de heparinasas, por ejemplo, heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.), heparinasa 2 (heparina liasa I I) y heparinasa 3 (EC 4.2.2.8.), por ejemplo, con 0.5 unidades/ml de cada heparinasa. (Estas enzimas están comercializadas por el grupo Grampian Enzymes). Por lo tanto un objeto de la invención es un método para analizar heparinas sin fraccionar o heparinas fraccionadas, que comprende las etapas siguientes: (a) despolimerización de la muestra por la acción de heparinasas (b) cuando resulte apropiado, reducción del despolimerizado (c) analizar la muestra de la etapa (a) o (b) mediante cromatografía líquida de alta resolución. En una modalidad, el objeto de la invención es el método que se ha definido más arriba, en el que las heparinasas están en la forma de una mezcla de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.), heparinasa 2 (heparina liasa I I), y heparinasa 3 (EC 4.2.2.8.). El despolimerizado preparado de esta manera puede tratarse entonces para reducir los extremos reductores que no están en la forma 1 ,6-anhidro (productos descritos en la solicitud de patente internacional WO 01 /72762). En una modalidad, el despolimerizado puede tratarse con una disolución de NaBH4 en acetato sódico para reducir los extremos reductores que no están en la forma 1 ,6- anhidro. Finalmente, con el fin de poder cuantificar los disacáridos 1 y 2 descritos más abajo, la muestra de la heparina de bajo peso molecular, despolimerizada con heparinasas, puede reducirse por la acción de un agente reductor como NaBH4. Por lo tanto, un objeto de la invención es el método que se ha definido más arriba, en el que se reduce la heparina despolimerizada. Un objeto de la invención es, de manera adicional, el método que se ha definido más arriba, en el que el agente reductor es NaBH4. También pueden utilizarse otras sales de metales alcalinos de borohidruro, tales como litio o potasio. Los métodos de ensayo de acuerdo con la invención hacen posible diferenciar de manera clara la enoxaparina sódica de otras heparinas con bajo peso molecular que no contienen derivados "1 ,6-anhidro". Por el contrario, los métodos de la invención hacen posible asegurar que las heparinas con bajo peso molecular no tienen las características fisicoquímicas de la enoxaparina sódica y que, por lo tanto, son de naturaleza diferente. Los métodos de acuerdo con la invención pueden aplicarse, por ejemplo, al procedimiento industrial durante el control de las muestras en el procedimiento con el fin de proporcionar la estandarización del procedimiento para la fabricación de enoxaparina sódica y para obtener lotes uniformes. Después de la despolimerización enzimática y de la reducción opcional de los extremos reductores, los derivados 1 ,6-anhidro de la enoxaparina sódica existen en 4 formas esenciales, es decir, disacárido 1 , disacárido 2, disacárido 3, y tetrasacárido 1 . Por lo tanto, un objeto de la invención es también el método que se ha descrito más arriba, en el que los restos 1 ,6-anhidro obtenidos durante la reacción de despolimerización incluyen los siguientes: disacárido 2 disacárido 1 disacárido 3 tetrasacárido 1 Todos los oligosacáridos o polisacáridos que contienen el extremo 1 ,6-anhidro en la unidad del disacárido terminal y que no poseen un grupo sulfato en la posición 2-0 del ácido urónico de dicho disacárido terminal se despolimerizan completamente con las heparinasas y están en la forma de los disacáridos 1 y 2. Por otra parte, cuando el sacárido terminal contiene un grupo sulfato en la posición 2-0 del ácido urónico y cuando éste está en la forma manosamina, el derivado 1 ,6-anhidro está en la forma de tetrasacárido 1 (forma resistente a heparinasas).

El trisacárido 1 (véase más abajo) también puede estar presente en la mezcla. Se obtiene a partir de otro procedimiento de degradación que da lugar a la estructura que aparece más abajo (fenómeno de descortezamiento observado durante la despolimerización química de la enoxaparina sódica). trisacárido 1 Los otros constituyentes de la mezcla no son sólo característicos de la enoxaparina sódica. Por supuesto, son los 8 disacáridos elementales de la cadena de heparina. Estos 8 disacáridos elementales están comercializados entre otros por la empresa Sigma. Se identificaron otros disacáridos en la mezcla mediante el método de acuerdo con la invención: los disacáridos ?IISga? y ?lVSga?, que tienen como origen la desulfatación alcalina de la posición 2-O de -IdoA(2S)-GlcNS(6S)- y de -ldoA(2S)-GIcNS-, que da lugar a la formación de 2 ácidos galacturónicos. Éstos no están presentes habitualmente en la estructura original de la heparina (U.M. Desai et al. , Arch. Biochem. Biophys., 306 (2) 461 -468 (1993)).

