CN109682900A - 采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，尤其是采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法。该方法的步骤为：(1)取神经酸标准品，配制多份标准品溶液；(2)将配制好的所有标准品溶液分别上样于高效液相色谱，得到各份标准品溶液对应的色谱图；(3)以各份标准品溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得线性回归方程；(4)取含有神经酸的待测样品，得到待测样品的色谱图，求得待测样品中神经酸的含量。本发明选择乙腈作为溶解和提取溶剂，在保证主要成分被全部提取出来的基础上，除去了其他成分对含量测定的干扰。接着选择特定比例的流动相对待测物进行洗脱分离，实现了神经酸样品的简便快速定量，免去了常规方法酯化繁琐的操作和待测组分的损失。

Description

采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法。
背景技术
神经酸化学名为顺-15-二十四碳单烯酸，分子式为C24H46O2，相对分子量为366.6。在常温下，神经酸为白色片状晶体，能溶于醇，不溶于水，熔点为39～40℃。神经酸是一种ω-9型长链单不饱和脂肪酸，又名鲨鱼酸，最早发现存在于鲨鱼脑中，是神经组织生物膜的重要组成成分以及脑甙中髓质的标志性成分，也是世界公认的具有修复疏通受损大脑神经通路、恢复神经末梢活性、促进神经细胞生长和发育功能的重要物质。人体本身不能合成神经酸，也很难在日常食物中汲取到，只能靠人为补充。神经酸的缺乏会引起脑衰老、免疫功能低下、中枢与周围神经系统疾病：如老年痴呆、脑瘫、脑萎缩、抑郁、记忆力减退、睡眠健忘等脑疾病。
由于神经酸特殊的药理作用，对神经酸原料药及制剂中神经酸的含量测定具有重要价值。然而，目前神经酸含量的测定，多采用衍生化气相色谱法。由于衍生化气相色谱法通常将神经酸进行酯化后测定酯化物的含量，该方法预处理过程烦琐，可能存在未完全反应的神经酸，会对检测结果有一定影响，检测准确度不高。因此，亟待开发一种前处理简便、准确度高的神经酸含量测定方法。
发明内容
为了解决背景技术中描述的技术问题，本发明提供了一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，选择乙腈作为溶解和提取溶剂，在保证主要成分被全部提取出来的基础上，也除去了其他成分对含量测定的干扰。接着选择特定比例的流动相对待测物进行洗脱分离，实现了神经酸样品的简便快速定量，免去了常规方法酯化繁琐的操作和待测组分的损失。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，包括以下步骤：
(1)取神经酸标准品，以乙腈为溶剂，按照浓度梯度配制多份标准品溶液；
(2)将配制好的所有标准品溶液分别上样于高效液相色谱，采用C8色谱柱，以90％-95％乙腈和余量体积比为0.05％-0.15％的磷酸水溶液为流动相，得到各份标准品溶液对应的色谱图；
(3)以各份标准品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中神经酸色谱峰的峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程；
(4)取含有神经酸的待测样品，加入乙腈超声处理使主成分溶解，得待测样品溶液，上样于高效液相色谱，采用与步骤(2)相同的方法进行检测，得到待测样品的色谱图，将其中神经酸色谱峰的峰面积代入步骤(3)所述线性回归方程中，求得待测样品中神经酸的含量。
具体地，所述待测样品为神经酸原料药及含神经酸的固体制剂。
具体地，所述待测样品溶液的制备方法为：称取待测样品置容量瓶中，加入乙腈，超声处理使主成分溶解，乙腈定容至刻度，摇匀，得待测样品溶液。
具体地，所述待测样品溶液用0.22μm滤膜过滤后，再上样于高效液相色谱。
具体地，步骤(1)中，所述多份标准品溶液的浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL。
具体地，所述标准品溶液或待测样品溶液的进样量为5-15μL。
具体地，所述流动相的流速为1-1.5ml/min。
具体地，步骤(2)的上样于高效液相色谱的标准品溶液和步骤(4)的上样于高效液相色谱的待测样品溶液均使用PDA检测器进行检测；PDA检测器的检测波长为203nm。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，选择乙腈作为溶解和提取溶剂，在保证主要成分被全部提取出来的基础上，也除去了其他成分对含量测定的干扰。接着选择特定比例的流动相对待测物进行洗脱分离，实现了神经酸样品的简便快速定量，免去了常规方法酯化繁琐的操作和待测组分的损失。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的线性回归方程图；
图2是本发明的浓度为2mg/mL的标准溶液的色谱图；
图3是本发明的待测样品溶液的色谱图；
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明的线性回归方程图，图2是本发明的浓度为2mg/mL的标准溶液的色谱图，图3是本发明的待测样品溶液的色谱图。
实施例1
本实施例以神经酸片剂为待测样品，具体为：
(1)取神经酸标准品，以乙腈为溶剂，配置浓度为2mg/mL的标准品母液，再按照浓度梯度配制浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL的多份标准品溶液；
(2)将所述多份标准品溶液分别以10μL的进样量上样于高效液相色谱，采用C8色谱柱，以93％乙腈和余量体积比为0.05％-0.15％的磷酸水溶液为流动相，流速1ml/min进行洗脱，得各份标准品溶液对应的色谱图；
(3)以各份标准品溶液的浓度为横坐标、以对应色谱图中神经酸色谱峰的峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程(如附图1所示，神经酸含量在0.01～0.2mg/mL浓度范围内具有良好的线性关系)；所示线性回归方程具体为：y＝3000000x(mg/mL)+4795.9，R2＝0.9999；
(4)取神经酸片剂10片，精密称定，研细。精密称取适量(约相当于神经酸5mg)，置10mL容量瓶中，加乙腈适量，超声处理使主成分溶解，乙腈定容至刻度，摇匀，得待测样品溶液。将所述待测样品溶液用0.22μm滤膜过滤后，再上样于高效液相色谱，采用与步骤(2)相同的方法进行检测，得到待测样品溶液的色谱图，将其中神经酸色谱峰的峰面积代入步骤(3)所述线性回归方程中，求得待测样品中神经酸的含量。
浓度为2mg/mL的标准溶液以及待测样品溶液的色谱图分别如附图2、附图3所示。结合附图2和附图3可知，样品中的辅料及杂质等与神经酸得到了很好的分离，且样品与标准溶液中的神经酸保留时间几乎一致，该方法具有很好的专属性。
精密度：
1)按照实施例1提供的方法平行测定一份浓度为2mg/mL的标准溶液共6次，结果见表1。
表1：精密度(n＝6)
由表1可见，相对标准偏差RSD为1.80％，试验方法精密度高。
实验例2：稳定性
按照实施例1提供的方法，在24h内测定同一份待测样品溶液共6次(0h、2h、4h、8h、12h、24h)，评价待测样品溶液的稳定性，结果见表2。
表2：稳定性(n＝6)
由表2可见，相对标准偏差RSD为1.52％，待测样品溶液在24h内稳定。
实验例3：加标回收率
按照实施例1提供的方法，首先测定待测样品溶液中神经酸的浓度(约为0.1mg/mL)，再将待测样品溶液平均分成9份，每份500μl，再分成3组，每组分别加入浓度相当的神经酸标准溶液400μl，500μl，600μl，混匀后按照实施例1提供的方法分析，结果见表3。
表3：加标回收率(n＝9)
由表3可见，添加神经酸标准溶液后所得样品的回收率在96.91％～104.4％之间，RSD在0.80％～3.78％之间，说明该方法准确高，可用于固体制剂中神经酸的定量分析。此外，若采用合适的提取溶剂和方法提取到液体制剂(如水剂、油剂等)中的神经酸，本发明的方法也能实现对液体制剂样品中神经酸含量的准确测定。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (8)

