CN103115993B

CN103115993B - 一种尿液中cema和hema的液相色谱串联质谱测定方法

Info

Publication number: CN103115993B
Application number: CN201210588316.8A
Authority: CN
Inventors: 侯宏卫; 张小涛; 田永峰; 刘彤; 陈欢; 韩书磊; 胡清源
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2015-10-07
Anticipated expiration: 2032-12-29
Also published as: CN103115993A

Abstract

一种尿液中CEMA和HEMA的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：a、收集志愿者尿液，b、样品前处理，c、标准工作溶液的配制，d、液相色谱-串联质谱测定。本发明的特点是样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定，可快速、准确检测出尿液中CEMA和HEMA的含量水平。本发明为全新的尿液中CEMA和HEMA含量的测定方法，采用氘代标准品作为内标定量分析物，可以减少样品前处理过程中引起的误差；串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。

Description

一种尿液中CEMA和HEMA的液相色谱串联质谱测定方法

技术领域：

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，主要涉及尿液样本的巯基尿酸测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定尿液中N-乙酰基-S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸（CEMA）和N-乙酰基-S-（2-羟基乙基）-L-半胱氨酸（HEMA）含量的方法。

背景技术：

丙烯腈是含有活性乙烯基和腈基的a,b-不饱和腈类化合物。它可以通过代谢活化后形成活性更强的环氧型中间体，进一步与体内的细胞大分子的亲核中心共价结合，从而造成机体的损伤。体外毒理学实验和流行病学调查数据显示，丙烯腈具有一定的致癌性。1999年，IARC将其归为可能的人类致癌物。丙烯腈存在于卷烟烟气中（7.8-39.1 μg/支烟），普通人群可以通过吸入卷烟烟气接触丙烯腈，从而增加健康风险。丙烯腈进入体内后于可以直接或通过代谢活化后于GSH，形成两种巯基尿酸代谢物：CEMA和HEMA。尿液中的CEMA和HEMA不仅能提供丙烯腈及其可能的代谢中间物及其与GSH结合机制的有关信息，而且能在一定程度上反映丙烯腈在体内的代谢状况。2007年，Scherer等研究了CEMA和HEMA等生物标志物与抽吸卷烟原型物释放量之间的关系，用于评估接触风险。

LC-MS/MS可以用于测定尿液中的CEMA和HEMA含量，并应用于吸烟人群的生物监测。由于尿液中CEMA和HEMA在普通人群中的含量较低、尿液基质较为复杂使得一些已经建立的LC-MS/MS方法在检测非吸烟者尿液中的CEMA和HEMA时受到限制。分析柱填料粒径低于2 μm的液相色谱的出现为复杂生物混合物提供了更好的分离能力，其与质谱的联用，降低了分析物的检出限及质谱检测的离子抑制现象，并提高了分析速度，从而可以实现快速、高通量的分析。

本发明以尿液中的CEMA和HEMA为研究对象，建立了直接稀释进样快速高分辨液相色谱-串联质谱（RRLC-MS/MS）测定人体尿液中的CEMA和HEMA方法。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用LC-MS/MS测定卷烟尿液中CEMA和HEMA含量的方法，该方法能快速、准确检测尿液中CEMA和HEMA的含量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：尿液中CEMA和HEMA含量的测定方法，包括以下工艺步骤：

a、收集志愿者尿液。

b、样品前处理：尿液在室温下解冻，混合均匀。准确移取1.0 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化，在10000 rpm的条件下离心10 min。取上清液过0.22 μm的聚醚砜水相滤膜。移取100 μL的滤液于2.0 mL旋盖色谱瓶，加入100 μL混合内标，加入800μL 0.1%甲酸水溶液并混合均匀，取2.0 μL进LC-MS/MS分析。

c、利用甲醇配制不同浓度的标准工作溶液

d、LC-MS/MS测定，吸取配制好的不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，CEMA和HEMA的线性回归方程为y=0.0508+0.00356和y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

在本发明中，所述混合内标为氘代内标，氘代内标浓度为1 μg/mL。

本发明中选取了选取了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（RRHT 2.1×50 mm, 1.8 μm）色谱柱，流动相A：0.1% 甲酸水溶液，流动相B：0.1% 甲酸乙腈；梯度洗脱条件：0-1 min，95% A -95% A；1-3 min， 95% A - 5% A；3-4.5 min，5% A；4.5-5 min，5% A - 95% A；5-6 min，95% A，分析时间为6 min，进样量为2 μL。

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；喷雾电压（IS）：-4400V，雾化气（Gas1）：55 psi，气帘气压力（CUR）：35 psi，辅助雾化气（Gas2）：50 psi，离子源温度（TEM）：530 °C，进口电压（EP）：-10 V，出口电压（CXP）：-10 V，驻留时间：100 ms。

监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见表1：

表1 CEMA和HEMA及其氘代标准品的保留时间以及部分质谱参数

本发明具体的工艺过程进一步详述如下：

1 尿液收集

收集志愿者尿液。

2 样品前处理

尿液在室温下解冻，混合均匀。准确移取1.0 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化，在10000 rpm的条件下离心10 min。取上清液过0.22 μm的聚醚砜水相滤膜。移取100 μL的滤液于2.0 mL旋盖色谱瓶，加入100 μL混合内标，加入800μL 0.1%甲酸水溶液并混合均匀，取2.0 μL进LC-MS/MS分析。

3 LC-MS/MS

（1）LC-MS/MS条件

色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（RRHT 2.1×50 mm, 1.8 μm）色谱柱，流动相A：0.1% 甲酸水溶液，流动相B：0.1% 甲酸乙腈；梯度洗脱，分析时间为6 min，进样量为2 μL。

