CN114858932B - 高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法 - Google Patents
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Abstract
液相色谱串联质谱法检测干血滤纸片中神经酸含量：通过甲醇/乙腈（体积1∶1）对神经酸未知样本进行恒温振荡萃取，离心后取上清进行氮吹复溶，通过液相色谱对神经酸进行分离，APCI离子化，三重四级杆质谱分析对神经酸特征离子峰367.3/349.45进行定量分析，以标准品浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标绘制标准曲线，从而计算出待测样本中神经酸的含量；该检测方法所需样本量少、灵敏度高、特异性强、重现性好、能显著缩短检测时间，可为临床诊断提供可靠依据。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法。
背景技术
神经酸(NA)是一种超长链单不饱和脂肪酸,由于早期发现于哺乳动物的神经组织，故命名为神经酸。神经酸在脑和神经组织含量较高，是大脑神经纤维和神经细胞的核心天然成分。前期研究表明其有促进婴儿大脑髓鞘发育的功能。神经酸的缺乏将会引起脑中风后遗症、老年痴呆、脑瘫、脑萎缩、记忆力减退、失眠健忘等脑疾病。除此之外，根据最新的研究表明，由于神经酸是唯一可以修复神经髓鞘的物质，这使得许多药物所无法达到的功效，都可以通过神经酸来进行弥补和修复，其中诸如失眠，健忘，注意力不集中等问题，往往都和神经髓鞘的脱落有关，而神经酸可以将其修复。
目前，神经酸在人体中含量的检测，主要为衍生化法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱串联质谱法(血清)，其均存在耗时长、成本高、灵敏度低、稳定性差等问题，导致检测结果可信度不高。本文旨在建立一种高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法检测干血滤纸片中神经酸含量，目前，虽然报道LC-MS/MS检测神经酸含量，但样本类型主要为血清，前处理方法主要为蛋白沉淀、衍生化等，而本研究建立的样本类型是干血滤纸片，更加便于样本的采集、保存及运输；采血所需耗材成本低，所需采血量较少。其次，目前报道所采用的前处理方法成本高、耗时长，本发明方法所采用的前处理方法简单、便捷、耗时短。同时，本发明所采用的离子源是APCI源，很大程度上降低基质对目标分析物的干扰，实现高特异性、高灵敏度分析；其次，流动相、色谱柱与现有发明相比，具有较大差异，属于完全不同的分析方法；最后，本发明方法可在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围保持良好线性，相关系数R2＝0.998635，实现较宽的线性范围，又保证较高的灵敏度，能够对待测物神经酸含量进行准确定量，为临床诊断及疾病预防和治疗提供参考。
发明内容
本发明目的是建立一种高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法检测干血滤纸片中神经酸含量，且前处理简单，便捷，灵敏度高，能够对待测物神经酸含量进行准确定量，为临床诊断及疾病预防和治疗提供参考和精准治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本研究建立的样本类型是干血滤纸片，更加便于样本的采集、保存及运输；采血所需耗材成本低，所需采血量较少。其次，目前报道所采用的前处理方法成本高、耗时长，本发明方法所采用的前处理方法简单、便捷、耗时短。同时，本发明所采用的离子源是APCI源，很大程度上降低基质对目标分析物的干扰，实现高特异性、高灵敏度分析；其次，流动相、色谱柱与现有发明相比，具有较大差异，属于完全不同的分析方法；最后，本发明方法可在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围保持良好线性，相关系数R2＝0.998635，实现较宽的线性范围，又保证较高的灵敏度为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：标准溶液配制：精确称量神经酸标准品5mg于10mL容量瓶中，纯甲醇定溶，得到标准母液A1(浓度500ug/mL)，用600ul离心管进行分装，每管分装体积400ul，-80℃保存，有效期至少6个月。
S2：生物样本处理：直径3mm打孔器取样2个DBS血斑，置于96孔板中，每孔加入200μL 的甲醇/乙腈(容积1∶1)萃取溶剂；37℃密封孵育震荡20min，4000转/min离心5min，取上清40℃加热氮气吹干，100μL甲醇复溶，铝箔覆盖，混匀1min→离心5min后进行 LC-MS/MS分析。
S3：绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
S4：计算浓度：取步骤S2中所处理好的生物样本进行LC-MS/MS分析，用步骤S3中的标准曲线进行定量(如附图1所示，神经酸含量在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围内线性良好，线性方程：(18778.6)X+0.467，R2＝0.998635)，从而计算出待测样本中神经酸的含量；
作为优选，
