CN117907490A - Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法 - Google Patents
Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了Fmoc‑S‑三苯甲基‑L‑半胱氨酸纯度检测方法，主要解决现有液相色谱方法存在的峰型拖尾以及目标峰与相邻杂质峰分离度等技术问题。本发明测定方法包括以下步骤：一，准备测量的试剂，二，样品的前处理；三，进行高效液相色谱测定，色谱仪为安捷伦1260色谱仪，采用DAD紫外检测器，色谱柱采用Agilent poroshell 120 EC‑C18，流动相为摩尔浓度为0.1%TFA水溶液（A）和质量百分浓度为100%甲醇（B）。通过本发明为Fmoc‑S‑三苯甲基‑L‑半胱氨酸纯度检测领域提供了可靠便捷的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及半胱氨酸纯度检测方法，特别涉及Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法。
背景技术
常规Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测，需要用到高效液相色谱方法，常规采用C18色谱柱，流动性用到正乙腈/水，常规洗脱液会出现严重拖尾，且峰对称度差。
发明内容
本发明提供了一种Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法，主要解决现有液相色谱方法存在的峰型拖尾以及目标峰与相邻杂质峰分离度等技术问题。
本发明采用了以下技术方案：带Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法，包括以下步骤：
步骤一，准备测量的试剂：甲醇-色谱纯，乙腈-色谱纯，超纯水，:化学纯三氟乙酸。
步骤二：样品溶液的配制：称取试样置于容量瓶中，加入乙腈，室温条件下采用超声波溶解，再用水定容，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析。
步骤三，进行高效液相色谱测定;色谱测定的的过程为：色谱条件为样品室温度为40℃，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱采用Agilent poroshell 120 EC-C18，柱温：40 ℃，流速：1.0 mL/min，流动相A为摩尔浓度0.1%TFA水溶液；流动相B相为质量百分浓度100%甲醇溶液，采用梯度洗脱程序。
所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为安捷伦 1260色谱仪，该色谱仪采用DAD二极管列阵检测器。色谱柱尺寸为4.6mm ×150mm, 4.0μm。所述的梯度洗脱程序为：0～30min，V(B)为35%到80%， 30～30.1 min，V(B)从80% 到35% 的初始比例，30.1～40 min，V(B)从35% 平衡系统。
本发明具有以下有益效果：本发明方法操作简便、快速、准确，稳定性好，更主要是主峰峰型对称，与相邻未知杂质分离度好等；本发明采用了高效液相色谱仪的自动进样器的精准定量，利用DAD二极管列阵检测器的灵敏度可以对带Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸有很好的响应值，解决了峰拖尾以及相邻杂质峰分离度现象。达到了低浓度，高响应、基线级分离的技术效果。
附图说明
图1 用安捷伦1260型DAD 检测器检测的产品图谱。
具体实施方式
主要仪器：
安捷伦1260型高效液相色谱仪，配有DAD二极管列阵检测器，美国Agilentporoshell 120 EC-C18(4.6mm ×150mm, 4.0μm)；超声波提取仪(KQ5200E，郑州科泰实验设备有限公司)，0.22 μm聚丙烯有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司），电子分析天平（CPA225D，赛多利斯科学仪器（上海）有限公司）。
主要试剂：
测量的试剂包括甲醇-色谱纯，乙腈-色谱纯，化学试剂-三氟乙酸，电阻率为18.2MΩ.cm的超纯水；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），三氟乙酸(化学纯，上海国药公司)；超纯水( 电阻率18.2 MΩ.cm，美国 屈层氏)。
样品的前处理：称取带Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸试样置于10ml容量瓶中，加入5ml乙腈，室温条件下采用超声波溶解，再加超纯水定容 ，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行手性检测；。
色谱条件：
样品室温度为室温，自动进样器进样体积为10 µL，Agilent poroshell 120 EC-C18，柱温：40 ℃，流速：1.0 mL/min，流动相A为摩尔浓度0.1%TFA水溶液；流动相B相为质量百分浓度100%甲醇溶液，采用梯度洗脱程序。所述的梯度洗脱程序为：0～30min，V(B)为35%到80%， 30～30.1 min，V(B)从80% 到35% 的初始比例，30.1～40 min，V(B)从35% 平衡系统。
样品前处理方法的选择与优化：
目前在市场上带Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸为粉末状固体，本发明所测定的样品是吉尔生化（上海）有限公司生产的产品。
色谱条件的优化：
本发明在选择时分别对摩尔浓度0.1%TFA水溶液-质量百分浓度100%甲醇、质量百分浓度0.025%甲酸水溶液-质量百分浓度0.025%甲酸乙腈作为流动相时的分离效果进行了比较。采用质量百分浓度0.025%甲酸水溶液-质量百分浓度0.025%甲酸乙腈体系时发现，色谱峰形不对称，容易拖尾；采用摩尔浓度0.1%TFA水溶液-质量百分浓度100%甲醇作为淋洗液体系时带Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸的峰型对称度达到标准，无论是分离度、灵敏度还是目标化合物的峰型都优于其他淋洗体系。故本实验采用摩尔浓度0.1%TFA水溶液-质量百分浓度100%甲醇作为淋洗液，梯度淋洗进行色谱分离。
本发明的样品室温度设定为室温，有利于样品室中甲醇溶剂的保存，本发明中设定柱温箱温度为40℃。
实际样品的测定：产品的HPLC谱图如图1所示，采用本方法对带Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸产品进行化学纯度检测结果表明，本方法快速、准确、灵敏度高、主峰峰型对称，与相邻杂质峰基线级分离，稳定性好，具有实际应用价值。
Claims (4)
1.Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法；其特征是：包括以下步骤：
步骤一，准备测量的试剂：乙腈-色谱纯，甲醇-色谱纯，超纯水，化学试剂-三氟乙酸；
步骤二、样品溶液的配制：称取试样置于容量瓶中，加入乙腈，室温条件下采用超声波溶解，再加超纯水定容 ，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行手性检测；
步骤三，进行高效液相色谱测定：色谱测定的过程为：色谱条件为样品室温度为常温，自动进样器，色谱柱为：色谱柱采用Agilent poroshell 120 EC-C18，柱温：40 ℃，流速：1.0 mL/min，流动相A为摩尔浓度0.1%TFA水溶液；流动相B相为质量百分浓度100%甲醇溶液，采用梯度洗脱程序。
2.根据权利要求1所述的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法，其特征是：所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为Agilent 1260 液相色谱仪，该仪器采用DAD二极管阵列检测器。
3. 根据权利要求1所述的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法，其特征是：所述色谱柱尺寸为4.6mm ×150mm, 4.0μm。
4. 根据权利要求1所述的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸纯度检测方法，其特征是：所述的梯度洗脱程序为：0～30min，V(B)为35%到80%， 30～30.1 min，V(B)从80% 到35% 的初始比例，30.1～40 min，V(B)从35% 平衡系统。
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