Los oligosacáridos que contienen glucosaminas sulfatadas en la posición 3-0 resisten la rotura por las heparinasas y permanecen presentes en la forma de tetrasacáridos. En el caso de la mayoría de las heparinas con bajo peso molecular, la heparina se extrae a partir de mucosa de cerdo, y estos tetrasacáridos principales están representados más abajo. Estos tetrasacáridos son resistentes a la despolimerización enzimática y reflejan las secuencias que tienen afinidad por antitrombina l l l. Estos tetrasacáridos se simbolizan como sigue: ?l la-l lsan, y ?l la-IVsa?„. (S. YAMADA, K. YOSH IDA, M. SUG IURA, K-H KHOO, H. R. MORRIS, A. DELL, J. Biol. Chem. ; 270(7), 4780-4787 (1993)).

El constituyente final de la mezcla degradada con heparinasas es el extremo de glicoserina ?GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser (K. Sugahara, et al., J. Biol. Chem.; 270(39), 22914-22923 (1995); K. Sugahara, et al.; J. Biol. Chem.; 267(3), 1528-1533 (1992)). El último está generalmente En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento cromatográfico para detectar grupos 1,6-anhidro. En una modalidad, el método implica separar los diferentes oligosacáridos obtenidos después de la despolimerización y tratar, de manera opcional, con un agente reductor como NaBH . La separación de los diferentes oligosacáridos de acuerdo con la presente invención, puede llevarse a cabo mediante HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución). En una modalidad, el HPLC es una cromatografía de intercambio aniónico. En una modalidad relacionada, la cromatografía de intercambio aniónico es una cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX). Como se emplea en esta memoria, el término "cromatografía de intercambio aniónico fuerte" (SAX) implica una cromatografía de intercambio aniónico que se lleva a cabo en cualquier resina que mantiene una carga positiva neta constante en el intervalo de aproximadamente pH 2-12. En determinadas modalidades de la invención , la cromatografía de intercambio aniónico fuerte utiliza un soporte sólido funcionalizado con grupos de intercambio de amonio cuaternario. Por ejemplo, pueden utilizarse columnas como Spherisorb® SAX (Waters Corp, Milford MA) que tienen un tamaño de partícula de aproximadamente 5 µm, una longitud de columna de aproximadamente 25 cm y un diámetro de columna de entre aproximadamente 1 mm y aproximadamente 4,6 mm. El equipo utilizado puede ser cualquier cromatógrafo que permita la formación de un gradiente de elución y que esté equipado con un detector de UV adecuado que sea adecuado para la detección selectiva de azúcares acetilados. En una modalidad de la invención, el detector de UV es un diodo agrupado que permite la generación de un espectro de UV de los constituyentes y que permite registrar las señales complejas que resultan de la diferencia entre la absorbancia a 2 longitudes de onda diferentes. Dicho detector diodo agrupado permite la detección específica de oligosacáridos acetilados. En una modalidad relacionada, se utilizan fases móviles en el HPLC que son transparentes en la región UV hasta 200 nm. En esta modalidad, se excluyen las fases móviles convencionales basadas en NaCI, que tienen la desventaja adicional de requerir un cromatógrafo pasívado con el fin de resistir el poder corrosivo de los cloruros. Las fases móviles que pueden utilizarse de acuerdo con esta modalidad de la invención incluyen , pero no están limitadas a, las fases móviles basadas en sales perclorato sódico, metanosulfonato o fosfato. En una modalidad, la fase móvil es una disolución acuosa de metanosulfonato de amonio. Por lo tanto, un objeto de la invención es también un método de análisis como se ha definido más arriba mediante la separación por cromatografía de intercambio aniónico, en la que se utiliza una fase móvil que es transparente en la región de UV de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm. En determinadas modalidades, la separación mediante cromatografía aniónica fuerte se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 6,5. En una modalidad relacionada, se utilizará un pH en la región de aproximadamente 3. El pH puede controlarse, por ejemplo, mediante la adición de una sal a la fase móvil que posee un poder tamponador a pH = 3. En determinadas modalidades de la ¡nvención, se utiliza una sal como una sal fosfato, que tienen una capacidad tamponadora a pH 3 mayor que la de los percloratos. Las condiciones ilustrativas para la separación cromatográfica aparecen debajo: Fase Móvil: Disolvente A: NaH2PO4, 2,5 mM, que se lleva a pH 2,9 mediante la adición de H3PO4 Disolvente B: NaCIO4 en 1 N NaH2PO4 , 2,5 mM, que se lleva a pH 3,0 mediante la adición de H3PO4 El gradiente de elución puede ser el siguiente: T = 0 min: %B = 3; T = 40 min: %B = 60; T = 60 min: %B = 80 Se elige una temperatura adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 50°C, y una velocidad de flujo de la bomba de acuerdo con la columna utilizada. Otros métodos para purificar muestras mediante cromatografía SAX son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los métodos SAX están descritos por K. G. Rice y R. J. Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989); A. Larnkjaer, et al. , Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995); y en la patente internacional WO 90/01501 (Ejemplo 2). Los contenidos de estas referencias se incorporan en la presente memoria en su totalidad. Otro aspecto de la invención es un método para detectar grupos específicos que se encuentran en las heparinas sin fraccionar o en las heparinas fraccionadas. En una modalidad, este método incrementa la especificidad de la detección UV de los grupos de la heparina o de LMWH. Como todos los polisacáridos no acetilados tienen, a un pH determinado, un espectro UV prácticamente similar, es posible detectar de manera selectiva los azúcares acetilados si se toma como señal la diferencia entre la absorbancia a 2 longitudes de onda elegidas de manera tal que se anula la capacidad de absorción de los sacáridos no acetilados. Como se ilustra más abajo a modo de ejemplo, pueden elegirse 202 nm y 230 nm como longitudes de onda de detección y de referencia y se puede registrar la señal a 202-230 nm. Una persona experta en la técnica apreciará que la elección de la longitud de onda que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención dependerá del pH de la fase móvil (pueden ser necesarios ajustes de unos pocos nm para situarse en el pH óptimo). Puede utilizarse en la invención cualq uier detector de UV que pueda medir simultáneamente la absorbancia a dos o más longitudes de onda . En una modalidad de la invención , se utiliza el detector DAD 1 1 00 de la empresa Agilent Technologies. En esta modalidad , se llevará a cabo u na detección doble a 234 nm , por una parte, y a 202-230 nm , por otra parte. El principio de la detección selectiva de oligosacáridos acetilados está ilustrado en la Figura 1 en la que se compara el espectro UV de un disacárido sulfatado ?ls con el de un disacárido acetilado ?la. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es también un método de análisis como se ha definido más arriba, en el que el método de detección hace posible detectar de manera selectiva los azúcares acetilados. En determinadas modalidades, el método de análisis utiliza la separación mediante cromatografía SAX, y los azúcares acetilados se detectan de manera selectiva midiendo la diferencia entre la absorbancia a dos longitudes de onda elegidas de manera que se anula la capacidad de absorción de los sacáridos no acetilados. La cuantificación de los cuatro restos 1 ,6-anhidro descritos más arriba requiere una selectividad suficiente del sistema cromatográfico respecto a todos los demás constituyentes de la mezcla. Sin embargo, los dos disacáridos 1 y 2, que en general coeluyen, no se resuelven bien respecto a ?l la, especialmente porque el último está presente en la forma de sus dos anómeros a y ß- La identidad de los dos disacáridos 1 y 2 puede verificarse fácilmente ya que se forman en pocas horas a temperatura ambiente en una disolución acuosa de ?l Is que se lleva a pH 13 mediante la adición de NaOH. Sin embargo, sí se utiliza la detección doble, los oligosacáridos acetilados ?lVa, ?l la, ?l I la, ?la, ?l la-IVs0?,, y ?lla-I lsa?,, se identifican fácilmente. Las causas de la separación de los picos son las formas anoméricas, por una parte, y en menor medida la epimerización glucosamina <^. manosamina que está presente de manera parcial en ?lls, ?l l ls y ?ls cuando éstos están en la posición terminal de la cadena de oligosacárido. En determinadas modalidades de la invención, los disacáridos 1 y 2 se cuantifican mediante la reducción de la muestra de la heparina de bajo peso molecular, que se ha despolimerizado previamente con heparinasas, por la acción de NaBH . anómero a + anómero ß Esta reducción tiene la ventaja de eliminar los anomerismos a ^ ß mediante la apertura del anillo del oligosacárido terminal. El cromatograma obtenido es más sencillo al haberse eliminado los anomerismos. Más aún, la reducción de ?l la reduce su retención en la columna y permite un ensayo sencillo de los discáridos 1 y 2. Los ejemplos de los cromatogramas descritos en las Figuras 2 y 3 ilustran claramente estos fenómenos y las ventajas de este método.