1.一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取神经酸标准品，以乙腈为溶剂，按照浓度梯度配制多份标准品溶液；
(2)将配制好的所有标准品溶液分别上样于高效液相色谱，采用C8色谱柱，以90％-95％乙腈和余量体积比为0.05％-0.15％的磷酸水溶液为流动相，得到各份标准品溶液对应的色谱图；
(3)以各份标准品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中神经酸色谱峰的峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程；
(4)取含有神经酸的待测样品，加入乙腈超声处理使主成分溶解，得待测样品溶液，上样于高效液相色谱，采用与步骤(2)相同的方法进行检测，得到待测样品的色谱图，将其中神经酸色谱峰的峰面积代入步骤(3)所述线性回归方程中，求得待测样品中神经酸的含量。
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于，所述待测样品为神经酸原料药及含神经酸的固体制剂。
3.根据权利要求1或2所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备方法为：称取待测样品置容量瓶中，加入乙腈，超声处理使主成分溶解，乙腈定容至刻度，摇匀，得待测样品溶液。
4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于，所述待测样品溶液用0.22μm滤膜过滤后，再上样于高效液相色谱。
5.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述多份标准品溶液的浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于：所述标准品溶液或待测样品溶液的进样量为5-15μL。
7.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于：所述流动相的流速为1-1.5ml/min。
8.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于：步骤(2)的上样于高效液相色谱的标准品溶液和步骤(4)的上样于高效液相色谱的待测样品溶液均使用PDA检测器进行检测；PDA检测器的检测波长为203nm。
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