CN103091438B - 一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法，包括样品的采集，前处理，标准工作溶液的配制，液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)测定分析,使用大气压光电离离子源对样品进行电离，该方法能快速、准确检测卷烟滤嘴中苯并[a]芘的含量，测定结果准确，干扰少。

Description

一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法
技术领域
本发明属于卷烟滤嘴样本的理化检验技术领域，主要涉及卷烟滤嘴样本的多环芳烃类化合物测定技术领域，具体涉及一种采用液相色谱-光电电离-串联质谱仪(LC-APPI-MS/MS)测定卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的方法。
背景技术
自1933年J.Cook首次从煤焦油中分离到苯并芘并诱发小鼠皮肤癌以来，苯并[a]芘作为确定的人类致癌物受到科研工作者的广泛关注。肿瘤流行病学调查及动物实验研究发现苯并[a]芘具有较强致癌性，它与肿瘤的发生密切相关，尤其与人类肺癌的发生高度相关。苯并[a]芘也存在于卷烟烟气和抽吸过的卷烟滤嘴中，检测抽吸过的卷烟滤嘴中的含量水平可以间接评估吸烟者感受苯并芘的量，对于吸烟危害性评价具有较为重要的意义。
到目前为止，已有研究者建立了高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FL）检测卷烟滤嘴中的苯并[a]芘的方法，但方法前处理比较复杂，包括液液萃取、固相萃取，且一个样需要20个滤嘴。气相色谱质谱法（GC/MS）也被应用于测定苯并[a]芘化合物。研究报道采用GC/MS测定了主流烟气中痕量苯并[a]芘的方法，此方法的分离效果及色谱重现性好。但是，GC/MS法的前处理选用了固相萃取和浓缩过程，使得其较为复杂费时。近年来，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）被广泛应用于新药的发现与开发。液相色谱配备三级四级杆串联质谱被广泛应用于复杂生物基质中低含量化合物的定量检测，并且此方法一般具有较高选择性和较短的分析时间。由于LCMS/MS配制的离子源一般为电喷雾电离和大气压化学电离离子源，这些离子源对于大分子有机化合物具有较好的电离效果，而对于多环芳烃类化合物的电离效果较差，因此限制了其在此领域的应用。大气压光电离离子源（APPI）是一个新的电离方法，使用紫外线对样品进行电离，适合于低极性化合物的高灵敏度电离方法，尤其是在引入掺杂剂后可以较好的提高苯并[a]芘的检测灵敏度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用液相色谱-大气压光电离-串联质谱仪(LC-APPI-MS/MS)方法测定卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法，包括以下工艺步骤：
（1）样品的采集：收集抽吸卷烟后的滤嘴，去除烟丝残存部分，置于棕色储液瓶中低温冷冻保存；
（2）样品的前处理：取一个滤嘴，剥去包装纸和胶以后，放入25mL三角瓶中，加入200μL的1μg/mL的苯并[a]芘-d12，再加入9.8mL乙腈，振荡萃取10min。萃取液经0.22μm聚醚砜有机相滤膜过滤，收集滤液待LC-MS/MS分离分析；
（3）标准工作溶液的配制：分别称取10.0mg苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12于两个10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，得到1.0mg/mL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的一级储备液；分别移取100μL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的一级储备液于100mL的容量瓶，乙腈定容至刻度，得到1.0μg/mL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的二级储备液，放入-20°C冰箱备用。用二级储备液配制0.5，1，2，5，10，20和40ng/mL标准工作溶液。
（4）LC-MS/MS测定：吸取配制好的不同浓度的苯并[a]芘的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，测得其标准品峰面积和内标峰面积的比值与目标物浓度关系的一元线性回归方程Y=0.199X+0.0079，相关系数≥0.999，其中Y代表分析物与内标物峰面积的比值，X表示样品待测液中目标分析物的浓度，接着对振荡萃取和过滤之后的样品待测液进行测定，根据分析物峰面积和内标物峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中的苯并[a]芘含量。
其中，LC-MS/MS测定条件如下所述：色谱条件：Dionex Acclaim120C18色谱柱（150mm×3mm i.d.×3μmd.f.）；流动相A为乙腈溶液，流动相B为超纯水；柱温40°C；进样量5μL。掺杂剂：甲苯，流速为100μL/min；洗脱条件：95%A和5%B等度洗脱，流速为550μL/min；分析时间为8min。
质谱条件：大气压光电离离子源（APPI），正离子扫描,多反应监测；光电离电压：700V,雾化气压力：75psi,气帘气压力：15psi,辅助加热气压力：50psi,温度：600°C，射入电压：10V,碰撞能：9eV；去簇电压：110V，驻留时间：50ms。内标苯并芘离子对：263.1-265.2，苯并芘定性离子对：251.1-253.2，定量离子对：252.1-253.2。整个分析过程由Applied Biosystems Analyst version1.5.1软件来控制。
本发明方法的线性范围和检出限：
采用乙腈稀释标准品，得到7个不同浓度（0.5，1，2，5，10，20和40ng/mL）的标准溶液，然后经LC-MS/MS进行回归分析，标准曲线线性良好，相关系数为0.9991。利用标准溶液逐级稀释的方法测试定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。滤嘴中苯并芘的定量限和检出限分别为0.214ng/mL和0.064ng/mL。
（4）本发明方法加标回收率和重复性：
在不含苯并芘的空白卷烟滤嘴中加入不同浓度标准工作溶液，然后由LC-MS/MS测定加标回收率。选取三个添加水平，每个添加水平重复测定5次，得到的加标回收率和重复性，结果见表1。
表1苯并[a]芘的加标回收率和重复性
苯并[a]芘的回收率在82.64%-103.27%之间,相对标准偏差RSD在5.03-6.55%之间，证明方法的准确性和重复性结果较好。