Breve Descripción De Los Dibujos La Figura 1 ilustra la detección selectiva de los oligosacáridos acetilados en la que se compara el espectro de UV de un disacárido sulfatado ? Is con el de un disacárido acetilado ?la, en la que el eje de las x representa la longitud de onda (nm) y el eje de las y representa la absorbancia (mAmp). La Figura 2 muestra la separación cromatográfica de la enoxaparina despolimerizada con heparinasas antes y después de la reducción con NaBH4 (señal en negro tenue: UV a 234 nm; señal en negro grueso: UV a 202-234 nm), en la que el eje de las x es el tiempo de elución (min) y el eje de las y representa la absorbancia (mAmp). La Figura 3 muestra la separación cromatográfica de la heparina despolimerizada con heparinasas antes y después de la reducción con NaBH (señal en negro tenue: UV a 234 nm; señal en negro grueso: UV a 202-234 nm), en la que el eje de las x es el tiempo de elución (min) y el eje de las y representa la absorbancia (mAmp). Ejemplos Los ejemplos que aparecen más abajo pretenden ilustrar las diferentes características de la ¡nvención. Una persona experta en la técnica apreciará que la invención no está limitada a las modalidades ¡lustradas más abajo. Ejemplo 1 : Descripción General de la despolimerización Enzimática Lo que sigue es una descripción general de la forma en la que se lleva a cabo la despolimerización enzimática y de como puede utilizarse en la presente invención. La despolimerización enzimática se lleva a cabo durante 48 horas a temperatura ambiente mezclando 50 µl de una disolución que contiene 20 mg/ml de enoxaparina sódica que se va a ensayar, 200 µl de una disolución 100 mM ácido acético/NaOH a pH 7,0 que contiene 2 mM acetato calcico y 1 mg/ml de BSA con 50 µl de la disolución madre de las 3 heparinasas. Las heparinasas se almacenan a -30°C. Las heparinasas están en una disolución tamponada y la titulación de cada heparinasa es 0,5 lU/ml (composición de la disolución tamponada: disolución acuosa de pH 7 de KH2PO4 a una concentración de 0,01 mol/l y suplementada con albúmina sérica bovina (BSA) a 2 mg/ml). La reducción se lleva a cabo en 60 µl del producto despolimerizado con las heparinasas mediante la adición de 10 µl de una disolución 30 g/I de NaBH4 en 100 mM acetato sódico preparada inmediatamente antes de ser utilizada. Ejemplo 2: RMN del Disacárido 3 obtenido de acuerdo con la descripción general del Ejemplo 1 Espectro de protones en D2O, 400 MHz, T=298K, d en ppm: 3,34 (1H, dd, J = 7 y 2Hz, H2), 3,72 (1H, t, J=8Hz, H6), 3,90 (1H, m, H3), 4,03 (1H, s, H4), 4,20 (1H, d, J = 8Hz, H6), 4,23 (1H, t, J = 5Hz, H3'), 4,58 (1H, m, H2'), 4,78 (1H, m, H5), 5,50 (1H, s, H1), 5,60 (1H, dd, J=6 y 1Hz, H1'), 6,03 (1H, d, J = 5Hz, H4')]. Ejemplo 3 RMN del Trisacárido 1 obtenido de acuerdo con la descripción general del Ejemplo 1 Espectro de protones en D2O, 400 MHz, T=298K, d en ppm: 3,15 (1H, s, H2), 3,25 (1H, m, H2"), 3,60 (1H, m, H3"), entre 3,70 y 4,70 (14H, complejo sin resolver, H3/H4/H6, H27H37H47H5', H4'7H5'7H6", H2"7H3"'), 4,75 (1H, m, H5), entre 5,20 y 5,40 (2H, m, H1' y H1"), 5,45 (1H, m, H1'"), 5,56 (1H, m, H1), 5,94 (1H, d, J=5Hz, H4) Ejemplo 4 RMN del Trisacárido 1 obtenido de acuerdo con la descripción general del Ejemplo 1 Espectro en D2O, 600 MHz, (d en ppm): 3,28 (1H, m), 3,61 (1H, t, 7Hz), 3,79 (1H, t, 7Hz), 3,95 (1H, d, 6Hz), 4,00 (1H, s), 4,20 (1H, m), 4,28 (2H, m), 4,32 (1H, d, 4Hz), 4,41 (1H, s), 4,58 (1H, s), 4,61 (1H, s), 4,90 (1H, s amplio), 5,24 (1H, s), 5,45 (1H, s), 5,95 (1H, s). Ejemplo 5 RMN de ?GlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser, obtenido de acuerdo con la presente invención. Espectro en D2O, 500 MHz, (d en ppm): 3,30 (1H, t, 7Hz), 3,34 (1H, t, 8Hz), 3,55 (1H, t, 7Hz), 3,60 (1H, t, 7Hz), entre 3,63 y 3,85 (10H, m), 3,91 (2H, m), 3,96 (1H, dd, 7 y 2Hz), entre 4,02 y 4,10 (3H, m), 4,12 (1H, d, 2Hz), 4,18 (1H, m), 4,40 (1H, d, 6Hz), 4,46 (1H, d, 6Hz), 4,61 (1H, d, 6Hz), 5,29 (1H, d, 3Hz), 5,85 (1H, d, 3Hz). Ejemplo 6: Principio de la Cuantificación El contenido en 1,6-anhidro