CN116699025A - 一种分析熊去氧胆酸质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种分析熊去氧胆酸质量的方法，属于化学药物分析技术领域。本发明提出一种分析熊去氧胆酸质量的方法，包括以下步骤：以高效液相色谱仪和电喷雾检测器作为检测仪器，以十八烷基硅烷基键合相为固定相，选用甲酸溶液或者三氟乙酸溶液作为流动相A，选用甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，检测器雾化温度为30‑35℃。该方法能够分析得出熊去氧胆酸质量。
Description
技术领域
本发明涉及化学药物分析技术领域，具体涉及一种分析熊去氧胆酸质量的方法。
背景技术
现有技术中，熊去氧胆酸有关物质的监控或检测，主要有色谱法与色谱联用技术，包括薄层色谱法、高效液相色谱法、HPLC-MS/MS(高效液相色谱与质谱联用)与GC-MS/MS(气相色谱与质谱联用)等。采用薄层色谱法进行熊去氧胆酸有关物质的检测控制，其专属性较差，灵敏度不高，而且无法直接定量和准确度不高；采用高效液相色谱法测定熊去氧胆酸有关物质，可选择的检测器包括示差折光检测器(RID)、蒸发光闪射检测器、质谱检测器和电喷雾检测器等。示差折光检测器(RID)灵敏度低，不适用于梯度洗脱，因此对复杂样品分离效果较差，专属性差；采用HPLC-MS/MS进行定量，首先要将被分析物电离，难电离的化合物无法检测，对仪器试剂等要求非常高，相应的成本非常高；采用HPLC-ELSD进行定量样品沸点不能过低，响应值与样品物质的量有关，但线性、灵敏度和重复性较差；CAD(电喷雾检测器)是近年开发的新一代通用型检测器，检测原理独特，不依赖于分析物的结构，也不需要将分析物电离，只要该物质属于半挥发或非挥发性化合物就可以被检出，且灵敏度可以达到pg级别，重现性良好，是前述检测器的有力补充，越来越受到药品研发机构的青睐。
电喷雾检测器是一个质量敏感型检测器，其检测响应值由进样的绝对质量决定，在一个实验中可以同时检测中性和阴阳离子，而前述检测器都无法实现。因此，可能适合熊去氧胆酸有关物质的检测分析。熊去氧胆酸中的杂质较多的情况下，如何结合电喷雾检测器分析熊去氧胆酸的质量是现有技术需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种分析熊去氧胆酸质量的方法，解决现有技术中在熊去氧胆酸中的杂质较多的情况下，如何结合电喷雾检测器分析熊去氧胆酸的质量的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种分析熊去氧胆酸质量的方法，包括以下步骤：以高效液相色谱仪和电喷雾检测器作为检测仪器，以十八烷基硅烷基键合相为固定相，选用甲酸溶液或者三氟乙酸溶液作为流动相A，选用甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，电喷雾检测器雾化温度为30-35℃。
进一步地，所述甲酸溶液或者所述三氟乙酸溶液的体积浓度为0.1％-0.2％，所述甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％-0.2％；其中的甲醇乙腈溶液中甲醇和乙腈的体积比为2-4:1。
进一步地，进样量为10-12μl，流速为0.9-1.1ml/min。
进一步地，柱温为25-35℃；色谱柱：长度120-150mm，直径4.0-4.6mm，粒径2.5-3.5μm。
进一步地，分析时间为60-70min。
进一步地，梯度洗脱程序如下：
进一步地，熊去氧胆酸中的杂质包括：3α,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3α,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3α,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸和3-氧代,7α-羟基-5α-胆甾烷-24-酸中的一种或者多种。
进一步地，各杂质的定位溶液由以下步骤制得：将各杂质对照品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1-1.5mg该杂质的溶液，再取该溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为定位溶液。
进一步地，供试品溶液由以下步骤制得：称取熊去氧胆酸供试品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1.0-1.2mg供试品的溶液，作为供试品溶液。
进一步地，对照溶液由以下步骤制得：取供试品溶液1-1.5ml，置200ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本方案的方法，采用高效液相色谱法(CAD)检测熊去氧胆酸杂质的含量，以高效液相色谱仪和电喷雾检测器作为检测仪器，以十八烷基硅烷基键合相为固定相，选用甲酸溶液或者三氟乙酸溶液作为流动相A，选用甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，检测器雾化温度为30-35℃，进而能够分析得出熊去氧胆酸质量，并通过专属性、灵敏度、线性、准确性和精密度等试验验证此方法的可靠性。
附图说明
图1是本发明实施例1的熊去氧胆酸专属性溶液的高效液相色谱图。
图2是本发明实施例1的杂质A的校准曲线。
图3是本发明实施例1的杂质B的校准曲线。
图4是本发明实施例1的杂质C的校准曲线。
图5是本发明实施例1的杂质D的校准曲线。
图6是本发明实施例1的杂质E的校准曲线。
图7是本发明实施例1的杂质F的校准曲线。
图8是本发明实施例1的杂质G的校准曲线。
图9是本发明实施例1的杂质H的校准曲线。
图10是本发明实施例1的UDCA的校准曲线。
具体实施方式
本具体实施方式提供一种分析熊去氧胆酸质量的方法，包括以下步骤：以高效液相色谱仪和电喷雾检测器作为检测仪器，以十八烷基硅烷基键合相为固定相，选用甲酸溶液或者三氟乙酸溶液作为流动相A，选用甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，电喷雾检测器雾化温度为30-35℃；所述甲酸溶液或者所述三氟乙酸溶液的体积浓度为0.1％-0.2％，所述甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％-0.2％；其中的甲醇乙腈溶液中甲醇和乙腈的体积比为2-4:1；进样量为10-12μl，流速为0.9-1.1ml/min；柱温为25-35℃；色谱柱：长度120-150mm，直径4.0-4.6mm，粒径2.5-3.5μm。