串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性，对复杂基质的卷烟滤嘴样本，掺杂剂和串联质谱以及氘代内标的使用，能够有效的提高方法的选择性与灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间。与现有技术相比，本发明方法具有如下优良效果：
（1）与传统的液相色谱-荧光法比较，LC-MS/MS方法灵敏度更高，前处理简单，需要的样品量少；
（2）采用氘代苯并[a]芘标准品作为内标定量分析物，可以减少样品前处理过程中引起的误差；
（3）串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性，大气压光电离离子源能够较好的电离低极性的苯并[a]芘，掺杂剂的引入会增加电离效率，提高方法灵敏度；
（4）本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。
附图说明
图1a1为0.5ng/mL苯并[a]芘标准品的色谱图（总离子流图），a2和a3分别为苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的提取离子图。
图2b1为典型样品中苯并[a]芘(c苯并芘=0.5ng/mL)的色谱图（总离子流图），b2和b3分别为苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的提取离子图。
图3为苯并[a]芘的一级质谱图。
具体实施方式
本发明结合以下实施例对本发明进一步描述。
一种卷烟滤嘴中苯并芘的测定方法，其测试过程是将滤嘴去掉包装纸和胶，均分成四瓣，分别加入内标氘代苯并[a]芘和乙腈，振荡萃取后引入LC-MS/MS系统分析。
实施例1：
1、仪器与试剂：苯并[a]芘标准品（纯度≥98%）、氘代内标苯并[a]芘-d12（苯并[a]芘-d12，纯度≥98%），购自美国Supelco公司；乙腈（TEDIA company Inc.,Ohio,USA），所有的溶剂均为色谱纯。
安捷伦1200高分辨液相色谱仪（自动进样器G1367D,二元溶剂泵G1312B,柱温箱G1316B）（Agilent Technologies,Palo Alto,CA）；API5500三重四级杆串联质谱系统（Applied Biosystems,Foster City,CA），配有大气压光电离离子源（APPI）；日立L-2130泵(日本日立高新技术公司)；数据采集与处理在Analyst1.5.1软件上实现（AppliedBiosystems）。
2、样品处理：取一个滤嘴，剥去包装纸和胶以后，放入25mL三角瓶中，加入1μg/mL的氘代苯并[a]芘内标200μL，再加入9.8mL乙腈，振荡萃取10min；萃取液经0.22μm聚醚砜有机相相滤膜过滤，取5μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。
3、标准工作溶液的配制：分别称取10.0mg苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12于两个10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，得到1.0mg/mL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的一级储备液；用移液枪分别移取100μL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的一级储备液于100mL的容量瓶，乙腈定容至刻度，得到1.0μg/mL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12的二级储备液，放入-20°C冰箱备用；用二级储备液配制0.5，1，2，5，10，20和40ng/mL标准工作溶液。
4、测定方法：吸取0.5，1，2，5，10，20和40ng/mL的标准溶液，注入LCMS/MS系统，测得其标准品峰面积和内标峰面积的比值与目标物浓度关系的一元线性回归方程Y=0.199X+0.0079，相关系数≥0.999，其中Y代表分析物与内标物峰面积的比值，X表示样品待测液中目标分析物的浓度，接着采用同样的方法分析振荡萃取和过滤后的样品，测得样本中苯并[a]芘的含量为0.764ng/mL。
实施例2：测试方法如实施例1所述。留取20个抽吸过卷烟的滤嘴，测得滤嘴中苯并[a]芘的含量为8.93ng/支，实验结果见表2。
表2吸烟者抽吸不同牌号卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量水平（ng/支烟）
最后所应说明的是:以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品的采集：留取抽吸卷烟后的滤嘴，低温-80℃冷冻保存；
(2)样品前处理：取一个滤嘴，剥去包装纸和胶以后，放入三角瓶中，依次加入氘代内标苯并芘-d12和乙腈，振荡萃取，萃取液经有机相滤膜过滤，收集滤液待测；
(3)标准工作液的配制：用乙腈配制不同浓度的标准工作溶液；
(4)液相色谱-串联质谱LC-MS/MS测定：吸取配制好的不同浓度的苯并[a]芘标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，求得其标准品峰面积和内标峰面积的比值与目标物浓度关系的一元线性回归方程；接着对样品待测液进行测定，根据分析物与内标物峰面积的比值，求得样品待测液中分析物的含量；
其中步骤(4)选取了Dionex Acclaim120C18色谱柱150mm×3mmi.d.×3μmd.f.，流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，分析时间为8min，进样量为5μl；在流动相流入质谱前引入掺杂剂甲苯或氯苯；选取的洗脱条件：95％流动相A和5％的流动相B等度洗脱，流动相流速为550μl/min。
2.根据权利要求1所述的一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法，其特征在于：步骤(2)依次加入的氘代内标苯并[a]芘-d12和乙腈的体积分别为200μl和9.8ml，其中氘代内标浓度为1μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法，其特征在于：步骤(2)中的有机相滤膜为0.22μm聚醚砜有机相滤膜。
4.根据权利要求1所述的一种卷烟滤嘴中苯并[a]芘含量的测定方法，其特征在于：串联质谱检测器的条件：大气压光电离离子源APPI，正离子扫描,多反应监测；光电离电压为700V，雾化气压力为75psi，气帘气压力为15psi，辅助加热气压力为50psi，离子源温度为600℃，射入电压：10V，碰撞能：9eV；去簇电压：110V，驻留时间：50ms。
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