def cromatograma obtenido con la disolución reducida se determina mediante el método de porcentaje del área normalizada. El coeficiente de capacidad de absorción molar de los ácidos urónicos se toma como constante, y por consiguiente el factor de respuesta de un polisacárido es proporcional a su masa molecular. En los métodos de acuerdo con la invención, se plantea la hipótesis ampliamente aceptada de que todos los oligosacáridos insaturados contenidos en la mezcla tienen la misma capacidad de absorción molar, ig ual a 5.500 mol"1. l .cm"1. Los dos restos 1 ,6-anhid ro que coeluyen , los disacáridos 1 y 2, se integran juntos. Por lo tanto, es posible determinar el porcentaje en peso de todos los constituyentes de la mezcla despolimerizada de la heparina sin fraccionar o de la heparina fraccionada de partida, por ejemplo, los constituyentes como los derivados 1 ,6-anhidro o los derivados de azúcares acetilados. En el caso de los cuatro derivados 1 ,6-anhidro, es decir disacárido 1 , disacárido 2, disacárido 3, y tetrasacárido 1 , que corresponden a los picos 7, 8, 1 3 , y 1 9, %p/p7+8 = 100- 44^(Aiea^Area^) 2,MPx -Areax o //° P /p.3 --i>onoo ? 5M45|-AtAeare13a? % / -inn 1210 Alea"' /°P P« -100-?MP. .A». se obtuvieron los porcentajes en peso siguientes: Area7, Area8, Area13 y Area19 corresponden a las áreas de cada uno de los picos 7, 8 , 1 3, y 1 9. Las masas molares de cada uno de estos 4 compuestos son 443, 443, 545 y 1 .21 0 respectivamente.

^M?x -Areax corresponde a la proporción del área de cada pico del cromatograma respecto a la masa molar del producto correspondiente. Si Mp es la masa media de la heparina de bajo peso molecular estudiada, el porcentaje de las cadenas de oligosacárido que terminan con un anillo 1 ,6-anhidro se obtiene de la manera siguiente: De manera similar, puede determinarse el porcentaje en peso de otros componentes de una muestra de material elegido de heparinas sin fraccionar y heparinas fraccionadas. La masa molecular exacta se atribuye a todos los picos identificados de los cromatogramas (véase la Tabla 1 ): Tabla 1 Lo que sigue es la nomenclatura de los sacáridos que se corresponden con los números de los picos de las Figuras 2 y 3 1 : ?GIcAß1 -3 Gal ß1 -3 Galß1-4 Xyl ß1 -O-Ser 2: sal sódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 ?4)-2-deoxi-2-acetamido-a-D-glucopiranosil 3: ?GIcAß1 -3 Gal ß1-3 Galß1-4 Xyl ß^O-CHs-COOH 4: sal disódica del ácido 4-deoxi-a-L-freo-hex-4-enegalactopiranosilurónico-(1 ?-4)-2-deoxi-2-sulfamido-ß-D-glucopiranosa 5: sal sódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico- (1 -»4)-2-deoxi-2-sulfamido-a-D-glucopiranosil 6: sal disódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico- (1?4)-2-deoxi-2-acetamido-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil 7: sal disódica del ácido 4-deoxi-a-L-rreo-hex-4- enepiranosilurónico-(1 — »4)-1 ,6-anhidro-2-deoxi-2-sulfamido- ß-D-glucopiranosa (disacárido 1 ) 8: sal disódica del ácido 4-deoxi- -L-freo-hex-4- enepiranosilurónico-(1 ?-4)-1 ,6-anhidro-2-deoxi-2-sulfamido- ß-D-manopiranosa (disacárido 2) 9: sal disódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex- enepiranos¡lurónico-(1 -»4)-2-deoxi-2-acetamido-a-D-gIucopiranosil : sal trisódica del ácido 4-deoxi-a-L-freo-hex-4-enegalactopiranosilurónico-(1 —>4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-ß-D-glucopiranosa 1 1 : sal trisódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosiIurónico-(1 ->4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-ß-D-glucopiranosil 12: sal trisódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-enepiranos¡lurón¡co-(1 ?4)-2-deoxi-2-sulfamido-a-D-glucopiranosil 13: sal trisódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-freo-hex-4-enepiranosilurónico-(1 ->4)-1 ,6-anhidro-2-deoxi-2-sulfamido-ß-D-glucopiranosa (Disacárido 3) 14: sal trisódica del ácido 4-2-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 - 4)-2-deoxi-2-acetamido-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil 15: sal pentasódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 ->4)-2-deoxi-2-acetamido~6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1 ~ 4)-ß-ácido D-glucopiranosilurónico-(1 ?