需要说明的是所述甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％-0.2％是指，甲酸在甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％-0.2％，或者三氟乙酸在甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％-0.2％。
本具体实施方式提出的分析熊去氧胆酸质量的方法的分析时间为60-70min。
本具体实施方式提出的分析熊去氧胆酸质量的方法的梯度洗脱程序如下：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0.0 | 75 | 25 |
| 20 | 40 | 60 |
| 40 | 40 | 60 |
| 44 | 15 | 85 |
| 54 | 15 | 85 |
| 55 | 75 | 25 |
| 60 | 75 | 25 |
。
本具体实施方式中的熊去氧胆酸中的杂质包括：3α,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3α,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3α,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸和3-氧代,7α-羟基-5α-胆甾烷-24-酸中的一种或者多种；各杂质的定位溶液由以下步骤制得：将各杂质对照品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1-1.5mg该杂质的溶液，再取该溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为定位溶液。
本具体实施方式中的供试品溶液由以下步骤制得：称取熊去氧胆酸供试品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1.0-1.2mg供试品的溶液，作为供试品溶液。
本具体实施方式中的对照溶液由以下步骤制得：取供试品溶液1-1.5ml，置200ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
熊去氧胆酸及各杂质的结构式如表1所示。
表1熊去氧胆酸及各杂质的结构式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中用代码表示相应的物质。
实施例1
本实施例提出一种分析熊去氧胆酸质量的方法，包括以下步骤：以高效液相色谱仪和电喷雾检测器作为检测仪器，以十八烷基硅烷基键合相为固定相，选用甲酸溶液作为流动相A，选用甲酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，其中甲醇乙腈溶液的甲醇和乙腈的体积比为2:1，电喷雾检测器雾化温度为35℃；分析60min。所述甲酸溶液或者所述三氟乙酸溶液的体积浓度为0.1％，所述甲酸的甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％；进样量为10μl；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；色谱柱：长度150mm，直径4.6mm，粒径2.5μm。
梯度洗脱程序如表2所示。
表2梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0.0 | 75 | 25 |
| 20 | 40 | 60 |
| 40 | 40 | 60 |
| 44 | 15 | 85 |
| 54 | 15 | 85 |
| 55 | 75 | 25 |
| 60 | 75 | 25 |
本实施例中的熊去氧胆酸中的杂质包括：3α,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3α,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3α,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸和3-氧代,7α-羟基-5α-胆甾烷-24-酸；各杂质的定位溶液由以下步骤制得：去各杂质对照品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1mg该杂质的溶液，再取该溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为定位溶液。
本实施例中的供试品溶液由以下步骤制得：称取熊去氧胆酸供试品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1.0mg供试品的溶液，作为供试品溶液。
本实施例中的对照溶液由以下步骤制得：取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
有关物质专属性图谱和相关结果如图1和下表3所示，熊去氧胆酸(UDCA)与已知杂质的出峰顺序为B、G、UDCA、D、F、C、H、A、E。
表3专属性检测结果
从图1和表3可以看出，通过该方法能够实现各杂质和熊去氧胆酸的分离，检测出熊去氧胆酸和相关杂质，从而得知熊去氧胆酸的质量。
为了进一步验证杂质A-H的有效检出，我们设置了灵敏度试验，检出限和定量限结果如表4所示。
表4检出限和定量限结果
| 名称 | 代码 | 检测限(ng) | 定量限(ng) |
| 3α,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸 | A | 4.96 | 9.93 |
| 3β,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸 | B | 12.86 | 42.38 |
| 3β,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸 | C | 5.8 | 11.61 |
