CN112730705A - 一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学生物检测技术领域，涉及一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法。通过提供一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测人体血清、血浆或尿液中的HS含量，根据不同类型MPS患者血清和尿液中HS积累的含量不同，通过准确定量生物样本中HS含量而诊断出患者疾病的进程生物标志物，该方法专属性强，灵敏度高，生物样本前处理方法简单，且分析时间短，效率得到提高，更加容易实现自动化，便于医学临床推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，属于医学生物检测技术领域。
背景技术
黏多醣贮积症(mucopolysaccharidoses,MPS)是一种复杂的溶酶体储存疾病。研究表明，几乎所有的MPS都是由常染色体遗传缺失从而导致缺乏参与糖胺聚糖分解的溶酶体酶，致使溶酶体在体内大量积累。到目前为止，已经发现11种酶缺失导致组织、血液和尿液中多种黏多醣堆积，包括硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、硫酸角质素、硫酸软骨素和透明质酸，积累的黏多糖会对患者的生理和神经产生严重影响。不同类型的MPS堆积的黏多糖种类不同，在MPSⅠ、MPSⅡ、MPSⅢA、MPSⅢB、MPSⅢC和MPSⅢD都可导致HS的积累。同时，不同类型MPS患者血清和尿液中HS积累的含量不同，通过准确定量生物样本中HS含量而诊断出患者疾病的进程，对指导临床采取相应的治疗手段具有重要的指导意义。
在授权公共号为CN109596742A的一篇中国专利中，记载了一种检测硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的方法，旨在提供一种检测方法简单，特异性强，准确度高，重复性好的硫酸乙酰肝素成品中主要成分含量的检测方法。其方案是这样的：1)采用DS酶将硫酸乙酰肝素成品中的硫酸皮肤素降解为DS双糖的溶液；2)制备不同浓度梯度的DS标准品溶液，分别经过DS酶酶解后再分别取样注入高效液相色谱仪中检测各个梯度的DS的双糖峰面积，绘制DS工作曲线；3)用高效液相色谱方法检测步骤1)降解后样品溶液中DS双糖，并且计算DS含量；4)用高效液相色谱方法检测DS+HS的峰面积，计算DS+HS的含量；5)计算HS含量。
目前，市场上类似的检测方法较常见，但是这样的检测方法灵敏度低、样品前处理复杂，无法满足临床检测的高通量和快速检测需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，它解决了现有技术中检测方法灵敏度低、样品前处理复杂，无法满足临床检测的高通量和快速检测需求的问题。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，包括以下步骤：
步骤S1：标准溶液的配制
S1.1标准曲线的配制：用十万分之一的分析天平精密称取HS标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解，配制得到标准品准备溶液，使用50％甲醇水溶液稀释标准品储备溶液得到标准品工作溶液，随即再用50％甲醇水溶液稀释标准品工作溶液得到标准曲线，使其浓度范围为：0.01-40μg/mL；
S1.2质控品的配制：用十万分之一的分析天平精密称取HS标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解，配制得到质控品储备溶液，用50％甲醇水溶液稀释质控储备溶液，分别配制得到低浓度、中浓度和高浓度三个浓度水平的质控工作溶液；取多份正常人空白基质生物样本混合，制得混合QC，用混合QC溶液稀释低中高质控工作溶液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)和高浓度质控品(HQC)，其中，低浓度水平为标准曲线范围低浓度点2倍，中浓度水平为标准曲线范围中间点浓度，高浓度水平为标准曲线范围高浓度点70％；
步骤S2：标准曲线、质控样本、待检测样本的衍生化处理
S2.1用移液枪取步骤a的标准曲线各浓度点、步骤b中质控品和待测样本各体积为10μL于1.8mL棕色进样小瓶中；
S2.2使用氮吹仪，将进样小瓶中的溶液在40℃的条件下吹干；
S2.3用移液枪先加50μL2,2-二甲基丙烷，再加1000μL3M盐酸甲醇溶液于各进样小瓶中，振荡30s混合均匀；
S2.4将各进样小瓶放入预设好温度为65℃的控温箱中，加热反应2h；
S2.5使用氮吹仪，在40℃的条件下将样品吹干；
S2.6用移液枪分别吸取500μL 0.1％甲酸水溶液于各进样小瓶中，振荡30s以上复溶充分，在离心速度为18000g下离心20min，移取上清液进行质谱分析；
步骤S3：待测样品的检测
S3.1使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪对S2中处理后的标准曲线、质控样本和待检测样本进行检测，使用外标法计算样本浓度值，即以标准品的浓度点为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标拟合得到标准曲线及线性方程，通过将待测样本中的峰面积代入方程计算得到HS的浓度。
作为优选实施例：所述步骤S1中的生物样本包括人血清、血浆和尿液。
作为优选实施例：所述步骤S2中的标准曲线浓度范围至少5个浓度点。
作为优选实施例：所述步骤S2中3M盐酸甲醇溶液是由浓盐酸用甲醇稀释4倍得到。
作为优选实施例：所述质控品配制中，生物空白样本加标浓度如下表。
| 分析物 | LQCμg/mL | MQCμg/mL | HQCμg/mL |
| HS | 0.05-1 | 1-10 | 10-30 |
作为优选实施例：所述步骤S3中的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱以所使用的分析色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T32.1*100mm，柱温为40℃，进样体积2～10μL。
