CN112730707B - 采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学技术领域，具体公开一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，包括以下步骤：取神经酸标准品、含有神经酸的待测样品，以甲醇为溶剂，超声1～5分钟；色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.01 mol/L磷酸二氢钾‑甲醇为流动相等度洗脱，本发明针对现有技术改变了流动相的参数，并采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱填料，经测试后峰高和峰面积没有无显著影响，但极大的缩短了出峰的时间，使得测试速度加快，效率提升。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法。
背景技术
神经酸化学名为顺-15-二十四碳单烯酸，分子式为C24H46O2，相对分子量为366 .6。在常温下，神经酸为白色片状晶体，能溶于醇，不溶于水，熔点为39～40℃。
目前多采用衍生化气相色谱法来测定神经酸的含量。采用衍生化气相色谱法，首先需要将神经酸进行酯化后测定酯化物的含量，该方法前处理过程繁琐，且难以判断酯化终点，检测结果的可信度不高。也有使用高效液相色谱法测定神经酸含量的现有技术，但依旧存在检测时间长，效率不高等问题，因此，亟需开发一种样品前处理简单，测定结果准确度高的神经酸含量测定方法。
发明内容
为了解决背景技术中描述的技术问题，本发明提供了一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，选择甲醇为溶解和提取溶剂，采用C18色谱柱，选择0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇为流动相等度洗脱，实现了神经酸的含量快速、准确定量分析。
本发明解决背景技术中的技术问题，通过以下具体技术方案来实现：
一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取神经酸标准品、含有神经酸的待测样品，以甲醇为溶剂，超声1～5分钟；
（2）色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇为流动相等度洗脱。
优选的，采用的色谱柱填料具体为十八烷基硅烷键合硅胶。
优选的，所述流动相0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5～15：85～95。
优选的，所述流动相0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5:95。
优选的，检测波长在198nm～213nm之间。
优选的，检测的波长为210nm。
优选的，待分析标准品或样品的进样质量按C24H46O2计为2微克～70微克。
优选的，分析流速为0.6 ml/min～1.5ml/min。
优选的，检测温度在20 ℃～30℃。
本发明方法色谱柱使用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，与CN109682900A中的色谱柱填料（辛烷基硅烷键合硅胶），提取溶剂、流动相组成有较大差异，属于在原理上本质不同的两种分析方法，通过与现有技术高效液相色谱法测定蒜头果油分离出的神经酸含量（赖福兵，李伟光等），蒜头果光合生理以及其种子中神经酸的提取纯化（付一笑） ，响应面优化超声辅助蒜头果中神经酸提取工艺及其HPLC分析（谷颖卓）中的高效液相色谱法测定神经酸的技术方案相对比，本发明创造性的仅使用了0.01mol/L 磷酸二氢钾与甲醇两个试剂组成的流动相，本发明方法检测时间约为8～15分钟，分析时间优于现有技术甲醇－乙腈－四氢呋喃－0.4%乙酸水溶液10:80:5:5流动相的18分钟，试剂组成得到的效果优于现有技术甲醇－乙腈－四氢呋喃－0.4%乙酸水溶液。
附图说明
图1 本发明方法实施例5神经酸标准品色谱图；
图2 本发明方法实施例5神经酸供试品色谱图；
图3 本发明方法神经酸线性回归方程图。
具体实施方式
本发明所使用的各种试剂均参照现有技术，使用色谱纯或分析纯级别。
实施例一：
（1）精密称取神经酸标准品约15mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为对照溶液。
（2）精密称取神经酸原料约15mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为供试品溶液。
（3）以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为3:97流动相等度洗脱，色谱柱柱为C18，检测波长为200nm，流速为1.2ml/min，进样体积为10ul,柱温30 °C。
经测试，实施例1中神经酸的出峰时间为7.9分钟。
实施例二：
（1）精密称取神经酸标准品约15mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为对照溶液。
（2）精密称取神经酸原料约15mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为供试品溶液。
（3）以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为3:97为流动相等度洗脱，色谱柱柱为C18，检测波长为200nm，流速为1.0ml/min，进样体积为20ul,柱温30 °C。
经测试，实施例2中神经酸的出峰时间为8.7分钟。
实施例三：
（1）精密称取神经酸标准品约15mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为对照溶液。