| 3α,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸 | D | 6.26 | 12.52 |
| 3α,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸 | E | 4.67 | 9.33 |
| 3β,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸 | F | 4.92 | 9.85 |
| 3β,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸 | G | 11.93 | 39.37 |
| 3-氧代,7α-羟基-5α-胆甾烷-24-酸 | H | 4.96 | 9.92 |
为了验证熊去氧胆酸供试品溶液的稳定性，我们采用上述方法检测了24h的样品，结果如表5所示。
表5 24h样品的检测结果
从表4可以看出，不同时间的检测结果较为接近，说明样品的成分较为稳定。
为了进一步验证杂质A-H的准确度，我们设置了添加不同含量的杂质，添加量为5-15μg，相关检测结果如表6-9所示。
表6杂质A和B的回收率
| 杂质A | 杂质B | |||||
| 加入量μg | 测得量μg | 回收率 | 加入量 | 测得量 | 回收率 | |
| 1 | 5.5012 | 5.7331 | 104.22％ | 0.5039 | 0.5372 | 106.61％ |
| 2 | 5.5012 | 5.6625 | 102.93％ | 0.5039 | 0.5415 | 107.46％ |
| 3 | 5.5012 | 5.5647 | 101.15％ | 0.5039 | 0.5534 | 109.82％ |
| 4 | 11.0024 | 10.9879 | 99.87％ | 1.0078 | 1.0349 | 102.69％ |
| 5 | 11.0024 | 11.3765 | 103.40％ | 1.0078 | 1.0225 | 101.46％ |
| 6 | 11.0024 | 11.2105 | 101.89％ | 1.0078 | 1.0755 | 106.72％ |
| 7 | 16.5036 | 16.4691 | 99.79％ | 1.5117 | 1.5039 | 99.48％ |
| 8 | 16.5036 | 15.9984 | 96.94％ | 1.5117 | 1.5857 | 104.90％ |
| 9 | 16.5036 | 16.8527 | 102.12％ | 1.5117 | 1.5635 | 103.43％ |
| 平均值 | / | / | 101.64％ | / | / | 104.73％ |
| SD | / | / | 2.23％ | / | / | 3.26％ |
| RSD | / | / | 2.20％ | / | / | 3.11％ |
表7杂质C和D的回收率
| 杂质C | 杂质D | |||||
| 加入量μg | 测得量μg | 回收率 | 加入量 | 测得量 | 回收率 | |
| 1 | 0.4986 | 0.5239 | 105.07％ | 0.5012 | 0.523 | 104.35％ |
| 2 | 0.4986 | 0.5177 | 103.83％ | 0.5012 | 0.5419 | 108.12％ |
| 3 | 0.4986 | 0.5318 | 106.66％ | 0.5012 | 0.5375 | 107.24％ |
| 4 | 0.9972 | 1.0143 | 101.71％ | 1.0024 | 1.0397 | 103.72％ |
| 5 | 0.9972 | 1.0025 | 100.53％ | 1.0024 | 1.0512 | 104.87％ |
| 6 | 0.9972 | 1.0271 | 103.00％ | 1.0024 | 1.0684 | 106.58％ |
| 7 | 1.4958 | 1.4833 | 99.16％ | 1.5036 | 1.5291 | 101.70％ |
| 8 | 1.4958 | 1.4511 | 97.01％ | 1.5036 | 1.5084 | 100.32％ |
| 9 | 1.4958 | 1.4826 | 99.12％ | 1.5036 | 1.5027 | 99.94％ |
| 平均值 | / | / | 101.79％ | / | / | 104.09％ |
| SD | / | / | 3.13％ | / | / | 2.97％ |
| RSD | / | / | 3.08％ | / | / | 2.85％ |
表8杂质E和F的回收率
| 杂质E | 杂质F | |||||
| 加入量μg | 测得量μg | 回收率 | 加入量 | 测得量 | 回收率 | |
| 1 | 0.4913 | 0.5304 | 107.96％ | 0.5131 | 0.5592 | 108.98％ |
| 2 | 0.4913 | 0.5196 | 105.76％ | 0.5131 | 0.5398 | 105.20％ |
| 3 | 0.4913 | 0.5147 | 104.76％ | 0.5131 | 0.5461 | 106.43％ |
| 4 | 0.9826 | 1.0259 | 104.41％ | 1.0262 | 1.0409 | 101.43％ |
| 5 | 0.9826 | 0.9974 | 101.51％ | 1.0262 | 1.0794 | 105.18％ |
| 6 | 0.9826 | 0.9659 | 98.30％ | 1.0262 | 1.0633 | 103.62％ |
| 7 | 1.4739 | 1.4937 | 101.34％ | 1.5393 | 1.5474 | 100.53％ |
| 8 | 1.4739 | 1.4330 | 97.23％ | 1.5393 | 1.5105 | 98.13％ |
| 9 | 1.4739 | 1.5369 | 104.27％ | 1.5393 | 1.5062 | 97.85％ |
| 平均值 | / | / | 102.84％ | / | / | 103.04％ |
| SD | / | / | 3.52％ | / | / | 3.81％ |