S1中，标准品工作液为含有神经酸储备液A1，经过步骤S1中所述储备液A1稀释成0.078125ug/mL、0.3125ug/mL、1.25ug/mL、5.0ug/mL、20.0ug/mL、40.0ug/mL浓度的神经酸标准工作液，稀释液为甲醇(色谱纯)；
作为优选，
S2中，所述生物样本是采集患者足跟血或指尖血制成干血点；
作为优选，S4中，所涉及的色谱条件如下，色谱图如附图2，附图3：
| 色谱柱 | Waters HSS T3 1.8μm2.1*50mm |
| 柱温 | 30℃ |
| 进样量 | 5uL |
| 分析时间 | 5min |
质谱条件如下：离子源模式为:APCI(+)模式；接口温度：300℃，DL温度:250℃，加热块温度：400℃；雾化气流速：3L/min；加热气流速：10L/min；干燥器流量：10L/min；
作为优选，本发明方法采用液相色谱串联质谱法检测干血滤纸片中神经酸含量，具有较好的精确度、准确度及较宽的线性范围，目前神经酸测定的样本类型主要为血清，前处理方法主要为蛋白沉淀、衍生化等，而本研究建立的样本类型是干血滤纸片，更加便于样本的采集、保存及运输；采血所需耗材成本低，所需采血量较少。其次，目前报道所采用的前处理方法成本高、耗时长，本发明方法所采用的前处理方法简单、便捷、耗时短。同时，本发明所采用的离子源是APCI源，很大程度上降低基质对目标分析物的干扰，实现高特异性、高灵敏度分析；其次，流动相、色谱柱与现有发明相比，具有较大差异，属于完全不同的分析方法；最后，本发明方法可在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围保持良好线性，相关系数R2＝0.998635，实现较宽的线性范围，又保证较高的灵敏度。
附图说明
图1是本发明的神经酸标准曲线；
图2是本发明的神经酸标准品色谱图；
图3是本发明的神经酸供试品色谱图；
图4是本发明的空白对照色谱图；
图5是本发明神经酸加标色谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1：标准溶液配制：精确称量神经酸标准品5mg于10mL容量瓶中，纯甲醇定溶，得到标准母液A1(浓度500ug/mL)，并稀释成0.078125ug/mL、0.3125ug/mL、1.25ug/mL、5.0ug/mL、 20.0ug/mL、40.0ug/mL浓度的神经酸标准工作液，稀释液为甲醇(色谱纯)；
2：生物样本处理：直径3mm打孔器取样2个DBS血斑，置于96孔板中，每孔加入200μL的甲醇/乙腈(容积1∶1)萃取溶剂；37℃密封孵育震荡20min，4000转/min离心5min，取上清40℃加热氮气吹干，100μL甲醇复溶，铝箔覆盖，混匀1min→离心5min后进行 LC-MS/MS分析。
所涉及的色谱条件如下，色谱图如附图1，附图2：
| 色谱柱 | Waters HSS T3 1.8μm2.1*50mm |
| 柱温 | 30℃ |
| 进样量 | 5uL |
| 分析时间 | 5min |
质谱条件如下：离子源模式为:APCI(+)模式；接口温度：300℃，DL温度:250℃，加热块温度：400℃；雾化气流速：3L/min；加热气流速：10L/min；干燥器流量：10L/min；
3：绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
4：计算浓度：取步骤S2中所处理好的生物样本进行LC-MS/MS分析，用步骤S3中的标准曲线进行定量(如附图3所示，神经酸含量在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围内线性良好，线性方程：Y＝(65.5810)X+(-106.262)，R2＝0.998635)，从而计算出待测样本中神经酸的含量；
为了本领域一般技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下结合具体实例进一步介绍。本实施案例适用于干血滤纸片中神经酸含量测定。
试验之前需要进行干血滤纸片标本、检测设备及检测试剂的准备工作
标本的采集：采集患者足跟血或指尖血制成干血点；
标本类型：干血滤纸片
检测设备：高效液相色谱串联质谱仪8050CL(LC-MS/MS岛津)
恒温孵育振荡器：品牌：杭州奥盛；型号/规格：MB100-2A。设备编号：KMHH-YQ-SP-018
氮吹仪：品牌：杭州奥盛；型号：MD-200，设备编号：KMHH-YQ-SP-025
打孔钳：品牌：可得优；
96孔板：品牌：Greiner bio-one，656101，Germany
微量移液器：品牌：Eppendorf；型号/规格：0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL经校准合格的微量移液器。
检测试剂(如无特殊要求，下列试剂均为色谱纯)：
氮气：纯度98％；
纯水：CAS号：7732-18-5，货号：20181123H，屈臣氏,规格：4.5L；
甲醇：HPLC级，CAS号：67-56-1，货号：UN1230、Merk,规格：4L；
乙腈：HPLC级，CAS号：75-05-8，货号：A998-4、Fisher，规格：4L；
甲酸：HPLC级，CAS号：64-18-6，货号：A117-50、Fisher，规格：50mL；
神经酸标准品：纯度≥99.9％,分子量：366.6，CAS号：C24H46O2，阿拉丁，规格：5g；
0.1％甲酸甲醇溶液：用1mL移液器吸取500ul甲酸于500mL甲醇的流动相玻璃瓶中，充分摇匀并超声3min。