作为优选实施例：所述分析色谱柱的流动相为含0.1％甲酸水溶液和含0.1％甲酸乙腈溶液，流速为0.4mL/min，液相采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B比列变化如下表。
| Time(min) | A％ | B％ |
| 0 | 98 | 2 |
| 0.5 | 98 | 2 |
| 2 | 70 | 30 |
| 3 | 0 | 100 |
| 4 | 0 | 100 |
| 4.5 | 98 | 2 |
| 6.5 | 98 | 2 |
作为优选实施例：所述质谱采集条件:离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：1.5～3.0KV；去溶剂温度400-500℃；去溶剂气800-1000L/Hr；检测方式：正离子检测。
作为优选实施例：所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多重反应监测(MRM)扫描模式，具体的离子对如下表。
| 分析物 | 离子对 | 碰撞能量(v) |
| HS | 384.2→162.1 | 14 |
本发明的有益效果是：
本发明能检测血清、血浆或尿液中HS含量，方法专属性强，灵敏度高，生物样本前处理方法简单，分析时间短，效率得到提高，更加容易实现自动化，便于医学临床推广使用。
附图说明
图1为本发明的总色谱示意图；
图2为本发明的硫酸乙酰肝素色谱图；
图3为本发明的标准曲线；
图4为本发明的检出限色谱图；
图5为本发明的定量限色谱图。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
一、配制过程
(一)、准溶液的配制
(a)、标准曲线的配制
十万分之一的分析天平精密称取HS标准品4.00mg于1.8mL进样小瓶中，用移液枪准确吸取1mL50％甲醇水溶液溶解，得到标准储备液，浓度为4.00mg/mL，再用50％甲醇水溶液稀释标准储备液得到标准工作溶液，其浓度为80μg/mL。
取50μL的标准工作溶液用50％甲醇水溶液依照如下方式逐级稀释：1/2、1/10、1/4、1/10、1/10，共得到5个浓度的标准曲线点，具体值如下：
| μg/mL | STD1 | STD2 | STD3 | STD4 | STD5 |
| HS | 0.01 | 0.1 | 1 | 4 | 40 |
(b)、质控品的配制
十万分之一的分析天平精密称取HS标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解，配制得到质控品储备溶液。用50％甲醇水溶液稀释质控储备溶液，分别配制得到低浓度、中浓度和高浓度三个浓度水平的质控工作溶液。
取多份正常人空白基质生物样本混合，制得混合QC，用混合QC溶液稀释低中高质控工作溶液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)和高浓度质控品(HQC)，其中，低浓度水平为标准曲线范围低浓度点2倍，中浓度水平为标准曲线范围中间点浓度，高浓度水平为标准曲线范围高浓度点70％。具体加入浓度如下表：
| 分析物 | LQCμg/mL | MQCμg/mL | HQCμg/mL |
| HS | 0.05 | 4 | 30 |
(二)、标准曲线\质控样本\待检测样品的衍生化处理
移液枪移取步骤(a)的标准曲线各浓度点(5个)、空白试剂(50％甲醇水溶液)、步骤(b)的低中高质控品和待测样本，各体积为10μL于1.8mL棕色进样小瓶中。
使用氮吹仪，在40℃条件下吹干。
用移液枪先加50μL2,2-二甲基丙烷，再加1000μL3 M盐酸甲醇溶液于各进样小瓶中，振荡30s混合均匀。
将各进样小瓶放入预设好温度为65℃的控温烘箱中，加热反应2h。
使用氮吹仪，在40℃条件下将样品吹干。
用移液枪分别吸取500μL0.1％甲酸水溶液于各进样小瓶中，振荡30s以上复溶充分，在离心速度为18000g下离心20min，移取上清液进行质谱分析。
(三)、质控样品、待检测样品的计算
衍生处理得到的标准曲线点、质控样本和待测样本，使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪进行检测，得到HS在各个样本中峰面积。绘制外表法曲线，即以标准品的浓度点为横坐标x，以对应的峰面积为纵坐标y，进行线性回归，拟合得到标准曲线方程y＝a*x+b，将各个样本峰面积代入曲线方程，计算得到各HS的浓度。
所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测参数如下
所述质谱检测的多重反应监测参数如下：
| 化合物 | Q1 | Q3 | Cone(v) | CE(v) |
| HS | 384.2 | 162.1 | 25 | 14 |
所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪的流动相梯度洗脱程序参数如下表：
| Time(min) | Flow(mL/min) | A％ | B％ |
| 0 | 0.4 | 98 | 2 |
| 0.5 | 0.4 | 98 | 2 |
| 2 | 0.4 | 70 | 30 |
| 3 | 0.4 | 0 | 100 |
| 4 | 0.4 | 0 | 100 |
| 4.5 | 0.4 | 98 | 2 |
| 6.5 | 0.4 | 98 | 2 |
二、方法学验证结果
(一)、该方法的线性范围和检出限定量限：如下表所示，该方法监测硫酸乙酰肝素在10ng/mL-40000ng/mL范围内线性关系良好(r2>0.999),检出限为10ng/mL，定量限为40ng/mL。
线性范围及检出定量限
| 化合物 | 线性方程 | 相关系数 | 检出限 | 定量限 |
| HS | y＝11.7118*x+2.0855 | 0.9993 | 10ng/mL | 40ng/mL |
(二)、该方法的精密度
按质控品的配制方法配制低、中、高3种浓度质控样本进行精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3次，精密度如下：