| RSD | / | / | 3.42％ | / | / | 3.70％ |
表9杂质G和H的回收率
从表6-9可以看出，不同含量的杂质A-H都具有较高的回收率。
为了进一步验证检测出杂质A-H的精密度，我们设置了重复性试验，结果如表10-13所示。
表10杂质A和B的重复性检测结果
表11杂质C和D的重复性检测结果
表12杂质E和F的重复性检测结果
| 杂质E | 杂质F | |||||
| 加入量μg | 测得量μg | 100％加标回收率 | 加入量 | 测得量 | 100％加标回收率 | |
| 1 | 0.9826 | 1.0149 | 103.29％ | 1.0262 | 1.0194 | 99.34％ |
| 2 | 0.9826 | 1.0257 | 104.39％ | 1.0262 | 1.0485 | 102.17％ |
| 3 | 0.9826 | 0.9854 | 100.28％ | 1.0262 | 1.0803 | 105.27％ |
| 4 | 0.9826 | 1.0259 | 104.41％ | 1.0262 | 1.0409 | 101.43％ |
| 5 | 0.9826 | 0.9974 | 101.51％ | 1.0262 | 1.0794 | 105.18％ |
| 6 | 0.9826 | 0.9659 | 98.30％ | 1.0262 | 1.0633 | 103.62％ |
| 平均值 | / | / | 102.03％ | / | / | 102.84％ |
| RSD | / | / | 2.40％ | / | / | 2.25％ |
表13杂质G和H的重复性检测结果
从表10-13可以看出，杂质A-H的检出都具有较好的重复性。
为了进一步得知浓度和峰面积之间是否存在线性关系，我们进行了不同浓度的检测，结果如图2-10以及表14所示。
表14熊去氧胆酸有关物质方法验证结果
综上，从图2-10以及表14可以看出，该方法有很好的灵敏度，较高的准确度和良好的重复性；在约0.09-20μg/ml范围内杂质A、B、C、D、E、F、G和H回归方程R值为0.999-0.9999，样品浓度与峰面积相关性良好；供试品溶液在24小时内稳定。
熊去氧胆酸有关物质方法验证结果
进一步地，我们改变其中的一个检测条件进行相关检测，将柱温设为25℃或者35℃，流速设为0.9ml或者1.1ml，跟换色谱柱为Agilent eclipse XDB-C18长度150mm，直径4.6mm，粒径3.5μm，即色谱柱2，而其他条件不变开展五组新的检测，检测结果如表15和16所示。
表15不同条件下的检测结果
表16不同条件下的检测结果
从表15和16可以看出，改变其中的某个条件依然能够实现各个成分的有效分离，不影响检测，具有很好的耐用性。
本发明提出的方法对于熊去氧胆酸有关物质的测定具有较好的专属性、准确度和灵敏度，且操作简便易行。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：以高效液相色谱仪和电喷雾检测器作为检测仪器，以十八烷基硅烷基键合相为固定相，选用甲酸溶液或者三氟乙酸溶液作为流动相A，选用甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液作为流动相B进行梯度洗脱，电喷雾检测器雾化温度为30-35℃。
2.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，所述甲酸溶液或者所述三氟乙酸溶液的体积浓度为0.1％-0.2％，所述甲酸的甲醇乙腈溶液或者三氟乙酸的甲醇乙腈溶液的体积浓度为0.1％-0.2％；其中的甲醇乙腈溶液中甲醇和乙腈的体积比为2-4:1。
3.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，进样量为10-12μl，流速为0.9-1.1ml/min。
4.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，柱温为25-35℃；色谱柱：长度120-150mm，直径4.0-4.6mm，粒径2.5-3.5μm。
5.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，分析时间为60-70min。
6.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序如下：
。
7.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，熊去氧胆酸中的杂质包括：3α,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸、3α,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3α,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7α-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸、3β,7β-二羟基-5α-胆甾烷-24-酸和3-氧代,7α-羟基-5α-胆甾烷-24-酸中的一种或者多种。
8.根据权利要求7所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，各杂质的定位溶液由以下步骤制得：将各杂质对照品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1-1.5mg该杂质的溶液，再取该溶液1ml，置100ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为定位溶液。
9.根据权利要求1所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，供试品溶液由以下步骤制得：称取熊去氧胆酸供试品，用甲醇溶解并稀释制成每1ml中含1.0-1.2mg供试品的溶液，作为供试品溶液。
10.根据权利要求8所述的分析熊去氧胆酸质量的方法，其特征在于，对照溶液由以下步骤制得：取供试品溶液1-1.5ml，置200ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
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