CN114414720B - 一种金胆粉的检测方法 - Google Patents
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- G—PHYSICS
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- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
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Abstract
本发明属于化学药物分析技术领域，公开了一种金胆粉的检测方法。该检测方法采用高效液相色谱进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：流动相：流动相A：四氢呋喃水溶液；流动相B：三氟乙酸甲醇溶液。该检测方法可同时对牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺‑7‑酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸等6种胆酸类物质进行检测，且具有检测准确度高、重复性好、稳定性佳等优势，能够满足实际金胆粉质量的检测需求。
Description
技术领域
本发明属于化学药物分析技术领域，尤其涉及一种金胆粉的检测方法。
背景技术
胆酸类物质通常分为结合型胆酸物质和游离型胆酸物质两种，其中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸为结合型胆酸物质，而熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸等为游离型胆酸物质。胆酸类物质存在着紫外吸收弱，或仅有末端吸收的特点，采用紫外检测器进行检测时需采用低波长进行检测；而在低波长端，结合型胆酸物质的响应值远比游离型胆酸物质的响应值大，且多种有机溶剂对待测组分存在干扰，并存在基线波动、噪音大、灵敏度低、线性差、准确度不高等问题。
已知熊胆粉(金胆粉)的主要成分是牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸，但在生物转化过程中，可能会引入牛磺胆酸、牛磺-7-酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸等杂质。而熊胆粉中所含有的各胆酸类物质的极性差异不一致，导致在检测过程中很难用同一个色谱系统将主成分和有关物质有效分离出来。对1996年中国药典方法以及赵勇等发表在华西药学杂志的方法进行方法重现的过程中，发现牛磺熊去氧胆酸和牛磺-7-酮基胆石酸等杂质无法分离，其检测灵敏度较低，且检测准确度较差。
因此，本发明希望提出一种新的金胆粉检测方法，可在同一色谱条件下对金胆粉中多种胆酸类物质同时进行快速和准确的检测，以实现控制产品质量的目的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种金胆粉的检测方法。该检测方法可同时对牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺-7-酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸等6种胆酸类物质进行检测，且具有检测准确度高、重复性好、稳定性佳等优势，能够满足实际金胆粉质量的检测需求。
本发明提供了一种金胆粉的检测方法，采用高效液相色谱进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：
流动相：流动相A：四氢呋喃水溶液；流动相B：三氟乙酸甲醇溶液。
优选的，所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃的质量分数为0.1-1％。更优选的，所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃的质量分数为0.3％。
优选的，所述三氟乙酸甲醇溶液中三氟乙酸的质量分数为0.1-1％。更优选的，所述三氟乙酸甲醇溶液中三氟乙酸的质量分数为0.2％。
优选的，所述检测方法包括以下检测步骤：
系统适应性溶液的制备：分别称取牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺-7-酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸，用稀释剂溶解后，混合，配制成系统适应性溶液；
供试品溶液的制备：称定供试品，用稀释剂进行溶解，配制成供试品溶液；
将所述系统适应性溶液、供试品溶液和空白样品分别注入高效液相色谱仪进行检测，采用面积归一化法进行计算；其中空白样品为稀释剂。
更优选的，所述稀释剂为甲醇。
更优选的，所述供试品溶液的质量浓度为0.05-0.15mg/mL。
更优选的，所述系统适应性溶液进行检测时，理论板数≥1500，分离度≥1.5，拖尾因子≤2.0。
根据《中国药典》，分离度(简称为R)也叫分辨率，是指相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，其计算公式为R＝2(tR2-tR1)/(W1+W2)，tR1和tR2为相邻两峰的保留时间，W1和W2为其相应的峰宽。
分离度表示相邻两峰的分离程度，R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1时，两峰有部分重叠；当R＝1.0时，分离度可达98％；当R＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用R＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。
优选的，所述检测方法采用梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：
0-10min：流动相A的体积分数由78％变化至55％，流动相B的体积分数由22％变化至45％；