（2）精密称取神经酸原料约15mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为供试品溶液。
（3）以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为7:93为流动相等度洗脱，色谱柱柱为C18，检测波长为205nm，流速为0.8ml/min，进样体积为30ul,柱温20 °C。
经测试，实施例3中神经酸的出峰时间为11.3分钟。
实施例四：
（1）精密称取神经酸标准品约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为对照溶液。
（2）精密称取神经酸原料约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为供试品溶液。
（3）以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为7:93为流动相等度洗脱，色谱柱柱为C18，检测波长为205nm，流速为1.2ml/min，进样体积为10ul,柱温20 °C。
经测试，实施例4中神经酸的出峰时间为10.5分钟。
实施例五：
（1）精密称取神经酸标准品约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为对照溶液。
（2）精密称取神经酸原料约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为供试品溶液。
（3）以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5:95为流动相等度洗脱，色谱柱柱为C18，检测波长为210nm，流速为1.0ml/min，进样体积为20ul,柱温25 °C。
经测试，实施例5中神经酸的出峰时间为12.7分钟。
实施例六：
（1）精密称取神经酸标准品约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为对照溶液。
（2）精密称取神经酸原料约10mg置10ml量瓶中，加甲醇适量超声2分钟使溶解，并稀释至刻度，作为供试品溶液。
（3）以0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为5:95为流动相等度洗脱，色谱柱柱为C18，检测波长为210nm，流速为0.8ml/min，进样体积为30ul,柱温25 °C。
经测试，实施例6中神经酸的出峰时间为14.6分钟。
根据实施例5中的技术方案，对本发明方法的精密度、准确度、线性、对照溶液稳定性做了验证，结果如下：
精密度：
按照实施例5中的方法，平行制备6份供试品溶液，分别使用不同品牌的色谱柱，不同型号的高效液相色谱仪，在不同日期测定神经酸供试品的含量，结果见下表1、表2。
表1、表2可见，测定结果的相对标准偏差RSD均小于1.0%，本发明方法精密度高。
准确度：
精密称取125.37 mg 神经酸标准品置25 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声2分钟使其溶解后，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，作为神经酸标准储备液。
采用加样回收的方法进行准确度的考察。精密称定约13.50 mg 供试品置 25 mL量瓶中，平行称取9份，加入适量甲醇，超声2分钟使其溶解，将上述样品平均分为三组，每组分别加入神经酸标准品储备液1.5、2.5、3.5 mL ，加甲醇定容至刻度线。以精密度实验测得结果92.53%计算物底物的含量，根据最终测得结果，计算回收率，测定结果如表3所示。
表3结果表明：本发明方法回收率均在98%～102%之间，RSD均小于2.0%，本发明方法准确度高。
线性：
精密称取75.01 mg 神经酸标准品至25 mL 容量瓶中，加入适量甲醇，超声2分钟使其溶解后，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，作为线性储备液。
分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0mL的神经酸线性储备液分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，精密吸取20 μl 注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以神经酸峰面积和对应神经酸的浓度进行线性回归分析，由最小二乘法计算得回归方程y= 2178901.8610x + 68478.2000，相关系数为0.9998，说明在0.27～1.62 mg/mL 浓度范围内，神经酸的标准曲线线性良好。
稳定性：
按照实施例5中的方法，配制供试品溶液，放冰箱2～8 ℃ 保存，分别于0、1、2、4、6、8小时测定其峰面积。
表5结果表明：1、2、4、6、8小时与0小时峰面积的比值分别为99.34%、99.79%、100.46%、100.57%、99.12%，峰面积的RSD为0.58%，表明样品溶液在8小时内是稳定的。
Claims (1)
1.一种采用高效液相色谱法测定神经酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：取神经酸标准品、含有神经酸的待测样品，以甲醇为溶剂，超声 2 分钟；色谱条件为：采用 C18色谱柱，以 0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇为流动相等度洗脱；所述流动相 0.01 mol/L 磷酸二氢钾-甲醇的体积比为 3～7：93～97；检测波长在 200nm～210nm 之间；分析流速为0.8 ml/min～1.2ml/min，检测温度在 20 °C～30°C，所述待测样品为神经酸原料。
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