^4)-2- deoxi-2-sulfamido-3-O-sulfo-a-D-glucopiranosil) 16: sal tetrasódica del ácido 4-2-O-sulfo-a-L-treo-hex- enepiranosilurónico-(1 ?4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-a-D- glucopiranosil 17: sal hexasódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex- en epi ranos ilu ron ico-(1 — »4)-2-deoxi-2-aceta mido-6-O-su lío- ce- D-g I ucop ira nosi!-(1 ?4)-ácido ß-D-glucopiranosilurónico-(1 ->4)-2- deoxi-2-sulfamido-3,6-di-O-sulfo-a-D-glucopiranosil) 18: sal hexasódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex- enepiranosilurónico-(1 -?4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-D-glucopiranosil-(1 ?4)-2-O-sulfo-ácido a-L-idopiranosi I urónico 19: sal hexasódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-enep¡ranosilurónico-(1 ?4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1 - 4)-2-O-sulfo-ácido -L-idopiranosilurónico-(1 -?4)-1 ,6-anhidro-2-deoxi-sulfamido-ß-D-manopiranose (tetrasacárido 1 ) : sal sódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico- (1 - 4)-2-deoxi-2-acetamido-a-D-glucitol 21 : sal disódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico- (1 ?-4)-2-deoxi-2-sulfamido-ß-D-glucitol 22: sal disódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 -?4)-2-deoxi-2-sulfamido-a-D-gIucitol 23: sal disódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1- 4)-2-deoxi-2-acetamido-6-O-sulfo- -D-glucitol 24: sal disódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 -^4)-2-deoxi-2-acetamido- -D-glucitol : sal trisódica del ácido 4-deoxi- -L-treo-hex- enegalactopiranosilurónico-(1 - 4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo- ß-D-glucítol 26: sal trisódica del ácido 4-deoxi- -L-treo-hex- enepiranosilu ron ico-(1 ?4) -2 -deoxi-2-sulfa mid o-6-O-sulfo-a-D-glucitol 27: sal trisódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo- -L-treo-hex- enepiranosiIurónico-(1 — »4)-2-deoxi-2-sulfamido-a-D-glucitol 28: sal trisódica del ácido 4-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex- enepiranosilurónico-(1 ?4)-2-deoxi-2-acetamido-6-O-sulfo-a-D- glucitol 29: sal pentasódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-en ep i ranos Muró nico-(1 ?4)-2-deoxi-2-acetamido-6-O-su lío-ce- D-g I ucop i ranos i l-(1 —»4)-ácido ß-D-glucopiranosilurónico-(1 - 4)-2-deoxi-2-sulfamido-3-O-sulfo-a-D-glucitol) 30: sal trisódica del ácido 4-2-deoxi-2-O-sulfo-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 ?4)-2-deoxi-2-sulfam¡do6-O-sulfo-a-D-gluc¡tol 31 : sal hexasódica del ácido 4-deoxi-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 ?-4)-2-deoxi-2-acetamido-6-O-sulfo-a-D-glucopiranosil-(1 - 4)-ácido ß-D-glucopiranosilurónico-(1-»4)-2-deoxi-2-sulfamido-3,6-di-O-sulfo-a-D-glucitol) 32: sal hexasódica del ácido 4-deoxi-2-O-suIfo-a-L-treo-hex-enepiranosilurónico-(1 ?-4)-2-deoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-D-glucopiranosil-a(1 -^4)-2-O-sulfo-ácido a-L-idopiranosil urónico (forma reducida con NaBH ). Abreviaturas Utilizadas: IdoA: ácido a-L-Idopiranosilurónico; GlcA: ácido ß-D-GIucopiranosilurónico; ?GIcA: ácido 4,5-insaturado: ácido 4-deoxi-a-L-rreo-hex-enepiranosilurónico; Gal: D-Galactosa; Xyl: xilosa; GIcNAc: 2-deoxi-2-acetamido-a-D-glucopiranosa; GIcNS: 2-deoxi-2-sulfamido-a-D-glucopíranosa; 2S: 2-O-sulfato, 3S: 3-O-sulfato, 6S: 6-O-sulfato. La presente invención puede englobarse en otras formas específicas sin alejarse de su espíritu o de sus atributos esenciales.

Claims (49)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para cuantificar la cantidad de componentes de una muestra de un material seleccionado de heparinas sin fraccionar y de heparinas fraccionadas, que comprende: (a) despolimerizar la muestra mencionada mediante un método enzímático; y (b) detectar la cantidad de los componentes de la muestra despolimerizada de la etapa (a) mediante cromatografía líquida de alta resolución.