10-17min：流动相A的体积分数为55％变化至50％，流动相B的体积分数由45％变化至50％；
17-17.1min：流动相A的体积分数由50％变化至78％，流动相B的体积分数由50％变化至22％；
17.1-20min：流动相A的体积分数为78％，流动相B的体积分数为22％。
优选的，所述检测方法所用检测器为蒸发光检测器。
优选的，所述检测方法所用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
优选的，所述检测方法所用色谱柱的柱温为25-40℃。更优选的，所述检测方法所用色谱柱的柱温为30℃。
优选的，所述检测方法的进样量为5-20μL。更优选的，所述检测方法的进样量为10μL。
优选的，所述检测方法中流动相的流速为1.0-2.0mL/min。更优选的，所述检测方法中流动相的流速为1.5mL/min。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所述检测方法通过选用C18色谱柱和特定的流动相，克服了现有检测方法无法对多种胆酸类物质进行同步检测的不足，因而难以快速准确检测金胆粉的质量。而采用本发明所述检测方法，可同时对磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺-7-酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸在内的多种胆酸类物质进行检测，并具有检测准确度高、重复性好、稳定性佳的特点与优势，能够满足实际金胆粉质量的检测需求。
附图说明
图1为实施例1中空白试验的检测结果；
图2为实施例1中系统适用性试验的检测结果；
图3为实施例1中供试品的检测结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种金胆粉中胆酸类物质的检测方法，该检测方法包括：
一、仪器与检测条件
色谱柱：C18色谱柱(4.6*250mm，5μm)；
进样量：10μL；
流速：1.5mL/min；
柱温：30℃；
检测器：蒸发光检测器；
漂移管温度：45℃；
气体流量：1.5L/min；
流动相：流动相A：0.3％四氢呋喃水溶液；流动相B：0.2％三氟乙酸甲醇溶液；
采用双流动相(流动相A和流动相B)进行梯度洗脱，梯度洗脱的条件如表1所示：
表1梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 78 | 2 |
| 10 | 55 | 45 |
| 17 | 50 | 50 |
| 17.1 | 78 | 22 |
| 20 | 78 | 22 |
稀释剂：甲醇；
定量方法：面积归一化法。
二、实验步骤
采用高效液相色谱法进行检测，检测步骤如下：
(1)称取牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺-7-酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸对照品，用稀释剂进行溶解，混合，配置得到系统适用性溶液。
(2)精密称定金胆粉，用稀释剂进行溶解，配置得到浓度为0.5mg/mL的供试品溶液；
(3)空白试验：精密量取稀释剂10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，空白不得有干扰，检测结果如图1所示。
(4)系统适用性试验：精密量取系统适用性溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。记录系统适用性溶液色谱图各峰的分离度、理论塔板数和拖尾因子，分离度的大小要不小于1.5，理论塔板数不小于1500，拖尾因子不大于2.0。检测结果如图2所示，6种胆酸类物质均能实现快速及有效分离；
(5)精密量取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中扣除空白试验色谱峰，按面积归一化法分别计算。检测结果如图3所示，该金胆粉中除包含牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸两种主要功效成分外，还含有杂质牛磺胆酸。
实施例2
本实施例对牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸线性和范围进行考察。
取牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸对照品适量，用稀释剂分别配制浓度约为0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL的对照品混合溶液。分别取10μL溶液注入液相色谱仪(采用实施例1的色谱条件)中，记录色谱图，结果见表2-3。
表2牛磺熊去氧胆酸线性试验
| 编号 | 进样量(μg) | lg进样量 | 峰面积 | lg峰面积 |
| 1 | 0.465 | -0.333 | 237.73 | 2.376 |
| 2 | 0.744 | -0.128 | 504.01 | 2.702 |
| 3 | 0.930 | -0.032 | 737.91 | 2.868 |
| 4 | 1.115 | 0.047 | 974.02 | 2.989 |
| 5 | 1.394 | 0.144 | 1450.01 | 3.161 |
表2牛磺鹅去氧胆酸线性试验
| 编号 | 进样量(μg) | lg进样量 | 峰面积 | lg峰面积 |
| 1 | 0.470 | -0.328 | 171.00 | 2.233 |
| 2 | 0.751 | -0.124 | 351.54 | 2.546 |
| 3 | 0.939 | -0.027 | 508.07 | 2.706 |
| 4 | 1.127 | 0.052 | 661.49 | 2.821 |
| 5 | 1.409 | 0.149 | 980.61 | 2.991 |
以进样量和峰面积的对数做线性回归，得牛磺熊去氧胆酸线对数性线性方程相关系数R2＝0.9996；牛磺鹅去氧胆酸对数线性方程相关系数R2＝0.9994。上述结果表明：牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸线在0.05mg/mL-0.15mg/mL浓度范围内线性良好。
