CN103852549B - 一种尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法 - Google Patents
一种尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括样品经稀释后直接引入液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪进行测定，可快速、准确检测出尿液中苯乙醛酸的含量水平。本发明为全新的尿液中苯乙醛酸含量的测定方法，采用外表法定量分析物；串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。
Description
技术领域
本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定尿液中苯乙醛酸含量的方法。
背景技术
苯乙烯是塑料橡胶工业的重要原料，用以制造各种塑料树脂，合成橡胶，含有苯乙烯的塑料橡胶制品广泛用于日常生活和工业生产，如各种包装材料、隔热材料、一次性饭盒、纸杯、管道、容器等。苯乙烯还存在于卷烟烟气中。苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道，或通过皮肤接触进入人体，短时间接触高浓度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激症状；长时间接触苯乙烯可引起肺组织结构损害，从而使人易患肺炎、肺气肿等疾病。国际癌症研究组织将其列为Group 2A，即对人类为很可能致癌物，对动物则为确定之致癌物。吸入体内的苯乙烯在CYP2B6和CYP2E酶的作用下代谢为苯乙烯7，8-氧化物，苯乙烯7，8-氧化物在环氧化物酶的作用下进一步代谢为苯乙醛酸和苯乙醇酸，苯乙醛酸的结构式如下，目前已经被用作苯乙烯暴露的生物标志物。
目前，分析尿液中苯乙烯的代谢物-苯乙醛酸的方法主要有：液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的方法。由于尿液基质比较复杂，采用液相色谱的方法检测往往需要经过复杂的前处理来净化样品，且由于仪器灵敏度不够，对于非职业暴露人群尿液中苯乙醛酸的检测存在挑战；而气相色谱质谱方法需要先进行衍生化；液相色谱串联质谱由于其灵敏度高、检测限低，因此被广泛的用于尿液中生物标志物的研究。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的测定尿液中的苯乙醛酸的LC-MS/MS方法，该方法能快速、准确检测尿液中苯乙醛酸的含量，测定结果准确、测定干扰少。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法，包括以下工艺步骤：
a、收集志愿者尿液。
b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。
c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的苯乙醛酸标准工作溶液，浓度分别为1，2，5，10，50和100 ng/mL。
d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的苯乙醛酸标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，苯乙醛酸的线性回归方程为y=1.49×104x+3.81×103，其中Y代表分析物的峰面积，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
本发明中选取了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），初始流动相体系选取50% 溶剂A（水溶液）和50% 溶剂B（甲醇溶液），等度洗脱，流动相流速为400 μL/min，分析时间为10 min，进样量为2 μL。
串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；电喷雾电压：4500V, 雾化气：50 psi, 气帘气：35 psi, 辅助加热气：30 psi，射入电压：9 V，驻留时间：100 ms。选取m/z 149/77作为定量离子对，m/z 149/105为定性离子对。
本发明方法的线性范围和检出限：
用处理过的混合空白尿液配制系列标准曲线，苯乙醛酸的标准曲线的点为1，2，5，10，50和100 ng/mL，化合物的线性良好，相关系数为0.9998。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。方法的检出限和定量限分别为0.81 ng/mL和2.70 ng/mL。
本发明方法加标回收率和重复性：
采用尿液基质加标准品的方法测定方法的回收率。选取五个尿液样本，混合均匀以后，选取低、中和高三个添加水平加入标准品，每个浓度平行做6个重复，得到方法的回收率和精密度（以相对标准偏差（RSD）计）,见表1，方法的回收率范围是102.6-104.7%，RSD＜8.5%。
表1方法的回收率和精密度（n=6）
| 化合物 | 本底/（ng/mL） | 加标量/（ng/mL） | 检测/（ng/mL） | 平均回收率/% | 相对标准偏差/% |
| 10 | 41.7 | 104.7 | 8.36 | ||
| 苯乙醛酸 | 31.2 | 50 | 82.5 | 102.6 | 2.02 |
| 80 | 114.6 | 104.3 | 1.64 |
本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对尿液样本优化了前处理方法，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：
① 与传统的液相色谱-荧光法比较，LC-MS/MS方法灵敏度更高（约100倍），前处理只需要简单的过滤和稀释，需要的样品量少（200 μL）。
②本方法具有操作简便、分析时间短（10 min）、灵敏度及重复性好的优点。
附图说明
图 1中：(A)苯乙醛酸标准品水溶液的色谱图；（B）苯乙醛酸稀释5倍的尿液中色谱图。
具体实施方式
本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。
一种尿液中苯乙醛酸的测定方法，其测试过程是尿液经稀释后直接引入LC-MS/MS系统分析。
实例1：
1．仪器与试剂：安捷伦1200 液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1329A 自动进样器，G1311A 四元混合泵和G1316A 柱温箱；API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源（ESI）和analyst 1.5软件数据处理系统。
苯乙醛酸标准品（纯度:98%, Toronto Research Chemicals Inc.）；甲醇（TEDIA company Inc., Ohio, USA），所有的溶剂均为色谱纯，实验中所用水都为去离子水。
2．样品处理：尿液样品于室温下解冻，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。
3．测定方法：吸取1，2，5，10，50和100 ng/mL的标准溶液和稀释过滤后的样品各2 μL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中苯乙醛酸的含量。
实例2：如实施例1所述，留取10个尿液样本。测得尿液中苯乙醛酸的含量如表2所示。
表 2 尿液中苯乙醛酸的含量水平（μg/mL）
| 序号 | 含量 | 序号 | 含量 | |
| 1 | 0.20 | 6 | 0.10 | |
| 2 | 0.36 | 7 | 0.16 | |
| 3 | 0.52 | 8 | 0.42 | |
| 4 | 0.15 | 9 | 0.44 | |
| 5 | 0.61 | 10 | 0.17 |
Claims (2)
1.一种尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：
a、收集志愿者尿液；
b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，经过0.22 μm的滤膜过滤，取200 μL的尿液，加入0.80 mL纯水，取2 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析；
c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的苯乙醛酸标准工作溶液；
d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的苯乙醛酸标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，选取了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱，规格150 mm×2.1 mm，3.5 μm，初始流动相体系选取50% 溶剂A：水溶液和50% 溶剂B：甲醇溶液，等度洗脱，流动相流速为400 μL/min，分析时间为10 min，进样量为2 μL；串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测负离子扫描方式；电喷雾电压：4500V, 雾化气：50 psi, 气帘气：35 psi, 辅助加热气：30 psi，射入电压：9 V，驻留时间：100 ms；
苯乙醛酸的线性回归方程为y=1.49×104x+3.81×103，其中Y代表分析物的峰面积，X表示尿液中目标分析物的浓度，相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
2.根据权利要求1所述的尿液中苯乙醛酸的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：苯乙醛酸标准工作溶液的浓度分别为1，2，5，10，50和100 ng/mL。
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