2. 2. El método según la reivindicación 1 , en donde el método enzimático se lleva a cabo utilizando al menos una heparinasa.
3. 3. El método según la reivindicación 1 , en donde el método enzimático se lleva a cabo utilizando una mezcla de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.) , heparinasa 2 (heparina liasa I I), y heparinasa 3 (EC 4.2.2.8.).
4. 4. El método según la reivindicación 1 , en donde la heparina fraccionada es enoxaparina sódica.
5. 5. El método según la reivindicación 1 , en donde la cromatografía líquida de alta resolución utilizada en la etapa (b) es cromatografía de intercambio aniónico.
6. 6. El método según la reivindicación 1 , en donde la cromatografía líquida de alta resolución utilizada en la etapa (b) es cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX).
7. 7. El método según la reivindicación 6, en donde la cromatografía de intercambio aniónico fuerte se lleva a cabo utilizando una columna Spherisorb® SAX.
8. 8. El método definido en la reivindicación 1 , en donde la cromatografía líquida de alta resolución se lleva a cabo en una fase móvil que es transparente a la luz UV con longitudes de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm.
9. 9. El método según la reivindicación 1 , en donde la cromatografía líquida de alta resolución se lleva a cabo en una fase móvil que comprende al menos una sal elegida de perclorato sódico, sales metanosulfonato, y sales fosfato.
10. 10. El método según la reivindicación 1 , en donde la cromatografía líquida de alta resolución se lleva a cabo en una fase móvil que comprende sales de perclorato sódico.
11. 1 1 . El método según la reivindicación 6, en donde la cromatografía de intercambio aniónico fuerte se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 6.5.
12. 12. El método según la reivindicación 6, en donde la cromatografía de intercambio aniónico fuerte se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 3.
13. 13. El método según la reivindicación 1 , en donde la fase móvil comprende una disolución de perclorato sódico que se mantiene a un pH de aproximadamente 3.0.
14. 14. El método según la reivindicación 1 , en donde la muestra despolimerizada comprende al menos una cadena de oligosacárido seleccionada de una cualquiera de las siguientes trisacárido 1 disacárido 2 disacárido 1 disacárido 3 tetrasacárido 1 ;y
15. 15. El método según la reivindicación 1 , en donde la muestra despolimerizada comprende al menos una cadena de oligosacárido cuyo extremo está modificado con un enlace 1 ,6-anhidro.
16. 16. El método según la reivindicación 15, en donde la al menos una cadena de oligosacárido se elige de cualquiera de las siguientes
17. 17. El método según la reivindicación 4, en donde la muestra despolimerizada comprende al menos un resto 1,6-anhidro elegido de cualquiera de los siguientes:
18. 18. El método según la reivindicación 17, en donde el al menos un resto 1,6-anhidro varía entre 15% a 25% del peso molecular promedio en peso de la muestra.
19. 19. El método según la reivindicación 1, en donde los componentes detectados en la muestra despolimerizada de la etapa (b) son azúcares acetilados.
20. 20. El método seg ún la reivindicación 1 9, en donde los azúcares acetilados se detectan de manera selectiva restando una absorbancia medida a una longitud de onda a la que absorben tanto los azúcares acetilados como los no acetilados de una absorbancia medida a u na longitud de onda a la que absorben los azúcares acetilados pero no los no acetilados.
21. 21 . El método según la reivindicación 1 9, en donde los azúcares acetilados detectados se seleccionan de los oligosacáridos acetilados ?lVa, ?l la, ?l I la, ?la, ?l la-IVsgin,_v_?l la-l lsg?,?.
22. 22. Un método para cuantificar la cantidad de restos 1 ,6-anhidro de una muestra de enoxaparina sódica, q ue comprende: (a) despolimerizar la muestra mencionada utilizando una mezcla de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.) , heparinasa 2 (heparina liasa I I) , y heparinasa 3 (EC 4.2.2.8.) ; y (b) detectar la cantidad de los restos 1 ,6-anhid ro de la muestra despolimerizada de la etapa (a) mediante cromatografía líquida de alta resolución.
23. 23. U n método según la reivindicación 22, en donde la cantidad de los restos 1 ,6-anhidro varía entre 15% a 25% dei peso molecular medio de los oligosacáridos de la muestra.
24. 24. U n método para cuantificar la cantidad de componentes de una muestra de un material elegido de heparinas sin fraccionar y de heparinas fraccionadas, que comprende: (a) despolimerizar la muestra mencionada mediante un método enzimático; y (b) reducir la muestra despolimerizada de la etapa (a); (c) detectar la cantidad de los componentes de la muestra reducida de (b) mediante cromatografía líquida de alta resolución.