(三)、该方法的精回收率
按质控品的配制方法配制低、中、高3种浓度质控样本进行回收率实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3次，回收率如下：
综合上述验证结果可知，本发明的监测方法准确、快速、灵敏度高、专属性强、前处理操作简易，为检测生物样本中的糖类物质提供了一种新的检测方法。本方法适合于检测大部分体液类生物样本。本发明的检测方法可以准确地了解生物样本中标志物的浓度水平，进而可以为黏多醣贮积症疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：标准溶液的配制
S1.1标准曲线的配制：用十万分之一的分析天平精密称取HS标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解，配制得到标准品准备溶液，使用50％甲醇水溶液稀释标准品储备溶液得到标准品工作溶液，随即再用50％甲醇水溶液稀释标准品工作溶液得到标准曲线，使其浓度范围为：0.01-40μg/mL；
S1.2质控品的配制：用十万分之一的分析天平精密称取HS标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解，配制得到质控品储备溶液，用50％甲醇水溶液稀释质控储备溶液，分别配制得到低浓度、中浓度和高浓度三个浓度水平的质控工作溶液；取多份正常人空白基质生物样本混合，制得混合QC，用混合QC溶液稀释低中高质控工作溶液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)和高浓度质控品(HQC)，其中，低浓度水平为标准曲线范围低浓度点2倍，中浓度水平为标准曲线范围中间点浓度，高浓度水平为标准曲线范围高浓度点70％；
步骤S2：标准曲线、质控样本、待检测样本的衍生化处理
S2.1用移液枪取步骤a的标准曲线各浓度点、步骤b中质控品和待测样本各体积为10μL于1.8mL棕色进样小瓶中；
S2.2使用氮吹仪，将进样小瓶中的溶液在40℃的条件下吹干；
S2.3用移液枪先加50μL2,2-二甲基丙烷，再加1000μL3M盐酸甲醇溶液于各进样小瓶中，振荡30s混合均匀；
S2.4将各进样小瓶放入预设好温度为65℃的控温箱中，加热反应2h；
S2.5使用氮吹仪，在40℃的条件下将样品吹干；
S2.6用移液枪分别吸取500μL 0.1％甲酸水溶液于各进样小瓶中，振荡30s以上复溶充分，在离心速度为18000g下离心20min，移取上清液进行质谱分析；
步骤S3：待测样品的检测
S3.1使用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪对S2中处理后的标准曲线、质控样本和待检测样本进行检测，使用外标法计算样本浓度值，即以标准品的浓度点为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标拟合得到标准曲线及线性方程，通过将待测样本中的峰面积代入方程计算得到HS的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤S1中的生物样本包括人血清、血浆和尿液。
3.根据权利要求1所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤S2中的标准曲线浓度范围至少5个浓度点。
4.根据权利要求1所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤S2中3M盐酸甲醇溶液是由浓盐酸用甲醇稀释4倍得到。
5.根据权利要求1所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤S1质控品配制中，生物空白样本加标浓度如下表。
6.根据权利要求1所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述步骤S3中的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱以所使用的分析色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T32.1*100mm，柱温为40℃，进样体积2～10μL。
7.根据权利要求6所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述分析色谱柱的流动相为含0.1％甲酸水溶液和含0.1％甲酸乙腈溶液，流速为0.4mL/min，液相采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B比列变化如下表。
8.根据权利要求6所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述质谱采集条件:离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：1.5～3.0KV；去溶剂温度400-500℃；去溶剂气800-1000L/Hr；检测方式：正离子检测。
9.根据权利要求7所述的一种液相色谱三重四极杆串联质谱检测生物标志物的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多重反应监测(MRM)扫描模式，具体的离子对如下表。
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Cited By (1)
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| CN114858932A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-08-05 | 昆明和合医学检验所有限公司 | 高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法 |
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