实施例3
本实施例对牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的检测准确度进行考察。
取牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸对照品适量，分别配制成粗浓度为80％(约0.08mg/mL)、100％(约0.1mg/mL)、120％(约0.12mg/mL)的对照品溶液，每个浓度配制3份，分别取10μL溶液注入液相色谱仪(采用实施例1的色谱条件)中，记录色谱图，计算杂质的回收率，测试结果如表4所示。
表4牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的回收率测试结果
表4的结果表明：3个浓度水平9份回收样品测得的平均回收率均在98％-102％范围内，RSD均小于2.0％，满足杂质含量测定要求，可保证测得结果的准确性和可靠性。
实施例4
本实施例对牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸的精密度进行考察。
取金胆粉样品，按照供试品溶液配制方法平行制备6份，采用实施例1中的检测方法分别进行测定，按标准曲线法计算含量，结果见表5所示。
表5牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)的精密度测试结果
| 组分 | TUDCA | TCDCA |
| No. | 含量(％) | 含量(％) |
| 1 | 17.07 | 18.31 |
| 2 | 17.08 | 18.35 |
| 3 | 17.13 | 18.48 |
| 4 | 17.26 | 18.51 |
| 5 | 17.14 | 18.44 |
| 6 | 17.21 | 18.49 |
| 平均值(％) | 17.1 | 18.4 |
| RSD(％) | 0.43 | 0.44 |
表5中结果表明，本发明所提出的检测方法具有较好重复性。
实施例5
本实施例对牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸溶液的检测稳定性进行考察。
取金胆粉供试品溶液，分别于室温下放置0、3、6、9、12、15、18、21、24小时后注入液相色谱仪(采用实施例1的色谱条件)，记录色谱图，按标准曲线法计算各时间点供试品溶液中物质的含量，结果见表6所示。
表6牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸溶液的稳定性测试结果
| 时间(h) | 含量(％) | 相对偏差(％) | 含量(％) | 相对偏差(％) |
| 初始 | 19.24 | / | 21.26 | / |
| 3 | 19.24 | 0 | 21.3 | 0.09 |
| 6 | 19.13 | 0.29 | 21.04 | 0.52 |
| 9 | 19.13 | 0.29 | 21.16 | 0.24 |
| 12 | 19.07 | 0.44 | 21.37 | 0.26 |
| 15 | 18.88 | 0.94 | 21.52 | 0.61 |
| 18 | 18.97 | 0.71 | 21.1 | 0.38 |
| 21 | 18.97 | 0.71 | 21.05 | 0.50 |
| 24 | 18.92 | 0.84 | 21.17 | 0.21 |
| RSD(％) | / | 0.70 | / | 0.75 |
表6的结果表明，将供试品溶液在室温条件下放置24小时内，采用本发明所提出的检测方法都呈现出良好的检测稳定性。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (6)
1.一种金胆粉的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：
流动相：流动相A：四氢呋喃水溶液；流动相B：三氟乙酸甲醇溶液；
所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃的质量分数为0.1-1%；
所述三氟乙酸甲醇溶液中三氟乙酸的质量分数为0.1-1%；
所述检测方法采用梯度洗脱，梯度洗脱的条件为：
0-10min：流动相A的体积分数由78%变化至55%，流动相B的体积分数由22%变化至45%；
10-17min：流动相A的体积分数为55%变化至50%，流动相B的体积分数由45%变化至50%；
17-17.1min：流动相A的体积分数由50%变化至78%，流动相B的体积分数由50%变化至22%；
17.1-20min：流动相A的体积分数为78%，流动相B的体积分数为22%。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下检测步骤：
系统适应性溶液的制备：分别称取牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺-7-酮基胆石酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸，用稀释剂溶解后，混合，配制成系统适应性溶液；
供试品溶液的制备：称定供试品，用稀释剂进行溶解，配制成供试品溶液；
将所述系统适应性溶液、供试品溶液和空白样品分别注入高效液相色谱仪进行检测，采用面积归一化法进行计算；其中空白样品为稀释剂。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法所用检测器为蒸发光检测器。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法所用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法所用色谱柱的柱温为25-40℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中流动相的流速为1.0-2.0mL/min。
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