色谱条件如下：
色谱柱：品牌：沃特世；型号：Waters HSS T3 1.8μm2.1*50mm
流动相A：纯水 流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液
进样量：5μL 柱温：30℃流速：0.35mL/min
神经酸梯度洗脱程序如下表1：
表1神经酸梯度洗脱程序
质谱条件如下：
离子源模式为:APCI(+)模式；接口温度：300℃，DL温度:250℃，加热块温度：400℃；雾化气流速：3L/min；加热气流速：10L/min；干燥器流量：10L/min；
方法学验证
1抗干扰实验
1.1实验目的
考察样品基质、预处理试剂、对分析物的影响。
1.1实验方法
选取5个不同来源的健康人空白标本，按照S2所述方法进行前处理并分析，同时，分别制作空白样本中加入定量下限的质控品工作液样本作为参照，详见色谱图附图5
实验结论：由图4可见，空白样品基质、试剂、不干扰分析物
2日内日间精密度
2.1实验目的
考察实验方法的稳定性
2.2实验方法
分别加入标准母液A1(浓度500ug/mL)4μL、20μL、40μL于2ml离心管，然后分别加入健康人血液996μL、980μL、960μL涡旋混匀，分别制作低浓度、中浓度和高浓度加标平行样本各5份，按照S2所述方法进行前处理并进样分析，测定日内精密度；连续测定三天计算日间精密度
2.3实验结果
表3：方法精密度测定结果
2.4实验结论
实验结果RSD≤15％，符合生物样本测定要求。
3加标回收率
3.1实验目的
通过对加标样品的回收率考察实验结果的准确性。
3.2实验结果
表4：回收率实验结果
3.3实验结论
由实验结果可知三个加标浓度的回收率均为85～120％之间，且相对标准偏差RSD<15％，满足方法学验证要求。
4标准曲线
4.1实验目的
验证本方法的线性范围
4.2实验方法
按照本发明所述方法建立标准曲线，进样分析，一共分析3批。
4.3实验结果
表5：标准曲线验证结果
4.4实验结论
标准曲线线性范围：在0.078125ug/mL～40.0ug/mL范围内，线性良好，r2均大于0.995，满足方法学相关要求。
5定量下限
5.1实验目的
考察样品在定量下限附近时的检测准确度
5.2实验方法
以10倍信噪比(10S/N)作为定量限(LOQ)，制备一批低浓度样本，按照S2所述方法进行前处理并进样分析，每批次样本平行测定五次。
5.3实验结论
定量限(LOQ)：0.035μg/mL；线性范围：在0.035μg/mL到40.0μg/mL范围内，线性良好，满足方法学验证要求。
6讨论
本发明方法采用液相色谱串联质谱法检测干血滤纸片中神经酸含量，具有较好的精确度、准确度及较宽的线性范围，目前神经酸测定的样本类型主要为血清，前处理方法主要为蛋白沉淀、衍生化等，而本研究建立的样本类型是干血滤纸片，更加便于样本的采集、保存及运输；采血所需耗材成本低，所需采血量较少。其次，目前报道所采用的前处理方法成本高、耗时长，本发明方法所采用的前处理方法简单、便捷、耗时短。同时，本发明所采用的离子源是APCI源，很大程度上降低基质对目标分析物的干扰，实现高特异性、高灵敏度分析；其次，流动相、色谱柱与现有发明相比，具有较大差异，属于完全不同的分析方法；最后，本发明方法可在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围保持良好线性，相关系数R2＝0.998635，实现较宽的线性范围，又保证较高的灵敏度。
Claims (3)
1.高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：标准溶液配制：精确称量神经酸标准品5mg于10mL容量瓶中，纯甲醇定溶，得到标准母液A1，浓度500ug/mL，用600ul离心管进行分装，每管分装体积400ul，-80℃保存，有效期至少6个月；
S2：生物样本处理：直径3mm打孔器取样2个DBS血斑，置于96孔板中，每孔加入200μL的甲醇/乙腈，容积1∶1，萃取溶剂；37℃密封孵育震荡20min，4000转/min离心5min，取上清40℃加热氮气吹干，100μL甲醇复溶，铝箔覆盖，混匀1min→离心5min后进行LC-MS/MS分析；
S3：绘制标准曲线，以标准品浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标绘制标准曲线；
S4：计算浓度：取步骤S2中所处理好的生物样本进行LC-MS/MS分析，用步骤S3中的标准曲线进行定量，神经酸含量在0.078125ug/mL～40.0ug/mL浓度范围内线性良好，线性方程：(18778.6)X+0.467，R2＝0.998635，从而计算出待测样本中神经酸的含量。
2.根据权利要求1高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法，其特征在于：
S1中，标准品工作液为含有神经酸储备液A1，经过步骤S1中所述储备液A1稀释成0.078125ug/mL、0.3125ug/mL、1.25ug/mL、5.0ug/mL、20.0ug/mL、40.0ug/mL浓度的神经酸标准工作液，稀释液为甲醇色谱纯。
3.根据权利要求1高效液相色谱串联质谱法测定干血滤纸片中神经酸含量方法，其特征在于：S2中，所述生物样本是采集患者足跟血或指尖血制成干血点。
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