（2）尿液中CEMA和HEMA含量的测定

吸取配制好的不同浓度的CEMA和HEMA的混合标准工作溶液5 μL，注入LC-MS/MS。CEMA和HEMA的线性回归方程分别为y=0.0508+0.00356和y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中CEMA和HEMA的含量。

（3）本发明方法的线性范围和检出限：

用处理过的混合空白尿液配制系列标准曲线，CEMA的标准曲线的点为0.5，1，2，5，10，20，40和100 ng/mL，HEMA的标准曲线的点为0.2，1，2，5，10，20和40 ng/mL，化合物的线性良好，相关系数大于0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。CEMA的定量限和检出限分别为0.01 ng/mL和0.03 ng/mL；HEMA的定量限和检出限分别为0.05 ng/mL和0.17 ng/mL。

（4）本发明方法加标回收率和重复性：

取空白尿液加入分析物的标准溶液，制备高、中、低3种不同浓度水平的样品，按前面的前处理方法对加标样品进行前处理。每个浓度取8份样品做日内分析，得到回收率和日内精密度，连续分析6天，得到日间精密度。CEMA和HEMA的回收率范围分别是96.4%-99.6%和87.8%-97.5%，日内和日间精密度都小于10%（表2），表明方法的准确性和精密度都较好。

表2 CEMA和HEMA的加标回收率与精密度

本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液样本优化了前处理方法，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

① 与传统的液相色谱-荧光法比较，LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，需要的样品量少。

②采用氘代标准品作为内标定量分析物，可以减少样品前处理过程中引起的误差。

③本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

图 1. ESI负离子模式下CEMA和HEMA的子离子串联质谱图（a, CEMA; b, HEMA)

图2. CEMA和HEMA在合并空白尿液（a, b, c, d）和尿液样本（e, f, g, h）中的典型性色谱图（样本中CEMA和HEMA的含量分别为13.62 ng/mg和4.91 ng/mg）。

图3 37个尿液样本中CEMA和HEMA的浓度

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

一种尿液中CEMA和HEMA的测定方法，其测试过程是尿液经稀释后直接引入LC-MS/MS系统分析。

实例1：

1．仪器与试剂：安捷伦1200 快速高分辨液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1367D自动进样器，G1312B二元混合泵和G1316B柱温箱；API 5500三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源和analyst 1.5软件数据处理系统。

N-乙酰基-S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸（纯度 98%）、N-乙酰基-S-（2-羟基乙基）-L-半胱氨酸（纯度 98%）、N-乙酰基-S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸-D3（化学纯度98%, 同位素纯度 99%）、N-乙酰基-S-（2-羟基乙基）-L-半胱氨酸-D4（化学纯度98%, 同位素纯度 99%）（Toronto Research Chemicals 公司）。甲酸（色谱纯，Acros Organics公司）。甲醇、乙腈（色谱纯，TEDIA公司）。

2．样品处理：尿液在室温下解冻，混合均匀。准确移取1.0 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化，在10000 rpm的条件下离心10 min。取上清液过0.22 μm的聚醚砜水相滤膜。移取100 μL的滤液于2.0 mL旋盖色谱瓶，加入100 μL混合内标，加入800μL 0.1%甲酸水溶液并混合均匀，取2.0 μL进LC-MS/MS分析。

3．测定方法：吸取含CEMA分别为0.5，1，2，5，10，20，40和100 ng/mL的点以及HEMA为0.2，0.5，1，2，5，10，20和40 ng/mL的标准溶液和稀释过滤后的样品各2 μL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中CEMA和HEMA的含量。

实例2：如实施例1所述，留取37个尿液样本。测得尿液中CEMA和HEMA的含量如图3所示。

Claims

1.一种尿液中CEMA和HEMA的液相色谱串联质谱测定方法，CEMA指的是N-乙酰基-S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸，HEMA指的是N-乙酰基-S-（2-羟基乙基）-L-半胱氨酸，其特征在于：包括以下工艺步骤：

a、收集志愿者尿液；

b、样品前处理：尿液在室温下解冻，混合均匀，准确移取1.0 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化，在10000 rpm的条件下离心10 min，取上清液过0.22 μm的聚醚砜水相滤膜，移取100 μL的滤液于2.0 mL旋盖色谱瓶，加入100 μL混合内标，加入800μL 0.1%甲酸水溶液并混合均匀，取2.0 μL进LC-MS/MS分析；所述混合内标为氘代内标，氘代内标浓度为1 μg/mL；

c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液；

d、LC-MS/MS测定，吸取配制好的不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，CEMA的线性回归方程为y=0.0508+0.00356, HEMA的线性回归方程为y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度，相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量;

在LC-MS/MS测定中，选取了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 RRHT 2.1×50 mm, 1.8 μm色谱柱，流动相A：0.1% 甲酸水溶液，流动相B：0.1% 甲酸乙腈；采用梯度洗脱，分析时间为6 min，进样量为2 μL；梯度洗脱条件：0-1 min，95% A - 95% A；1-3 min， 95% A -5% A；3-4.5 min，5% A；4.5-5 min，5% A -95% A；5-6 min，95% A，流动相流速为400 μL/min；

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；喷雾电压IS：-4400V，雾化气Gas1：55 psi，气帘气压力CUR：35 psi，辅助雾化气Gas2：50 psi，离子源温度TEM：530 ℃，进口电压EP：-10 V，出口电压CXP：-10 V，驻留时间：100 ms。