25. 25. El método según la reivindicación 24, en donde el método enzimático se lleva a cabo utilizando al menos una heparinasa.
26. 26. El método según la reivindicación 24, en donde el método enzimático se lleva a cabo utilizando una mezcla de heparínasa 1 (EC 4.2.2.7.), heparinasa 2 (heparina liasa I I), y heparinasa 3 (EC 4.2.2.8.) .
27. 27. El método según la reivindicación 24, en donde la reducción de la muestra despolimerizada de la etapa (a) se lleva a cabo mediante la exposición a un agente reductor.
28. 28. El método según la reivindicación 27, en donde el agente reductor es NaBH4 o una sal de un metal alcalino del anión borohidruro.
29. 29. El método según la reivindicación 24, en donde la heparina fraccionada es enoxaparina sódica.
30. 30. El método según la reivindicación 27, en donde la reducción reduce los extremos reductores de la enoxaparina sódica que no están en la forma 1 ,6-anhidro.
31. 31. El método según la reivindicación 24, en donde la cromatografía líquida de alta resolución utilizada en la etapa (c) es cromatografía de intercambio aniónico.
32. 32. El método seg ún la reivindicación 24, en donde la cromatografía líquida de alta resolución utilizada en la etapa (c) es cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAX).
33. 33. El método según la reivindicación 32, en donde la cromatografía de intercambio aniónico fuerte se lleva a cabo utilizando una columna Spherisorb® SAX.
34. 34. El método definido en la reivindicación 24, en donde la cromatografía líquida de alta resolución se lleva a cabo en una fase móvil q ue es transparente a la luz UV con longitudes de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm .
35. 35. El método según la reivindicación 24, en donde la cromatografía líq uida de alta resolución se lleva a cabo en una fase móvil que comprende al menos u na sal elegida de perclorato sódico, sales metanosulfonato, y sales fosfato.
36. 36. El método seg ún la reivindicación 24, en donde la cromatografía líquida de alta resolución se lleva a cabo en una fase móvil que comprende sales perclorato sódico.
37. 37. El método seg ún la reivindicación 32, en donde la cromatografía de intercambio aniónico fueríe se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 6.5.
38. 38. El método según la reivindicación 32, en donde la cromatografía de intercambio aniónico fuerte se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 3.
39. 39. El método según la reivindicación 24, en donde la cromatografía líquida de alta resolución utiliza una fase móvil que comprende una disolución de perclorato sódico que se mantiene a un pH de aproximadamente 3.0.
40. 40. El método según la reivindicación 28, en donde la muestra despolimerizada comprende al menos una cadena de oligosacárido seleccionada de cualquiera de las siguientes: trisacárido 1 en donde la cadena de oligosacárido está en su forma reducida.
41. 41 . El método según la reivindicación 24, en donde la muestra despolimerizada comprende al menos una cadena de oligosacárido cuyo extremo está modificado con un enlace 1 ,6-anhidro.
42. 42. El método según la reivindicación 41 , en donde la al menos una cadena de oligosacárido se elige de cualquiera de las siguientes:
43. 43. El método según la reivindicación 29, en donde la muestra despolimerizada comprende una mezcla de restos 1 ,6-anhidro que comprende:
44. 44. El método según la reivindicación 43, en donde la mezcla de restos 1 ,6-an hidro varía entre 1 5% a 25% del peso molecular promedio en peso de la muestra.
45. 45. El método según la reivindicación 24, en donde los componentes detectados en la muestra despolimerizada de la etapa (b) son azúcares acetilados.
46. 46. El método según la reivindicación 45, en donde los azúcares se detectan de manera selectiva restando una absorbancia medida a una longitud de onda a la que absorben tanto los azúcares acetilados como los no acetilados de una absorbancia medida a una longitud de onda a la que absorben los azúcares acetilados pero no los no acetilados.
47. 47. El método según la reivindicación 45, en donde los azúcares acetllados detectados se seleccionan de los oligosacáridos acetilados ?lVa, ?l la, ?l l la, ?la, ?lla-IVs0?,?, y ?Ha-l lsgn,.
48. 48. Un método para cuantificar la cantidad de restos 1 ,6-anhidro de una muestra de enoxaparina sódica, que comprende: (a) despolimerizar la muestra mencionada utilizando una mezcla de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.), heparinasa 2 (heparina liasa I I), y heparinasa 3 (EC 4.2.2.8.); (b) reducir la muestra despolimerizada de la etapa (a); y (c) detectar la cantidad de restos 1 ,6-anhidro en la muestra reducida de la etapa (b) mediante cromatografía líquida de alta resolución.
49. 49. Un método según la reivindicación 48, en donde la cantidad de restos 1 ,6-anhidro varía entre 15% a 25% del peso molecular promedio en peso de la muestra.